专利名称：apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片以及特异性引物的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种apo E基 因和染色体9p21区段SNP位点检测液相芯片以及特异性引物。
背景技术：
载脂蛋白E(ApolipoproteinE，apoE)是血浆中重要的载脂蛋白之一。Apo E主
要在肝脏合成、分泌和代谢过程中参与脂质的运输、储存及排泄，有修复组织、抑制血 小板聚集、免疫调节等作用。人apo E的基因位于第19号染色体长臂13区2带(19ql32) 上，基因全长为3.7kb，含有4个外显子和3个内含子，其cDNA长为1.163kb。apo E蛋 白前体由317个氨基酸组成，含有18个氨基酸信号肽，成熟的Ap0 E蛋白由299个氨基 酸组成。Ap0 E基因有三个等位基因，S卩ε2、ε 3和ε 4，共构成6种不同的基因型3 种纯合型(ε 2/ ε 2、ε 3/ ε 3、ε 4/ ε 4)禾口三种杂合型(ε 3/ ε 4、ε 2/ ε 3、ε 2/ ε 4) 0 其基因发生频率因不同的种族和地区存在差异，在一般人群中，^2约占8%， ε 3约占 78%, ε 4占14%。由于编码apo E肽链上第112位和158位氨基酸相对应核苷酸的多 态性差异，三种不同的等位基因转录、翻译成三种不同的蛋白异构体，即apo E ε 3肽链 的第112和158位上的氨基酸分别为半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)，而apo E ε 2是在 第158位上的Arg被Cys取代，apo E ε 4则在第112位上的Cys被Arg所取代。研究发 现，不同基因型人群的心血管疾病风险依ε 2 < ε 3 < ε 4次序增大，ε 2/ ε 2的携带者 倾向于发生III型的高血脂，ε 4等位基因与血浆中胆固醇水平的上升以及由此引致的冠 心病风险的提高相关，apo E基因型在预测心脏病相关的环境因素、斯他汀治疗、饮食治 疗等对患者的治疗效果中起着重要作用。WTCCC于2007年对1926例患有冠心病/心肌梗塞或有严重家族史者和 2938名对照受试者的全基因组关联研究结果显示与冠心病相关性最大的多态性位点 rsl333049(G > C)位于9p21区域(P = 1.80X10-14)。该研究结果于2008年经在东亚 人群中得到验证。2009于中国人群中得到证实。PROVEIT-TIMI 22研究同样证实 rsl333049C等位基因携带者应用他汀强化治疗较他汀常规治疗获益更多。同时，与冠 心病相关的多态性位点还有 A22086055G (rsl0757274)、A22114477G (rsl0757278)、 A22105026G(rs2383206)、A22105959G (rs2383207)和 A22088619G(rs2891168)，此 5 个 位点均与rsl333049(G22115503C)完全连锁。目前国内外关于心血管疾病风险的检测日渐增多，已有检测apo E基因多态性的 产品上市，如Celera公司、上海主健生物工程有限公司的检测产品，目前的产品一般基 于PCR技术的荧光定量PCR法、RFLP法和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污 染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。而染 色体9p21区段SNP位点，目前国内外几乎没有相关的检测产品。
发明内容
本发明的目的之一是提供apo E基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用于检测 检测apoE基因两种常见基因型C609T(rs7412)和T471C (rs429358)的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种apo E基因SNP检测液相芯片，主要包括有(A)分别针对apo E基因的SNP位点设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每 条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特异性 引物是针对 C609T SNP 的 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO.18、禾口 / 或针对 T471C SNP 的 SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID N0.20 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID NO. 16 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag 序列选自SEQID N0.33 SEQ ID N0.48中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A) 中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有C609T和/或T471C SNP位点的apo E基因目标序列的扩增 引物。优选地，所述扩增引物为SEQ ID N0.49 SEQ ID N0.50。优选地，所述ASPE引物对为针对apo E基因C609T SNP的由SEQ ID N0.1和 SEQ IDN0.17组成的序列、由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 18组成的序列，和/或针对apo E 基因 T471C 的由 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.19 组成的序列、由 SEQ ID N0.4 和 SEQ
ID N0.20组成的序列。本发明的另一目的是提供对apo E和染色体9p21区段SNP同步检测的 液相芯片。该液相芯片可用于检测3 0￡基因两种常见基因型€6091(1"37412)和 T471C(rs429358)的野生型和突变型、以及染色体区段9p21的G22115503C (rsl333049)、 A22086055G (rsl0757274)、A22114477G (rsl0757278)、A22105026G (rs2383206)、 A22105959G(rs2383207)和 A22088619G(rs2891168)突变的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种apo E基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，主要包括有(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条 ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述 tag 序列选自 SEQID N0.1 SEQ ID NO. 16 ；所述特异性引物是针对apo E基因C609TSNP的SEQ ID NO. 17和SEQ ID N0.18、禾Π/或针对apoE基因T471C的SEQIDN0.19和SEQIDN0.20;以及针对染色体9p21 区段 G22115503C SNP 的 SEQ ID N0.21 和 SEQ ID N0.22、 A22086055G SNP 的 SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24、A22114477G SNP 的 SEQ ID N0.25 和 SEQ ID N0.26、A22105026G SNP 的 SEQ ID N0.27 和 SEQ ID N0.28、A22105959G SNP 的 SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.30、禾口 / 或 A22088619G SNP 的 SEQ ID N0.31 和 SEQ ID N0.32 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag 序列选自SEQID N0.33 SEQ ID N0.48中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A) 中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增具有apoE基因的C609T和T471C SNP、以及染色体区段9p21 的 G22115503C、A22086055G、A22114477G、A22105026G、A22105959G 和 / 或 A22088619G的目标序列的扩增引物。 优选地，所述扩增引物为针对apo E基因的SEQ ID N0.49和SEQ ID N0.50 ； 以及针对染色体区段 9p21 的 SEQ ID N0.51 和 SEQ ID N0.52、SEQ ID N0.53 和 SEQ ID N0.54、SEQIDN0.55 和 SEQIDN0.56、SEQ ID N0.57 和 SEQ ID N0.58、SEQ ID N0.59 和 SEQ ID N0.60、禾口 / 或 SEQ ID N0.61 和 SEQ ID N0.62。进一步地，所述ASPE引物对为以及针对apo E基因C609T SNP的由SEQ ID N0.1和SEQIDN0.17组成的序列、由SEQ IDN0.2和SEQ IDN0.18组成的序列，禾Π /或 针对apo E基因T471C SNP的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 19组成的序列、由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.20组成的序列；以及针对染色体9p21区段的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.21组成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.22组成的序列、由SEQ ID N0.7 和SEQ ID N0.23组成的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.24组成的序列、由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.25组成的序列以及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0.26组成的序列、 由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0.27 组成的序列以及由 SEQ ID NO. 12 和 SEQ ID N0.28 组 成的序列、由SEQ ID NO. 13和SEQ ID N0.29组成的序列以及由SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.30组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 15和SEQ ID N0.31组成的序列以及由SEQ ID NO. 16和SEQ IDN0.32组成的序列。优选地，上述所有液相芯片中所述间隔臂序列为5-10个T。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的液相芯片与测序法的检测结果吻合率高达100%。所制备的 apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片具有非常好的信号_噪声比，并且所设 计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列 的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位 点的并行检测。2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别 的基因型。3应用本发明所述液相芯片的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术， 特别符合实际应用需要。4本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有 很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高， 信噪比增强，检测结果更加准确可靠。5.本发明所述液相芯片的检测方法步骤简单，且八种SNPs检测可通过一步多重 PCR即可完成八个含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过 程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定 量分析特征。
具体实施例方式实施例1 apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对apo E 两种常见 SNP 位点 C609T( ε 2，rs7412)禾口 T471C( ε 4，rs429358) 以及染色体 9ρ21 区段的 SNP 位点 G22115503C(rsl333049)、A22086055G (rsl0757274)、 A22114477G(rsl0757278)、A22105026G (rs2383206)、A22105959G (rs2383207)和 A22088619G(rs2891168),分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性 引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表1 ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
ASPE引物基因基因型类型Tag序列特异性引物序列
权利要求
1.一种apo E基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)分别针对apoE基因的SNP位点设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条 ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物 是针对 C609TSNP 的 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID N0.18、禾口 / 或针对 T471C SNP 的 SEQ ID NO. 19 和 SEQ IDN0.20 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID NO. 16 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序 列选自SEQID N0.33 SEQ ID N0.48中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中 所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有C609T和/或T471CSNP位点的apo E基因目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的apoE基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为 SEQ IDN0.49 SEQ ID N0.50。
3.根据权利要求1所述的apoE基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物 对为针对apoE基因C609T SNP位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID NO. 17组成的序列、及 由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.18组成的序列；禾口 /或针对apo E基因T471C SNP位点的 由SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.19组成的序列、及由SEQ IDN0.4和SEQ IDN0.20组成的 序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的apoE基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间 隔臂为5-10个T。
5.—种apo E基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条 ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述 tag 序列选自 SEQID N0.1 SEQ ID NO. 16 ；所述特异性引物是针对apo E基因C609T SNP位点的SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18、禾Π/或针对apoE基因T471CSNP位点的SEQIDN0.19和SEQIDN0.20;以及针对染色体 9p21 区段 G22115503C SNP 的 SEQ ID N0.21 禾Π SEQ ID Ν0.22、 A22086055G SNP 的 SEQ ID Ν0.23 和 SEQ ID Ν0.24、A22114477G SNP 的 SEQ ID Ν0.25 和 SEQ ID Ν0.26、A22105026G SNP 的 SEQ ID Ν0.27 和 SEQ ID Ν0.28、A22105959G SNP 的 SEQ ID Ν0.29 和 SEQ ID Ν0.30、禾口 / 或 A22088619G SNP 的 SEQ ID Ν0.31 和 SEQ ID Ν0.32 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序 列选自SEQID N0.33 SEQ ID N0.48中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中 所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有apoE基因的C609T和T471C SNP >以及染色体区段9p21 的 G22115503C、A22086055G、A22114477G、A22105026G、A22105959G 和 / 或 A22088619G的目标序列的扩增引物。
6.根据权利要求5所述的apoE基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，其特 征是，所述扩增引物为针对apo E基因的SEQ ID N0.49和SEQ ID N0.50 ；以及针对 染色体区段 9p21 的 SEQ ID N0.51 和 SEQ ID N0.52、SEQ ID N0.53 和 SEQ ID N0.54、SEQIDN0.55*SEQIDN0.56、SEQ ID N0.57 和 SEQ ID N0.58、SEQ ID N0.59 和 SEQ ID N0.60、禾口 / 或 SEQ ID N0.61 和 SEQ ID N0.62。
7.根据权利要求5所述的apoE基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，其特 征是，所述ASPE引物对为针对apo E基因C609T SNP位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID NO.17组成的序列、由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 18组成的序列，和/或针对apo E 基因T471C SNP位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 19组成的序列、由SEQ ID N0.4禾口 SEQ ID N0.20组成的序列；以及针对染色体9p21区段的由SEQ ID N0.5禾Π SEQ ID Ν0.21 组成的序列以及由SEQ IDN0.6和SEQ ID Ν0.22组成的序列、由SEQ ID Ν0.7和SEQ ID Ν0.23组成的序列以及由SEQ IDN0.8和SEQ ID Ν0.24组成的序列、由SEQ ID Ν0.9禾口 SEQ ID Ν0.25组成的序列以及由SEQ IDN0.10和SEQ ID Ν0.26组成的序列、由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0.27组成的序列以及由SEQID NO. 12和SEQ ID N0.28组成的序列、 由 SEQ ID N0.13 和 SEQ ID N0.29 组成的序列以及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ ID N0.30 组 成的序列、禾口 /或由SEQ ID NO. 15和SEQ ID N0.31组成的序列以及由SEQ IDN0.16禾口 SEQ IDN0.32组成的序列。
8.根据权利要求5-7任一项所述的apoE基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯 片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
9.一种用于apoE基因SNP检测的特异性引物，其特征是其碱基序列为针对 C609T SNP 的 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID N0.18、禾口 / 或针对 T471C SNP 的 SEQ ID N0.19 禾口 SEQ ID N0.20。
全文摘要
本发明公开了一种apo E基因SNP检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有ASPE引物对，所述特异性引物是针对C609T SNP位点的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、和/或针对T471C SNP位点的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQID NO.16；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.48中的序列；扩增引物。本发明还公开了一种apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片。本发明所提供的液相芯片与测序法的检测结果吻合率高达100％。所制备的apo E和染色体9p21区段SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比。
文档编号C12N15/11GK102010901SQ20101019686
公开日2011年4月13日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者余刚, 曾涛, 秦会娟, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司