专利名称：基于组织工程材料的黑素细胞的培养方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学领域，尤其涉及一种基于组织工程材料的黑素细胞培养方法及 其应用。
背景技术：
白癜风是一种获得性皮肤色素脱失性疾病，表现为局部或泛发性色素脱失，以形 成白斑为特征，组织学及免疫细胞化学显示其皮损表皮黑素细胞消失。白癜风往往给患者 带来沉重的心理负担，影响工作、学习等正常生活，容易发展成为心理疾病。传统的治疗手段包括内服药物、紫外线照射以及外科手术治疗等。但药物治疗和 紫外线照射的治愈率有限。外科手术治疗方法主要包括自体表皮移植、黑素细胞悬液移植 等，这些治疗方法证实是有效的，但表皮移植需大面积取皮，而细胞悬液移植中细胞悬液易 流失，影响疗效，且不适合大面积移植。利用组织工程技术、通过细胞负载与转移，为治疗白癜风提供新的途径。现有公 开的专利与研究报道以组织工程皮肤和人工皮肤替代物为主。CN1786155A公开了选择壳 聚糖_胶原复合物的膜材料或多孔支架作为负载材料，将表皮细胞和黑素细胞接种在膜表 面或支架上，构建带色素的组织工程表皮替代物，但该组织工程表皮在后期的转移、移植 过程中易破损。CN 1493367 与 CellBiology International 2007,31(9) :985_990 报道 了选择胶原作为材料，负载角质形成细胞、成纤维细胞和黑素细胞构建含有色素的人工皮 肤，并在裸鼠身上得到表达，但该人工皮肤在制备过程中会发生收缩，影响其后续使用。CN 101605566A公开了在聚乳酸薄膜上培养增殖性黑素细胞，但聚乳酸薄膜制备需使用溶剂浇 铸法，为细胞培养及生物安全方面留下隐患。此外，Sung-Jan Lin等(Biomaterials2005， 26(12) 1413-1422)报道利用壳聚糖作为负载接种黑素细胞，发现黑素细胞在膜上有成团 现象，影响细胞活性，同时，所制备的壳聚糖载体不能满足转移和移植的要求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于组织工程材料的黑素细胞 的培养方法及其应用。本发明利用组织工程技术实现黑素细胞或其与成纤维细胞和角质形 成细胞的体外培养、负载及移植。通过将细胞_载体复合材料移植到脱色皮肤创口处，使黑 素细胞或其与成纤维细胞和角质形成细胞由载体材料迁移到皮肤创口处，为脱色处皮肤提 供黑素细胞，从而实现色素脱失症(如白癜风)和皮肤颜色的调节。本发明涉及具有生物 相容性载体材料的制备、细胞-载体复合材料的构建及其应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种基于组织工程材料的黑素细胞 的培养方法，包括以下步骤(1)制备生物相容性载体材料将一种或两种生物相容性材料按1 50-50 1的 重量比例配成水溶液，所述生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质 酸、硫酸软骨素等，将水溶液注入细胞培养板，鼓风条件下于30-120°C下烘2-48小时，在细 胞培养板上形成一层载体膜材料。然后用交联剂对载体膜材料在20-50°C交联处理0. 5-24小时，所述的交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联 的戊二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂，再在鼓 风条件下于30-120°C下烘2-48小时。(2)构建细胞-载体复合材料载体材料用于接种细胞前，用医用消毒酒精浸泡12 小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细 胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37°C、5% C02、饱和湿度条件进行孵化。 将黑素细胞或按1-40 0-200 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和 角质形成细胞以黑素细胞为5X 103-5X 105个细胞/cm2的密度接种在孵化过的载体膜材料 上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、5% C02、饱和湿度条件下培 养，每两天更换一次培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-载体的复合材料。所述细胞培养液含100毫升F12培养基、0. 1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、 10-50000 微克 IBMX、0. 1-100 毫升 Glutamine 和 100-500000 微克 Gentamicin 等成分。动物实验选取约四周龄大小裸鼠，用戊巴比妥钠进行腹腔麻醉。在裸鼠背部侧面制造约 1. 5cm2的皮肤创口，刮至创面出现点状出血。将细胞_载体复合材料的细胞面贴敷于创口 处，随后对裸鼠进行常规包扎，用手术线缝合边缘。移植后的裸鼠在无菌环境中单笼饲养， 水和食物充足供给。1周后观察裸鼠移植部位。拆除外包扎敷料，麻醉状态下使用激光共聚 焦显微镜(皮肤CT)对裸鼠移植部位进行观察，可见成团黑素细胞存在；活检取材进行免疫 组化检测，移植部位存在人黑素细胞。可以确定组织工程材料上搭载的黑素细胞可以迁移 到裸鼠创面部位。本发明的有益效果是通过对所得的生物相容性载体膜材料进行表征，膜表面平 整，具有致密的微孔结构，适合细胞生长。载体材料的吸水率为50% -400%，同时具有良好 的机械性能，包括抗拉强度、抗撕强度、断裂伸长率和弹性模量等，在制备、负载、转移和移 植过程不发生破碎和断裂，符合转移和移植的要求。细胞-载体复合材料的构建过程中，细 胞在生物相容性载体膜材料上的形态良好，在负载膜材料表面以单层或多层的形式存在， 其中单层形式为主。细胞在负载膜材料的表面增殖趋势明显(图1)且保持良好活性(图 2-4)。移植过程中，细胞可成功地迁移到皮肤创口处(图5，6)，实现黑素细胞的转移。本发 明中生物相容性载体材料制备方法简单、操作容易、抗破损、撕裂和转移等性能优良，通过 调节细胞的接种密度、培养时间和方法，保持细胞活性，同时满足不同个体对皮肤颜色的需 求，适合色素脱失症和皮肤颜色的调节。
图1是分别培养在壳聚糖基负载膜材料和细胞培养板的黑素细胞增值曲线。图2是培养在壳聚糖基负载膜材料上的黑素细胞的形态照片。图3是培养在壳聚糖基负载膜材料上的黑素细胞的S-100染色照片。图4是培养在壳聚糖基负载膜材料上的黑素细胞的透射照片。图5是移植后裸鼠移植部位皮片的免疫组化照片。图6是移植后裸鼠移植部位皮肤CT照片。
具体实施例方式本发明属生物医学领域，利用组织工程技术构建具有良好生物相容性载体材料， 用于黑素细胞或其与成纤维细胞、角质形成细胞的(共)培养，实现细胞的体外培养及移 植。具体涉及具有生物相容性载体材料的制备、细胞-载体复合材料的构建及其应用，满足 色素脱失症(如白癜风)和皮肤颜色调节的要求。本发明选用生物相容性良好的材料，负载材料制备条件温和，易于细胞的负载与 增值培养，生物安全。同时，本发明可在细胞培养板上直接构建载体材料，避免对载体材料 再打孔、剪裁等繁琐的后处理及二次污染问题。经交联处理的载体材料，具有优越的机械性 能，满足可直接从细胞培养板中取出用于细胞转移和移植的要求。此外，本发明通过调节细 胞的接种密度、培养时间和培养方法，保持细胞活性，实现对不同个体皮肤颜色的调控，使 黑素细胞的功效性在移植中得到成功的表达，具有实际的可操作性，为大面积色素脱失症 和皮肤颜色的调节提供了极大的便利。本发明的基于组织工程材料的细胞培养方法，包括以下步骤1.制备生物相容性载体材料将一种或两种生物相容性材料按1 50-50 1的重量比例配成水溶液，所述材 料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素等，将上述溶液注入细胞 培养板，鼓风条件下于30-120°C下烘2-48小时，在细胞培养板上形成一层载体膜材料。然 后用交联剂对载体膜材料在20-50°C交联处理0. 5-24小时，所述的交联剂包括用于物理 交联的硫酸钠、柠檬酸钠、三聚磷酸钠等及用于化学交联的戊二醛、乙二醛、水杨醛、香草 醛等，交联处理后用大量纯净水冲洗除净残留的交联剂，再在鼓风条件下于30-120°C下烘
2-48小时。2.构建细胞-载体复合材料载体材料用于接种细胞前，用医用消毒酒精浸泡12小时，随后再用 PBS (Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射
3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37°C、 5% (体积)C02、饱和湿度条件进行孵化。将黑素细胞或按1-40 0-200 0_100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤 维细胞和角质形成细胞以黑素细胞为5X 103-5X 105个细胞/cm2的密度接种在孵化过的载 体膜材料上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积)C02、 饱和湿度条件下培养，每两天更换一次培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-载体的复 合材料。细胞培养液含100毫升F12培养基、0. 1-100毫升FBS (胎牛血清)、10-50000纳克 CT (霍乱毒素)、10-50000微克IBMX (异丁酰甲基黄嘌呤)、0. 1-100毫升Glutamine (谷氨 酰胺)和100-500000微克Gentamicin (庆大霉素)等成分。下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。实施例1.壳聚糖基载体膜材料的制备a)将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解，配成浓度为1. 5%的壳聚糖溶液；b)将2. 5ml壳聚糖溶液注入细胞培养板，将细胞培养板置于鼓风烘箱中，于50°C 下干燥6小时；
c)将干燥的壳聚糖膜置于0. 5M的Na2S04溶液中浸泡30min，随后用大量纯净水冲 洗；d)用0. 1M的NaOH溶液浸泡壳聚糖膜30min以除去膜上残留的乙酸，再用大量纯 净水冲至PH = 7. 2-7. 4 ；e)将覆盖壳聚糖膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，37°C条件下干燥24小时；f)得到可用于细胞培养和转移的载体膜材料。实施例2.壳聚糖_透明质酸基复合载体膜材料的制备a)将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解，配成浓度为1. 5%的壳聚糖溶液；b)将透明质酸用纯净水溶解，配成浓度为1 %的透明质酸溶液；c)将壳聚糖与透明质酸以20 1的重量比例混合，搅拌均勻，得到壳聚糖-透明 质酸混合溶液；d)将2. 5ml混合溶液注入细胞培养板，将细胞培养板置于鼓风烘箱中，于50°C条 件下干燥6小时；e)将干燥的壳聚糖-透明质酸膜置于0. 5M的Na2S04溶液中浸泡30min，随后用大 量纯净水冲洗；f)用0. 1M的NaOH溶液浸泡壳聚糖-透明质酸膜30min以除去膜上残留的乙酸， 再用大量纯净水冲至PH = 7. 2-7. 4 ；g)将覆盖壳聚糖-透明质酸膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，37°C条件下干燥24 小时；h)得到可用于细胞培养和转移的载体膜材料。实施例3.壳聚糖_明胶基复合载体膜材料的制备a)将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解，配成浓度为1. 5%的壳聚糖溶液；b)将明胶用1M的乙酸溶液溶解，配成浓度为1 %的明胶溶液；c)将壳聚糖与明胶以10 1的重量比例混合，搅拌均勻，得到壳聚糖_明胶混合 溶液；d)将2. 5ml混合溶液注入细胞培养板，将细胞培养板置于鼓风烘箱中，于50°C下 干燥6小时；e)将干燥的壳聚糖_明胶膜置于0. 5M的Na2S04溶液中浸泡30min，随后用大量纯 净水冲洗；f)用0. 1M的NaOH溶液浸泡壳聚糖-明胶膜30min以除去膜上残留的乙酸，再用 大量纯净水冲至PH = 7. 2-7. 4 ；g)将覆盖壳聚糖-明胶膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，37°C干燥24小时；h)得到可用于细胞培养和转移的载体膜材料。实施例4.黑素细胞-壳聚糖复合材料的构建a)将实例1所述的壳聚糖膜置于75%的医用消毒酒精中浸泡12小时后用PBS冲 洗干净；b)将覆盖壳聚糖膜的细胞培养板置于紫外灯下照射12小时；c)在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积) C02、饱和湿度下孵化4小时；
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d)将黑素细胞以5X 103-5X 105个细胞/cm2的密度接种在壳聚糖膜上，置于细胞 培养箱于37°C、5% (体积)C02、饱和湿度下培养；e)每两天换一次细胞培养液，培养时间为1-10天；f)得到黑素细胞_壳聚糖复合材料，可进一步用于的移植。实施例5.黑素细胞_壳聚糖_透明质酸复合材料的构建a)将实例2所述的壳聚糖_透明质酸复合膜置于75%的医用消毒酒精中浸泡12 小时后用PBS冲洗干净；b)将覆盖壳聚糖_透明质酸复合膜的细胞培养板置于紫外灯下照射12小时；c)在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积) C02、饱和湿度下孵化4小时；d)将黑素细胞以5 X 103-5 X 105个细胞/cm2的密度接种在壳聚糖_透明质酸复合 膜上，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积)C02、饱和湿度下培养；e)每两天换一次细胞培养液，培养时间为1-10天；f)得到黑素细胞-壳聚糖-透明质酸复合材料，可进一步用于的移植。实施例6.黑素细胞_壳聚糖_明胶复合材料的构建a)将实例3所述的壳聚糖_明胶复合膜置于75%的医用消毒酒精中浸泡12小时 后用PBS冲洗干净；b)将覆盖壳聚糖_明胶复合膜的细胞培养板置于紫外灯下照射12小时；c)在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积) C02、饱和湿度下孵化4小时；d)将黑素细胞以5X 103-5X 105个细胞/cm2的密度接种在壳聚糖-明胶复合膜 上，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积)C02、饱和湿度下培养；e)每两天换一次细胞培养液，培养时间为1-10天；f)得到黑素细胞_壳聚糖_明胶复合材料，可进一步用于的移植。实施例7.移植a)选取约四周龄的裸鼠进行动物移植实验；b)根据裸鼠体重，按照0. 025ml/g的剂量，用0. 3%戊巴比妥钠对裸鼠进行腹腔麻 醉；c)使用手术刀在裸鼠背部侧面以刮削方式制造皮肤创口，面积约1. 5cm2，刮至创 面出现点状出血；d)将4cm2实例4所述的黑素细胞-壳聚糖复合材料的细胞面贴敷于备皮区域；e)对移植后裸鼠进行常规包扎，并用手术线在包扎物边缘断点缝合。f)移植后裸鼠于无菌环境中单笼饲养，水和食物充足供给。实施例8.观察移植后人黑素细胞在裸鼠体表定植情况a) 1周后拆除裸鼠外包扎敷料；b)酒精吸入麻醉法麻醉裸鼠，使用激光共聚焦显微镜对裸鼠移植部位进行观察， 可见成团黑素细胞；c)在移植部位活检取材，一抗使用鼠抗人S-100单克隆抗体，常规免疫组化标记， 结果为阳性，说明裸鼠移植部位组织切片中有人黑素细胞存在；
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根据激光共聚焦显微镜和免疫组化检测结果可以确定，组织工程材料上搭载的人 黑素细胞可以迁移至动物创面部位。
权利要求
一种基于组织工程材料的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤(1)制备生物相容性载体材料将一种或两种生物相容性材料按1∶50-50∶1的重量比例配成水溶液，所述生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素等，将水溶液注入细胞培养板，鼓风条件下于30-120℃下烘2-48小时，在细胞培养板上形成一层载体膜材料。然后用交联剂对载体膜材料在20-50℃交联处理0.5-24小时，所述的交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联的戊二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂，再在鼓风条件下于30-120℃下烘2-48小时。(2)构建细胞-载体复合材料载体材料用于接种细胞前，用医用消毒酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37℃、5％CO2、饱和湿度条件进行孵化。将黑素细胞或按1-40∶0-200∶0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以黑素细胞为5×103-5×105个细胞/cm2的密度接种在孵化过的载体膜材料上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-载体的复合材料。
2.根据权利要求1所述基于组织工程材料的黑素细胞培养方法，其特征在于，所述细 胞培养液含100毫升F12培养基、0. 1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、10-50000微克IBMX、 0. 1-100 毫升 Glutamine 和 100-500000 微克 Gentamicin 等成分。
3.—种权利要求1所述基于组织工程材料的黑素细胞在治疗白癜风方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基于组织工程材料的黑素细胞的培养方法及其应用，本发明利用组织工程技术构建具有良好生物相容性载体材料，进行黑素细胞或其与成纤维细胞、角质形成细胞的(共)培养和转移，可用于色素脱失症(如白癜风)和皮肤颜色的调节。本发明涉及具有生物相容性载体材料的制备、细胞-载体复合材料的构建以及移植。载体材料的使用，不仅为细胞培养提供了良好的载体、保持细胞活性、解决了细胞移植过程中细胞悬液易流失的问题，同时通过调节细胞的接种密度和培养时间、实现对不同个体皮肤颜色的调控，此外，载体材料有良好的抗破损、抗撕裂、易转移等性能，良好的促进伤口愈合的作用，可满足大面积色素脱失症和皮肤颜色调节的使用要求。
文档编号C12N5/071GK101856517SQ20101020382
公开日2010年10月13日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者傅丽芳, 尉晓冬, 王文俊, 董东, 许思原, 许爱娥 申请人:杭州市第三人民医院;浙江大学