专利名称：Cox-1基因snp检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种C0X-1基因SNP检测液相芯片以及特异性引物。
背景技术：
环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸转化成类花生酸类物质途径中重要的限速酶，如前列腺素的合成(ftOstaglandinsPk)。环氧合酶存在两种同工酶，即为 C0X-1和C0X-2，C0X-1 (Cyclooxygenase 1)属于管家酶，又名前列腺素内过氧化物G/H合成酶(prostaglandin endoperoxide G/H synthase，PTGS1)，在机体的各组织中均有表达， 它产生的前列腺素参与机体正常的生理过程和保护功能，在大多数正常细胞中都呈稳定表达。一般情况下活性稳定，在应激状态下或受某些激素、生长因子刺激时，其活性可轻度增加2倍 4倍。C0X-1蛋白由576个氨基酸组成，其编码基因位于染色体9，大小约221Λ，含有 11个外显子。有研究表明，携带不平衡完全连锁的C50T和A842G单核苷酸突变的患者，阿司匹林在前列腺素H2合成过程中比正常的基因型起着更大的抑制作用。此外，C0X-1的G123A 位点多态性与阿司匹林抵抗(Aspirin Resistance, AR)相关。其中，C50T(rs3842787)位于 C0X-1 的 exon2 上，A842G(rsl0306114)发生在 C0X-1 的启动子区域，G123A(rs3842788) 发生在C0X-1的exon3上。目前对C0X-1多态性检测的产品一般基于PCR技术的荧光定量PCR法、RFLP法和 DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种C0X-1基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用于检测C0X-1基因三种常见基因型C50T、A842G和G123A的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种C0X-1基因SNP检测液相芯片，主要包括有(A)针对C0X-1基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每种 ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是针对C50T SNP位点的SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8、针对A842G SNP位点的SEQID N0. 9 和 SEQ ID N0. 10、和 / 或针对 G123A SNP 位点的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 6 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述 anti-tag序列选自SEQ ID N0. 13 SEQ ID N0. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C)用于扩增出具有C50T、A842G和/或G123A SNP位点的C0X-1基因目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为针对C50T SNP位点的SEQ ID NO. 19 SEQ ID NO. 20, 针对 A842GSNP 位点的 SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 22，和 / 或针对 G123A SNP 位点 SEQ ID NO. 23 SEQ IDN0. 24。更优选地，所述ASPE引物对为针对C50T SNP位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 7组成的序列以及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 8组成的序列、针对A842G SNP位点的由SEQ IDN0. 3和SEQ ID N0. 9组成的序列以及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列、和/或针对G123A SNP位点的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID NO. 11组成的序列以及由SEQ ID N0. 6和SEQ IDN0. 12组成的序列。本发明还提供了用于C0X-1基因SNP检测的特异性引物，包括有针对C50T SNP 位点的野生型和突变型的SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8、针对A842G SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 10、和/或针对G123A SNP位点的野生型和突变型的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 12。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的液相芯片与测序法的检测结果吻合率高达100%。所制备的C0X-1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及 anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及 tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。3.本发明的检测方法步骤简单，三种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成三个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1 C0X-1基因SNP检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对C0X-1 基因的三种常见 SNP 位点 C50T(rs3842787)、A842G(rsl0306114)和 G123A(rs3842788)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列” 组成。ASPE引物序列如下表所示表1 ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)基因基因型类型ASPE引物Tag序列特异性引物序列COX-IC50TC50T -W5'TCAATTACCTTTTCAATACAATAC (SEQ ID NO. 1)TTCCTGCTCCTGCTCCC 3' (SEQIDNO.7)C50T -m5 'CTTTTCAATTACTTCAAATCTTCA (SEQIDNO.2)TTCCTGCTCCTGCTCCT 3' (SEQ ID NO.8)A842GA842G -W5 ‘ AATC A ATCTTC ATTCAA ATCATC A (SEQIDNO.3)AGCA CCTACTACATGCTGGA 3' (SEQIDNO.9)A842G -m5'TCAATCAATTACTTACTCAAATAC (SEQIDNO.4)AGCA CCTACTACATGCTGGG 3' (SEQIDNO.IO)G123AQ123A-W5'TCATTTACCAATCTTTCTTTATAC (SEQ ID NO.5)GTTGTTACTATCCATGCCAG 3' (SEQIDNO.ll)G123A -m5' CTACTAATTCATTAACATTACTAC (SEQIDNO.6)GTTGTTACTATCCATGCCAA 3' (SEQ ID NO. 12)每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag 序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用lOmmol/LTris Bufferm 制成lOOpmol/mL的贮存液。二、anti-tag序列包被的微球根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的 anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的6种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
权利要求
1.一种C0X-1基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对C0X-1基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每种ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是针对 C50T SNP 位点的 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、针对 A842G SNP 位点的 SEQID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、和 / 或针对 G123A SNP 位点的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 6 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有C50T、A842G和/或G123ASNP位点的C0X-1基因目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的C0X-1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对C50T SNP位点的SEQ ID N0. 19 SEQ ID N0. 20，针对A842G SNP 位点的 SEQ ID N0. 21 SEQ ID N0. 22，和 / 或针对 G123A SNP 位点 SEQ ID N0. 23 SEQ IDN0. 24。
3.根据权利要求1所述的C0X-1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为针对C50T SNP位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 7组成的序列以及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 8组成的序列、针对A842G SNP位点的由SEQ ID N0. 3 和SEQID N0. 9组成的序列以及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列、和/或针对 G123A SNP位点的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID NO. 11组成的序列以及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 12组成的序列。
4.根据权利要求1-3所述的C0X-1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
5.用于C0X-1基因SNP检测的特异性引物，其特征是，包括有针对C50TSNP位点的野生型和突变型的SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8、针对A842G SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 10、和/或针对G123A SNP位点的野生型和突变型的SEQ IDN0. 11 和 SEQ ID N0. 12。
全文摘要
本发明公开了一种COX-1基因SNP检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成的ASPE引物对，所述特异性引物是针对C50T SNP位点的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对A842G SNP位点的SEQID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或针对G123A SNP位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；微球；扩增引物。所述检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，能够避免交叉反应，且可以实现多个SNP位点的并行检测。
文档编号C12Q1/68GK102277413SQ20101019684
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者余刚, 曾涛, 秦会娟, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司