专利名称：GPIIIa和COX-1基因SNP检测液相芯片以及特异性引物的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种COX-I 和GPnia基因SNP检测液相芯片以及特异性引物。
背景技术：
血小板膜糖蛋白(Glycoprotein Illa，GPIIIa)是主要的血小板整合素和激活剂，
它是一种跨膜的糖蛋白复合物。其作用是作为受体，介导纤维蛋白原结合于血小板表面 及随后的血小板聚集。GPIIIa包含人类血小板抗原1 (human platelet antigen, ΗΡΑ)或 ΡΙΑ,此基因存在与纤维蛋白原结合的多态性位点，美国一项病例对照研究观察到GPIIIa 基因的白氨酸-33被脯氨酸取代，即HPA-I的T196C突变(Leu33Pro，rs5918，即PLAl/
A2异型抗原系统)与急诊血栓形成之间有关联，其预告意义在高血压、吸烟、高胆固醇 血症或糖尿病等已知冠心病危险因子之上。环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸转化成类花生酸类物质途径中 重要的限速酶，如前列腺素的合成(Prostaglandins，PGs)。环氧合酶存在两种同工 酶，即为COX-I和COX-2，COX-I (Cyclooxygenase 1)属于管家酶，又名前列腺素内过 氧化物 G/H 合成酶(prostaglandin endoperoxide G/H synthase, PTGS1)，在机体的各组织
中均有表达，它产生的前列腺素参与机体正常的生理过程和保护功能，在大多数正常细 胞中都呈稳定表达。一般情况下活性稳定，在应激状态下或受某些激素、生长因子刺激 时，其活性可轻度增加2倍 4倍。COX-I蛋白由576个氨基酸组成，其编码基因位于 染色体9，大小约22kb，含有11个外显子。有研究表明，携带不平衡完全连锁的C50T和 A842G单核苷酸突变的患者，阿司匹林在前列腺素H2合成过程中比正常的基因型起着更 大的抑制作用。此外，COX-I的G123A位点多态性与阿司匹林抵抗(Aspirin Resistance， AR)相关。其中，C50T(rs3842787)位于 COX-I 的 exon2 上，A842G(rsl0306114)发生 在COX-I的启动子区域，G123A(rs3842788)发生在C0X-1的exon3上。目前对COX-I和GPIIIa多态性检测的产品一般基于PCR技术的荧光定量PCR 法、RFLP法和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时 由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种GPIIIa基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用 于检测GPIIIa基因常见基因型T196C的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种GPIIIa基因SNP检测液相芯片，主要包括有(A)针对GPnia基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对 每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成， 所述特异性引物是针对GPIIIa基因T196C SNP位点的SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.8 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag 序列选自SEQ ID NO. 17 SEQ ID N0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A) 中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出具有T196C SNP位点的GPIIIa基因目标序列的扩增引物。优选地，所述扩增引物为针对GPIIIa基因T196C SNP位点的SEQ ID N0.31 SEQ IDN0.32。更优选地，所述ASPE引物对为针对GPIIIa基因T196C SNP位点的由SEQ ID N0.7和SEQID N0.15组成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16组成的序列。本发明还提供了 GPIIIa基因SNP检测的特异性引物，包括有针对T196C SNP 位点的野生型和突变型的SEQ ID NO. 15和SEQ ID N0.16。本发明的另一目的，是提供一种COX-I和GPnia基因SNP检测液相芯片，该液 相芯片可以对COX-I和GPIIIa基因进行同步检测。具体技术方案如下一种GPIIIa和COX-I基因SNP检测液相芯片，主要包括有(A)针对COX-I基因和GPIIIa基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的 ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异 性引物组成，所述特异性引物是针对COX-I基因C50T SNP位点的SEQ ID N0.9和SEQ ID NO. 10,针对 COX-I 基因 A842GSNP 位点的 SEQIDN0.11*SEQIDN0.12、和 / 或针 对 COX-I 基因 G123A SNP 位点的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 ；以及针对GPIIIa 基因 T196C SNP 位点的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.8 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag 序列选自SEQ ID NO. 17 SEQ ID N0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A) 中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有C50T、A842G和/或G123A SNP位点的COX-1基因目标序 列的扩增引物；以及用于扩增具有T196C SNP位点的GPIIIa基因目标序列的扩增引物。优选地，所述扩增引物为针对COX-I基因C50T SNP位点的SEQ ID N0.25 SEQ ID N0.26，针对 COX-1 基因 A842G SNP 位点的 SEQ ID N0.27 SEQ ID N0.28， 和/或针对COX-I基因G123A SNP位点的SEQ ID N0.29 SEQ ID N0.30 ；以及针对 GPIIIa 基因 T196C SNP 位点的 SEQID N0.31 SEQ ID N0.32。进一步地，所述ASPE引物对为针对COX-1基因C50T SNP位点的由SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.9组成的序列以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO.IO组成的序列、 针对COX-I基因A842G SNP位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 11组成的序列以及由 SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 12组成的序列、禾口 /或针对COX-1基因G123A SNP位点的 由SEQ ID N0.5和SEQID N0.13组成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 14组成 的序列；以及针对GPIIIa基因T196C SNP位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID NO. 15组成 的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 16组成的序列。
优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间的间隔臂序列为5-10个T。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的COX-I 和GPIIIa基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及 anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及 tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检 测。2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别 的基因型。3.本发明的检测方法步骤简单，四种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成四 个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多 不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合 实际应用需要。5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺 陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目， 具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提 高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1 GPIIIa和COX-I基因SNP检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对COX-I 基因的三种常见 SNP 位点 C50T(rs3842787)、A842G(rsl0306114) 和G123A(rs3842788)、GPIIIa基因的SNP位点T196C (rs5918)，分别设计特异性引物序 列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表1 ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种GPIIIa基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对GPIIIa基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每 种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所 述特异性引物是针对GPIIIa基因T196C SNP位点的SEQ ID NO.15和SEQ ID N0.16 ； 所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.8 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序 列选自SEQ ID NO. 17 SEQ ID N0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中 所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出具有T196CSNP位点的GPIIIa基因目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的GPIIIa基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对GPIIIa基因T196C SNP位点的SEQ ID N0.31 SEQ ID N0.32。
3.根据权利要求1所述的GPIIIa基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为针对GPIIIa基因T196C SNP位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID NO. 15组成的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 16组成的序列。
4.根据权利要求1-3所述的GPIIIa基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂 序列为5-10个T。
5.用于GPIIIa基因SNP检测的特异性引物，其特征是，包括有针对T196CSNP位 点的野生型和突变型的SEQ ID NO. 15和SEQ ID N0.16。
6.一种GPIIIa和COX-I基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对COX-I基因和GPIIIa基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的 ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特 异性引物组成，所述特异性引物是针对COX-I基因C50T SNP位点的SEQ ID N0.9和 SEQ ID N0.10、针对 COX-I 基因 A842G SNP 位点的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0.12、 禾口 /或针对COX-I基因G123A SNP位点的SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14 ；以及针对 GPIIIa 基因 T196C SNP 位点的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID N0.16 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.8 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序 列选自SEQ ID NO. 17 SEQ ID N0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中 所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有C50T、A842G和/或G123ASNP位点的C0X-1基因目标序列的 扩增引物；以及用于扩增具有T196C SNP位点的GPIIIa基因目标序列的扩增引物。
7.根据权利要求6所述的GPIIIa和COX-I基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对COX-I基因C50T SNP位点的SEQ ID N0.25 SEQ ID N0.26，针对 COX-I 基因 A842G SNP 位点的 SEQ ID N0.27 SEQ ID N0.28，和 / 或针对 C0X-1 基因 G123ASNP位点的 SEQIDN0.29 SEQIDN0.30 ；以及针对GPIIIa基因 T196C SNP 位点的 SEQ IDN0.31 SEQ ID N0.32。
8.根据权利要求6所述的GPIIIa和COX-I基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为针对COX-I基因C50T SNP位点的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.9组成的序列以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 10组成的序列、针对COX-1基因 A842G SNP位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 11组成的序列以及由SEQ ID N0.4禾口 SEQ ID NO. 12组成的序列、禾口 /或针对COX-1基因G123A SNP位点的由SEQ ID N0.5 禾口 SEQ ID NO. 13组成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14组成的序列；以及针 对GPIIIa基因T196C SNP位点的由SEQ IDN0.7和SEQ ID NO. 15组成的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 16组成的序列。
9.根据权利要求6-8所述的GPIIIa和COX-I基因SNP检测液相芯片，其特征是，所 述间隔臂序列为5-10个T。
全文摘要
本发明公开了一种GPIIIa基因SNP检测液相芯片和特异性引物，其主要包括有针对GPIIIa基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与每种ASPE引物中所选的tag序列互补配对；用于扩增出含有T196C SNP位点的GPIIIa基因目标序列的扩增引物。本发明还提供了一种COX-1和GPIIIa基因SNP检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片除了具有GPIIIa基因的对应的组成外，还具有针对COX-1基因SNP位点的ASPE引物对、包被有特异的anti-tag序列的微球以及扩增引物。所述检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，能够避免交叉反应，且可以实现多个SNP位点的并行检测。
文档编号C12N15/11GK102010900SQ201010196858
公开日2011年4月13日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者余刚, 曾涛, 秦会娟, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司