专利名称：一种产氢产乙醇微生物聚集体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物聚集体的制备方法，具体涉及一种产氢产乙醇微生物聚集 体的制备方法。
背景技术：
目前生产生物乙醇的原料广泛采用甘蔗、玉米的糖分和淀粉等食用物质，供应量 受限以及使用成本高而限制了其应用。氢气的产生主要是通过化学方法，需要消耗大量的 能量且可能造成环境污染，亦面临着如何有效降低成本和减少对环境的污染问题。有机废 水处理多采用生物法处理，传统的有机废水生物处理技术(厌氧技术、好氧技术)着重于将 有机物分解为二氧化碳和水而未能实现对其资源化利用。许多有机废水如糖类生产废水、淀粉生产废水和酒类生产废水等中含有大量的碳 水化合物，是微生物发酵产氢和乙醇的理想底物。微生物制氢技术和燃料乙醇的生产方面 的研究日益增多，但是以有机废水为底物，通过特定微生物菌群如聚集体转化及代谢途径 控制同步产氢和乙醇的研究却鲜有报道。在各种制氢技术中，生物制氢因其作用条件温和， 可在常温常压下进行，能利用可再生的能源，也可进行废物的利用，具有能耗低和污染少等 特点而受到关注(Nath and Das，2004)。生物制氢技术主要有光合生物制氢和发酵生物制 氢(Das andVezirogludOOl)。前者具有能利用太阳能、底物转化率高等优点，但存在产氢 速率慢、光能转化效率低、光反应器设计复杂等缺点而限制了其实际应用。与光合生物制 氢技术相比，发酵生物制氢具有产氢速率快、不需要光能、反应器运行操作便利且能利用多 种废弃物等优势，因而实用性更强，更具备产业化前景(Das and Veziroglu, 2001 ；Nathand Das, 2004 ；Magnusson et al.，2009)。2005年，“有机废水发酵法生物制氢技术生产性示 范工程”在哈尔滨国际科技城启动，日产氢气达1200m3，但目前发酵生物制氢成本仍然较高 (Das and Veziroglu, 2009) 0该技术产业化过程中面临着如何有效降低成本、提高产氢效 率的难题，而这与微生物产氢代谢过程密切相关。以葡萄糖做原料产氢为例，通过甲酸裂解的途径产氢，以此途径产氢的微生物有 Escherichia coli 禾口 Enterobacter sp.。最适产 S pH 约在 7. 0 (Shin et al.,2007)。由 此可见葡萄糖通过微生物的发酵最终转化为有机酸、生物量的增加、氢气、二氧化碳和能 量。各种产氢类型差异的本质在于发酵过程中对发酵因子的控制与接种污泥微生物种群结 构不一样。已报道的影响发酵产氢的主要因子有接种微生物、底物浓度和类型、反应器构 造、水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)、有机负荷、C/N、C/P、氧化还原电位、 pH和温度等。对这些因子进行优化和控制可显著提高发酵生物制氢的效率(Yu and Mu, 2006 ；Wang and Wan W，2009)。采用实验设计和统计学方法对丁酸型发酵的产氢条件进行 优化和控制的研究较多，但大多数没有解决多响应之间最优化条件的选择，且未能揭示不 同条件下微生物种群的多样性的变化与微生物功能群。现代分子生物技术(克隆文库)、 生化技术(Biolog法)和光谱技术(红外光谱，IR)等可以很好地对微生物的种群结构、多 样性和代谢途径进行研究(Koskinen et al.，2007)。相对于丁酸型发酵而言，利用有机废水同步产氢产乙醇具有较大的优势是不存在液相产物的再处理问题，实用性较强。另一方 面，高效厌氧生物制氢技术的关键在于如何富集产氢优势菌(Cuetos et al. ,2007;Ren et al.，2007)。其接种污泥多为混合微生物群体，既有发酵细菌、产氢细菌亦有氢气消耗细菌 如产甲烷菌。若不能有效抑制氢气消耗细菌的活性，厌氧制氢系统的运行就会失败。因此 需对接种污泥进行有效的前处理，目前主要的方法有加热、酸处理、碱处理、充氧、有机溶剂 处理、冻融处理、超声波处理等。各种前处理方法其厌氧生物制氢的效率亦不同。Cheng和 Hansen (2006)比较了 5种厌氧污泥的前处理方式，认为酸处理效果最佳。但Hu和Cheng的 研究表明采用有机溶剂如氯仿处理可以最有效地抑制厌氧污泥中氢气消耗菌的活性。Wang 和Wei (2008)亦研究了 5中厌氧污泥的前处理方法的优劣，结果显示加热处理方法最好，且 简单而实用。但加热处理使得微生物的多样性发了急剧的变化，产氢类型易于向丁酸型转 化。而一些较温和的处理方式如通过改变PH可以维持厌氧污泥中形成一个利于产氢的微 生物种群结构(Lee et al.，2009)。由此可见，不同的研究中最佳厌氧污泥前处理亦不同， 其原因是不同的处理方式对微生物多样性和种群结构的影响不同。有必要对不同的前处理 方法进行优化设计，优选出利于同步产氢产乙醇的前处理方法。另一方面，有机废水厌氧生物制氢技术走向产业化的前提之一就是氢气的产 生需连续而稳定。现阶段，连续流发酵生物制氢的高效反应器主要有连续流搅拌罐反 应器(continuous stirred tank reactor, CSTR)禾口上、流式厌氧污泥床反应器(upflow anaerobic sludge blanket, UASB) 0 UASB中能够形成沉降性能优良、产甲烷活性高的微 生物聚集体，确保了厌氧生化过程高效、稳定地进行，是更为理想的厌氧生物制氢反应器 (Wang and Wan，2009)。在UASB中亦可形成沉降性能良好的产氢微生物聚集体，反应器能 够稳定运行达三年之久(Yuand Mu，2006)。同理，要实现有机废水同步产氢产乙醇UASB反 应器的持续稳定运行，最佳的方式是快速获得这种发酵类型的产氢微生物聚集体，但是这 方面的研究却鲜有报道。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种快速获得乙醇型发酵类型的产氢产 乙醇微生物聚集体的方法。本发明是通过以下技术方案实现的一种产氢产乙醇微生物聚集体的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)接种厌氧污泥的前处理取接种的厌氧污泥，利用酸处理(pH值彡4)处理后 接入UASB反应器中，使污泥的VSS为6 7g/L，再通入以葡萄糖为碳源的有机废水，UASB 启动时进水 C0D = 4. 5 5. 5g/L, pH 为 7. 0，HRT = 30h，温度 34. 5 35. 5°C。(2)当UASB反应器出水中的葡萄糖降解率达到95%以上，逐步提高进水中有机物 浓度，通过在进水中添加一定量的NaHC03以调节出水pH稳定在4 4. 5，最终进水C0D达 到 9. 5 10. 5g/L, HRT 缩短为 18h。在步骤(1)中，有机废水中除碳源外还包括以下成分(mg/L) :NH4HC03为2024 ； K2HP04 为 800 ；CaCl2 为 50 ；MgCl2 为 100 ；FeCl2 为 25 ；NaCl 为 10 ；CoCl2 为 5 ；MnCl2 为 5 ； A1C13 为 2. 5 ； (NH4)6Mo7024 为 15 ；H3B04 为 5 ；NiCl2 为 5 ；CuCl2 为 5 ；ZnCl2 为 5。在步骤(1)中，使用HCL进行酸处理。
在步骤(1)中，污泥的VSS为6. 5g/L。在步骤(1)中，UASB启动时 COD = 5g/L。在步骤(2)中，最终进水COD = 10g/L。本发明的有益效果为本发明从实现有机废水同步产氢产乙醇技术入手，在接种 污泥进行前处理的基础上对微生物多样性进行分析；结合克隆和测序技术对微生物功能群 进行研究，分析最佳产氢产乙醇微生物的种群结构。通过间歇实验的方法，对同步产氢产乙 醇的工艺条件进行优化，以用之于UASB反应器启动和运行条件的控制。在UASB反应器中，通过操作条件的控制与优化(pH、HRT、底物浓度等)，诱导同步 产氢产乙醇微生物聚集体的形成，分析聚集体形成过程中微生物种群结构的变化、代谢途 径，并对其理化性质进行系统研究，获取聚集体形成和稳定产氢产乙醇的最佳条件，获取同 步产氢产乙醇微生物聚集体形成的机制，解决传统生物制氢技术中存在液相产物的再利用 难题，为人工构建厌氧高效稳定运行的生物制氢系统提供理论和技术指导，加快有机废水 资源化利用的产业化进程。
图1为产氢产乙醇微生物聚集体光学显微照片；图2为基于16S rRNA序列的优势种群的系统发育树；图3为产氢产乙醇微生物聚集扫描电镜照片。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步详细说明。1、接种污泥的前处理取处理柠檬酸生产废水的厌氧反应器中污泥，经过实验室培养一段时间后充分磨 碎，过六十目筛后备用。UASB反应器采用有机玻璃制成。工作体积为3L，其中反应区2. 2L， 沉淀区0. 8L，三相分离器部分容积为2. 6L ；取一定体积的备用污泥经1M HC1处理24h，pH =3. 5处理后接入UASB反应器中，最终污泥的VSS(活性污泥中可挥发性固体)约为6 7g/L，最优值为6.5g/L。进水采用人工合成废水，碳源为葡萄糖，UASB启动时的COD (化学 需氧量)为 4. 5 5. 5g/L，最优值为 5. Og/L，其它成分为(mg/L) :NH4HC032024 ;K2HP04800 ； CaCl250 ；MgCl2100 ；FeCl225 ；NaCl 10 ；CoC125 ；MnCl25 ；A1C132. 5 ； (NH4) 6Mo7024 1 5 ；H3B045 ； NiCl25 ；CuC125义！！以办进水口！！为？^，冊仪水力停留时间)=30h，温度35士0. 5°C。2、微生物聚集体的形成当UASB反应器出水中的葡萄糖降解率达到95%以上，逐步提高进水中有机物浓 度，通过在进水中添加一定量的NaHC03以调节UASB反应器中的出水pH，维持在4 4. 5。 最终进水C0D = 9. 5 10. 5g/L，最优值为10. 0g/L，HRT逐步缩短为18h。定期取样分析氢 气的含量、出水中残糖量与C0D或T0C、反应器中污泥的生物量、可溶性有机物的定性和定 量分析；连续观察反应器中微生物聚集体的形成过程，定期采用光学显微成像进行分析。3、微生物聚集体理化性质分析分析产氢聚集体的沉降性能、疏水性、渗透性、Zeta电位、胞外聚合物浓度。通过理 化性质的分析，研究在产氢条件改变下聚集体的稳定性，结果表明产氢产乙醇微生物聚集体结构密实，外形规则，如图1所示，聚集体形成细胞表明的疏水性增加，胞外聚合物丰富、 反应器运行稳定，0LR为12kg (m3 d)-1与16. 8kg (m3 d)-1条件下，产氢速率和乙醇浓 度达到分别最大，为2. 89m3 (m3 d)-1和2840mg L-1。4、产氢微生物群落结构变化的监测(1)样品收集定期从UASB反应器中收集污泥，于-20°C保存备用。待UASB反应器中产氢颗粒 污泥的生长达到稳定期时，将所有收集好的污泥样品解冻(包括接种污泥样品)、无菌水洗 涤、分散后以用于DNA的提取。(2)DNA的提取与纯化将上述一定量的污泥样品加入一定体积的缓冲液中(含蛋白酶K)，振荡后，加入 20%的SDS，65°C温浴2h。加入等体积的氯仿/异戊醇混勻、离心收集上清液；加入等体积 的酚/氯仿/异戊醇混勻、离心，将上清液转入另一只离心管中，加入0. 6倍体积异丙醇，沉 淀、弃上清液，70%冰乙醇清洗两次，无菌风吹干，用TE缓冲液溶解沉淀得到总DNA的粗提 液，置于-20°C保存。采用DNA胶回收试剂盒对基因组DNA粗提液进行纯化。(3)基因组DNA的PCR扩增扩增引物以大多数细菌和古生菌的16S rDNA基因V3区具有特异性的引物对 F357和R518。PCR反应体系2 y L的模板、2. 5 y L正反向引物、1 y LdNTP、5 y L的10XPCR buffer、1 ii L 的 MgCl2、0. 5 u LTaqDNA 聚合酶和 34. 5 u L 双蒸水。PCR 反应条件:94oC 预变 性5min，前20个循环为94°C lmin, 65 55°C lmin和72°C 3min (其中每个循环后复性温度 下降 0. 5°C )，后 10 个循环为 94°C lmin，55°C lmin 和 72°C 3min，最后在 72°C下延伸 7min， 4°C保存。PCR反应的产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。(4) DG-DGGE 电泳采用梯度混合装置，制备10%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从35%到55%。将 胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽，加入PCR扩增样品5 yL。电泳后染色进行胶图扫描，获 取DG-DGGE的指纹图谱。图谱采用相关软件对样品中微生物多样性的和种群相对数量进行 评估。(5)克隆与测序选取DG-DGGE图谱上的主要条带进行重新扩增，方法同上所述，用PCR产物克隆试 剂盒将扩增产物与载体连接，连接产物通过热激法，转化到感受态的大肠杆菌中，选择阳性 克隆进行测序，所得序列经过处理后发送至GenBank数据库，采用BLAST将目标序列和基因 库中所含序列进行对比分析，得到同源性最近的序列。最后采用DNAMAN(V5.2.2版)建立 种系进化树。结果表明UASB运行过程微生物群落多样性不断变化，厌氧产氢颗粒污泥逐渐形 成，其结构密实，微生物组成以杆菌为主，是UASB反应器耐有机负荷冲击与高效产氢的关 键。稳定期时产氢系统内微生物多样性保持稳定，标志成熟产氢产乙醇微生物聚集体的 形成。种系进化树分析(如图2所示)后揭示产氢产乙醇聚集体中主要的微生物种群有 Clostridium sp. HPB-16，Clostridium sp. HPB-46，Clostridium sp. HPB-2，Clostridium sp. HPB-4，Oxalobacteraceae bacterium QD1，禾口不可培养细菌(Uncultured bacterium clone HPR93， UnculturedOlsenella sp.clone J27 禾口 Uncultured bacterium clone SR_FBR_E5)组成。 产氢产乙醇微生物聚集体的扫描电镜照片显示接种污泥(如图3(a)所示)中微 生物以丝状菌为主，结构疏松；而微生物聚集体则以杆菌为主，结构密实，并有清晰的孔道 (如图3(b、c和d)所示)，这些孔道有利于物质交换。微生物聚集体形成后，因其沉降性能 优良，能够在反应器内维持较高的生物量，从而使UASB发酵产氢系统的稳定性与抗冲击负 荷能力显著增强。
权利要求
一种产氢产乙醇微生物聚集体的制备方法，其特征在于所述方法包括下述步骤(1)接种厌氧污泥的前处理取接种的厌氧污泥，利用酸处理后使pH值≤4，接入UASB反应器中，使污泥的VSS为6～7g/L，再通入以葡萄糖为碳源的有机废水，UASB启动时COD＝4.5～5.5g/L，进水pH为7.0，HRT＝30h，温度34.5～35.5℃。(2)当UASB反应器出水中的葡萄糖降解率达到95％以上，逐步提高进水中有机物浓度，通过在进水中添加一定量的NaHCO3以调节出水pH为4～4.5，并保证最终进水COD＝9.5～10.5g/L，HRT缩短为18h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，，有机废水中还可包括 以下成分(mg/L) =NH4HCO3 为 2024 ；K2HPO4 为 800 ；CaCl2 为 50 ；MgCl2 为 100 ；FeCl2 为 25 ； NaCl 为 10 ；CoCl2 为 5 ；MnCl2 为 5 ；AlCl3 为 2. 5 ； (NH4)6Mo7O24 为 15 ；H3BO4 为 5 ；NiCl2 为 5 ； CuCl2 为 5 ；ZnCl2 为 5。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，使用HCL进行酸处理。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，污泥的VSS为6.5g/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，UASB启动时COD= 5g/
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤(2)中，最终进水COD= IOg/
全文摘要
本发明涉及一种产氢产乙醇微生物聚集体的制备方法，对接种的厌氧污泥进行前处理，通入人工合成的有机废水，当UASB反应器出水中的葡萄糖降解率达到95％以上，逐步提高进水中有机物浓度并使出水pH稳定在4～4.5。本发明从实现有机废水同步产氢产乙醇技术入手，对成熟的产氢产乙醇微生物聚集体中微生物多样性进行分析；结合克隆和测序技术对微生物功能群进行研究，分析最佳产氢产乙醇微生物的种群结构，为人工构建厌氧高效稳定运行的生物制氢系统提供理论和技术指导，加快有机废水资源化利用的产业化进程。
文档编号C12N1/00GK101886040SQ20101020378
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者石先阳 申请人:安徽大学