专利名称：伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光pcr检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及伤寒沙门菌检测领域，尤其涉及一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR 检测方法及检测试剂盒。
背景技术：
伤寒和副伤寒是我国法定乙类传染病，伤寒是由伤寒沙门菌引起的，副伤寒是由 甲、乙、丙型副伤寒沙门菌引起的。伤寒引起的急性肠道传染病，目前仍是世界性的主要公 共卫生问题之一，尤其在发展中国家。全世界每年约有1700万伤寒热病例，60万人死亡。 1990年以后，我国平均发病率在4. 08-10. 45/10万之间，每年报告5. 1-12万人患病，病死 33-374 人。目前伤寒、副伤寒现有诊断方法以细菌分离培养、生化鉴定和血清学鉴定为主，需 6-7天时间，特别是伤寒、副伤寒的传统血培养分离方法不仅时间长，而且阳性率低，不利于 疾病的早期诊断和治疗，易漏诊。近几年来，随着PCR技术和荧光PCR技术的发展，基于核 酸水平的检测方法逐渐开发。目前国内只有采用普通PCR同时检测伤寒和甲型副伤寒的报 道，国外有利用多重PCR检测伤寒、甲型和乙型副伤寒的报道，以及利用TaqMan探针的荧光 PCR技术检测伤寒沙门菌的报道，近期有用TaqMan荧光PCR检测丙型副伤寒和猪霍乱的报 道。但目前报道的荧光PCR技术一般都是单管检测1种伤寒沙门菌，未见利用改良分 子信标荧光探针结合HAND系统的多重荧光PCR技术1管同时检测伤寒、甲型、乙型和丙型 副伤寒的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，该试 剂盒可应用于一般标本的伤寒、副伤寒沙门菌初筛检测，其操作简便、结果客观准确。本发明的第二个目的在于提供一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列的加尾引物，其碱基 序列如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示；用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序 列如SEQ ID NO 3所示；特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO 5 所示；用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 6所示；特异性扩增乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ IDNO 7 禾口 SEQ ID NO 8 所示；用于检测乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 9所示；特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQID NO 10和SEQ ID NO 11 所示；用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO 12所示。所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌 fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM， 其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。所述用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团HEX，其3’ 端标记淬灭荧光基团DABCYL。一种利用多重荧光PCR检测伤寒、副伤寒沙门菌的方法，包括以下步骤1)提取样本DNA ；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门 菌ViaB基因序列的加尾引物PCR扩增ViaB基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示；利用特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物PCR扩增 fliC-a基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示；利用特异性扩增乙 型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物PCR扩增fliC-b基因，加尾引物碱基序列如 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示；利用特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物PCR 扩增沙门菌ssaR基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示；3)用以下分子信标探针与步骤2)所述PCR扩增产物杂交，以达到设定的阈值时所 需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct 彡 32:阳性，32 < Ct ^ 35 可疑，取样本重新进行DNA提取和PCR检测，如重测结果Ct彡35， 则判定为阳性；如重测结果Ct > 35或无Ct值，则判定为阴性；Ct >35 或为 0:阴性，用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序 列如SEQ ID NO 3所示；用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 6所示；用于检测乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 9所示；用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO 12所示。所述PCR扩增的反应体系为25μ 1反应体系含1 X buf fer (IOmMTri s-HCL，50mM KCl) ,3. 5mM MgC12，2. 4uM 通用引物，0. 04uM_0. 06 uM 加尾引物，0. 05uM_0. 2uM 各分子信标 探针，0. 3mM dNTP, 1. OU Taq 酶，5 μ IDNA 模板。所述PCR 扩增的反应条件为95°C 3min ；95°C 10s，58°C 20s, 72°C 15s，共 5 个 循环；95°C 10s，55°C 32s，72°C 15s，共 40 个循环。所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM， 其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL ；用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标 记荧光基团HEX，其3，端标记淬灭荧光基团DABCYL。PCR扩增时使用Mx 3005P荧光PCR仪在第二个循环周期的55°C退火阶段采集FAM 和HEX通道的荧光数据。本发明设计了 4对PCR引物分别特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB 基因序列、甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列、沙门菌 ssaR基因，4对PCR引物可在同一 PCR反应管里同时进行扩增，实现四重检测。本发明涉及4个靶基因的多重荧光PCR检测，为了避免引物二聚体，采用HAND系 统(相同标签辅助-无引物二聚体)设计同源加尾引物；为了保证4对引物和4个探针之 间无互补配对或交叉扩增的情况出现，设计改良分子信标。同时本发明所选用的两个荧光 基团的荧光波长相差较大，而且两者的荧光信号强度相近，以保证两种荧光信号之间无相 互干扰。本申请提供的“伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒”在检测灵敏度指标 方面已达到金标准培养法灵敏度水平，与传统的培养法相比具有快速灵敏、操作简便、结果 客观准确等优点，可应用于一般标本的伤寒、副伤寒沙门菌初筛检测。
图1是甲型副伤寒沙门菌引物和探针特异性验证结果图。图2是乙型副伤寒沙门菌引物和探针特异性验证结果图。图3是伤寒沙门菌与丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的引物和探针特异性验证结果 图。图4是标准品验证实验结果图，4A 甲型副伤寒沙门菌标准品，4B 乙型副伤寒沙 门菌标准品；4C 丙型副伤寒沙门菌标准品；4D 伤寒沙门菌标准品；4E 甲型副伤寒沙门 菌精密度；4F 伤寒沙门菌精密度；4G 甲型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌最低检出限；4H 8 株阴性参考品。
具体实施例方式实施例1一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列的加尾引物，其碱基 序列如 SEQ ID NO :1 (ViaB-TF)和 SEQ ID NO 2 (ViaB-TR)所示；用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序 列如 SEQ ID NO 3 (ViaB-P)所示；特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO :4(fliC-a-TF)和 SEQ ID NO :5 (fliC-a-TR)所示；用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO :6(fliC-a-P)所示；特异性扩增乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ IDNO :7(fliC-b-TF)和 SEQ ID NO :8 (fliC-b-TR)所示；用于检测乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 9 (fflC-b-P)所示；特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO 10 (ssaR-TF)和 SEQ ID NO :ll(ssaR_TR)所示；用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO :12(ssaR-P) 所示。所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌 fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM， 其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。所述用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团HEX，其3’ 端标记淬灭荧光基团DABCYL。加尾引物(tagged primer)是由5'端20bp无关序列连接3‘端特异序列形成 的。加尾引物的特异序列部分与通常使用的特异引物无异，它们是根据伤寒沙门菌、副伤寒 沙门菌的特异基因或序列设计的。传统分子信标探针的茎部是由无关的碱基(5bp_7bp)组成，而本申请分子信标探 针让茎部的部分碱基也和靶序列互补，使得杂交效率更高。表1加尾引物与探针列表
权利要求
1.一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列的加尾引物，其碱基序列如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示；用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序列如 SEQ ID NO 3 所示；特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO 4 禾口 SEQ ID NO 5 所示；用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 6 所示；特异性扩增乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示；用于检测乙型副伤寒沙门菌flic-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 9 所示；特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQID NO 10和SEQ ID NO 11所示；用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO 12所示。
2.根据权利要求1所述的伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于 所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因、 乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM，其3’端标记淬 灭荧光基团DABCYL。
3.根据权利要求1所述的伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于 所述用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团HEX，其3’端标记淬 灭荧光基团DABCYL。
4.一种利用多重荧光PCR检测伤寒、副伤寒沙门菌的方法，包括以下步骤1)提取样本DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌 ViaB基因序列的加尾引物PCR扩增ViaB基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID N0:2所示；利用特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物PCR扩增 fliC-a基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示；利用特异性扩增乙 型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物PCR扩增fliC-b基因，加尾引物碱基序列如 SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示；利用特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物PCR 扩增沙门菌ssaR基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示；3)用以下分子信标探针与步骤2)所述PCR扩增产物杂交，以达到设定的阈值时所需的 循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct ≤ 32 阳性，.32 < Ct ≤ 35 可疑，取样本重新进行DNA提取和PCR检测，如重测结果Ct ≤ 35，则判 定为阳性；如重测结果Ct > 35或无Ct值，则判定为阴性；Ct > 35或为0 阴性，用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 3 所示；用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 6 所示；用于检测乙型副伤寒沙门菌flic-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO 9 所示；用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO 12所示。
5.根据权利要求4所述的利用多重荧光PCR检测伤寒、副伤寒沙门菌的方法，其特征在 于，所述PCR扩增的反应体系为:25 μ 1反应体系含IXbuffer (IOmM Tris-HCL, 50mM KCl)， 3. 5mM MgC12，2. 4uM通用引物，0. 04uM_0. 06uM加尾引物，0. 05uM_0. 2uM各分子信标探针， 0. 3mM dNTP, 1. OU Taq 酶，5 μ IDNA 模板。
6.根据权利要求4所述的利用多重荧光PCR检测伤寒、副伤寒沙门菌的方法，其特征在 于，所述PCR扩增的反应条件为95°C 3min ；95°C 10s，58°C 20s, 72°C 15s，共5个循环； 95°C 10s，55°C 32s，72°C 15s，共 40 个循环。
7.根据权利要求4所述的利用多重荧光PCR检测伤寒、副伤寒沙门菌的方法，其特征 在于，所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌fliC-a 基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM，其3’端 标记淬灭荧光基团DABCYL ；用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标记荧光 基团HEX，其3，端标记淬灭荧光基团DABCYL。
8.根据权利要求7所述的利用多重荧光PCR检测伤寒、副伤寒沙门菌的方法，其特征 在于，PCR扩增时使用Mx3005P荧光PCR仪在第二个循环周期的55°C退火阶段采集FAM和 HEX通道的荧光数据。
全文摘要
本发明公开了一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法和检测试剂盒，所述检测方法和试剂盒包括分别特异性扩增伤寒沙门菌和丙型、甲型、乙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列、fliC-a基因序列、fliC-b基因序列和ssaR基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ IDNO1、2、4、5、7、8、10和11所示；用于检测伤寒沙门菌和丙型、甲型、乙型副伤寒沙门菌ViaB基因、fliC-a基因、fliC-b基因和ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO3、6、9和12所示。本申请提供的检测方法和试剂盒在检测灵敏度指标方面已达到金标准培养法灵敏度水平，与传统的培养法相比具有快速灵敏、操作简便、结果客观准确等优点。
文档编号C12Q1/68GK102102124SQ201010203580
公开日2011年6月22日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者刘涛, 扈庆华, 朱玉梅, 李庆阁, 李迎慧, 林一曼, 汪再兴, 石晓路, 邱亚群 申请人:深圳市疾病预防控制中心