专利名称：一种用于治疗血管瘤的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质，具体涉及一种用于治疗血管瘤的蛋白质。
背景技术：
血管瘤(hemangioma)是以血管内皮细胞增生为特征的肿瘤，是人类常见的良性 肿瘤之一，可见于身体的任何部位，以外表软组织的血管瘤为多见，常常侵犯于颜面部皮 肤、眼、鼻、唇、舌、咽、软腭等器官，造成颜面畸形和功能障碍。新生儿的发病率为_2%， 生长在外表的血管瘤破坏周围组织，有些血管瘤呈浸润性生长，从而造成儿童美容缺陷。至 今尚没有有效的治疗血管瘤的化学药物。目前应用于治疗血管瘤的方法有手术、放射和激素治疗等。其中，手术疗法是最常 用的方法，但是手术造成创伤较大，常需要组织移植修复，常留下疤痕，且有大量出血的危 险因素；放疗和激素治疗对机体有较强的毒性作用和负作用，放疗可能引起放射性皮炎，骨 组织损伤及照射后继发恶性转变的可能；激素治疗可能并发柯兴氏综合症，影响小儿生长 发育。经过远期随访，证实手术、放射、和激素治疗毛细血管瘤有后遗损害，美容效果不理 想，并发症可达50%，约有30%的复发率。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗血管瘤的蛋白质。本发明所采用的技术方案是一种用于治疗血管瘤的蛋白质(Canstatin-N)，具 有以下基因序列ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAGACGGAC
CAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGGCATGAACAAACTCTGGAGTGGATAC
AGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGAC
CTGGGGCTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTC
CTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTATGCCAGCCGGAACGAC
AAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCATCATCATCATCAT CAT TAG上述蛋白质(Canstatin-N)由基因序列编码的氨基酸组成如下Met Val Ser lie Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp Gln Glu Pro Met CysPro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln GluLys Ala His Asn Gln Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr MetPro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Lys Ser
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Tyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro His His His His His His。本发明所提供的蛋白质(Canstatin-N)的制备方法是提取人脐带静脉基因组 DNA作为模板，根据血管能抑素(canstatin)的N端1 89氨基酸基因片段(canstatin-N) 的序列合成基因片段特异引物上游引物5，CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT3，；下游引物5，CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCA 3’ ；用反转录PCR方法从人基因组中扩增血管能抑素(canstatin)的N端1 89氨 基酸基因片段canstatin-N，并在其序列的C末端加上his纯化标签(经DNA序列分析证 明正确)；然后将这一基因片段重组于Pichia pastoris基因组，在Pichia pastoris中表 达Canstatin-N蛋白；再用离子交换方法和亲和层析方法纯化Canstatin-N蛋白。通过蛋 白电泳(在SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合Canstatin-N的分子量)和蛋 白印迹实验证明纯化的目标蛋白正确(纯化的目标蛋白能够与Canstatin-N蛋白的抗体发 生特异结合)；通过抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成试验证明纯化的Canstatin-N蛋白 具有抑制新生血管生成的活性。利用上述蛋白质制备医药制品，可有效地治疗血管瘤尤其是外表软组织的血管瘤。本发明所提供的Canstatin-N蛋白是一种血管生成抑制因子，用Canstatin-N蛋 白进行抑制人体毛细血管瘤细胞试验，证明Canstatin-N蛋白致使人体毛细血管瘤内皮细 胞凋亡，凋亡率达92%;将人体的毛细血管瘤细胞接种于裸鼠建立人体毛细血管瘤模型，然 后用Canstatin-N蛋白进行治疗证明Canstatin-N蛋白能有效地治疗毛细血管瘤，是一种 治疗人体毛细血管瘤的药物。本发明以人脐带静脉基因组DNA为模板进行扩增得到canstatin-N基因，将 canstatin-N基因重组于Pichia pastoris基因组进行表达获得的Canstatin-N蛋白，可有 效地提高人体毛细血管内皮细胞凋亡率，抑制人体毛细血管内皮细胞，有效地抑制和治疗 人体毛细血管瘤，为生产特效的抑制人体毛细血管瘤的药物的研究和开发创造了必要的条 件，具有重要的理论和实践意义。
具体实施例方式下面对本发明做进一步说明。Canstatin-N 蛋白的制备1、提取人脐带静脉基因组DNA作为模板，根据血管能抑素的N端1 89氨基酸基 因片段的序列合成基因片段特异引物上游引物5，CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT3，；下游引物5，CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCA 3’ 用反转录PCR方法从人基因组中扩增血管能抑素(canstatin)的N端1 89氨
4基酸基因片段canstatin-N，并在其序列的C末端加上his纯化标签。2、从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)(pGAP 是Pichia pastoris的组成型强启动子)；3、通过DNA的酶切和连接作用，将步骤1获得的融合了 his纯化标签的 canstatin-N DNA插入Pichia pastoris表达载体(pGAP为启动子，G418抗性基因作为筛 选标记，不含引导蛋白分泌的信号肽)的多克隆位点，将这一载体转化Pichia pastoris基 因组，并将转化物涂布于G418-YPD平板含G418为彡300 μ g/mL的YPD平板。4、从步骤3的G418-YPD平板在挑选Pichia pastoris重组子作为工程菌株；5、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2S0418. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，葡萄糖 40g，蛋白 胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达 Canstatin-N蛋白。其发酵参数为温度28 30°C，pH5. 0，搅拌转速200-900r/min。发酵 1 2d后离心收获细胞。用蜗牛酶(6mg/mL，用lmol/L的山梨醇配置)裂解细胞，离心收 获上清。先用离子交换剂(SP-S印harose FastFlow)进行纯化，然后用Ni-Agarose His标 签蛋白纯化试剂盒进行进一步纯化Canstatin-N蛋白。通过蛋白电泳(在SDS-PAGE上呈 现纯化的目标蛋白的分子量符合Canstatin-N的分子量)和蛋白印迹实验(纯化的目标蛋 白能够与Canstatin-N蛋白的抗血清特异结合)证明纯化的目标蛋白正确；通过抑制鸡胚 绒毛尿囊膜新生血管生成试验(纯化的目标蛋白能抑制6天龄鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管 的生成)证明纯化的Canstatin-N蛋白具有抑制新生血管生成的活性。实用例一、取Canstatin-N蛋白Img溶解于0. 2ml生理盐水(0. 85 % NaCl)， 然后将其加入可经皮肤给药治疗局部毛细血管瘤的特制的Canstatin-N蛋白释放装置 中(Canstatin-N蛋白释放装置由碗状聚乙烯塑料和及钼金电极片组成，电极内填充由 0. Olmol/L柠檬酸缓冲液(pH3. 6)及聚乙烯吡咯脘酮制成的亲水胶，内加Canstatin-N蛋白 (0.05 Img)，表面覆以高分子膜。接受电极由电极片和导电胶组成导。电胶的主要成分 为羧甲基纤维素钠和0. Olmol/L磷酸缓冲液，pH7. 4。)，即可针对皮肤外表的血管瘤进行局 部经皮给药。实用例二、取Canstatin-N蛋白Img溶解于0.2ml PBS溶液，然后将其加入可经 皮肤给药治疗局部毛细血管瘤的特制的Canstatin-N蛋白释放装置中(Canstatin-N蛋白 释放装置由碗状聚乙烯塑料和及钼金电极片组成，电极内填充由0. Olmol/L柠檬酸缓冲 液(ρΗ3· 6)及聚乙烯吡咯脘酮制成的亲水胶，内加Canstatin-N蛋白(0. 05 Img)，表面 覆以高分子膜。接受电极由电极片和导电胶组成导。电胶的主要成分为羧甲基纤维素钠和 0. 01mol/L磷酸缓冲液，pH7. 4。)，即可针对皮肤外表的血管瘤进行局部经皮给药。药物疗效检测在40只BALB/C雌性裸小鼠(4_6周龄)的背部皮下注入人体毛细血管瘤内皮细 胞(1.5X106个/只)当肿瘤体积增长至IOOmm3左右时，将小鼠随机分为4组，每组10只 (A、C组为试验组，B、D组为对照组)。以同样的条件对4组血管瘤模型进行经皮给药，治疗 使用的脉冲电流强度为0. 4mA/cm2，频率为2000Hz治疗时间为20分钟。在A组使用的给药
5装置中加入用NaCl配制的0. 5mg/L的Canstatin-N蛋白，在C组使用的给药装置中加入用 PBS配制的0. 5mg/L的Canstatin-N蛋白，在B组使用的给药装置中加入等体积的NaCl溶 液，在D组使用的给药装置中加入等体积的PBS溶液。治疗时间为三周。治疗结果计算两 组鼠治疗后血管瘤的面积(计算式肿瘤宽2X长X0. 52)(见表1)。结果分析(表2)表 明与对照组(B、D组)比较，试验组(A、C组)的血管瘤面积呈显著性减少(P <0.01)。结 论=Canstatin-N蛋白对人毛细血管瘤有治疗作用。表1.用Canstatin-N蛋白治疗人血管瘤结果(瘤体积mm3)
权利要求
一种用于治疗血管瘤的蛋白质，其特征在于，具有以下基因序列ATG GTC AGC ATC GGC TAC CTC CTG GTG AAG CAC AGC CAG ACG GACCAG GAG CCC ATG TGC CCG GTG GGC ATG AAC AAA CTC TGG AGT GGA TACAGC CTG CTG TAC TTC GAG GGC CAG GAG AAG GCG CAC AAC CAG GACCTG GGG CTG GCG GGC TCC TGC CTG GCG CGG TTC AGC ACC ATG CCC TTCCTG TAC TGC AAC CCT GGT GAT GTC TGC TAC TAT GCC AGC CGG AAC GACAAG TCC TAC TGG CTC TCT ACC ACT GCG CCG CTG CCC CAT CAT CAT CATCAT CAT TAG。
2.根据权利要求1所述的用于治疗血管3曹的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质由基因序列编码的氨基酸组成如下Met Val Ser lie Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp Gln Glu Pro MetCysPro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly GlnGluLys Ala His Asn Gln Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser ThrMetPro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp LysSerTyr Trp Leu Ser Thr ThrAla Pro Leu Pro His His His His His His。
3.—种权利要求1所述的用于治疗血管瘤的蛋白质的制备方法，其特征在于是提取 人脐带静脉基因组DNA作为模板，根据血管能抑素的N端1 89氨基酸基因片段的序列合 成基因片段特异引物上游引物5’ CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT 3’ ； 下游引物5，CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGT GGTAGAGAGCCA 3'；用反转录PCR方法从人基因组中扩增血管能抑素的N端1 89氨基酸基因片段 canstatin-N,并在其序列的C末端加上his纯化标签；然后将这一基因片段重组于Pichia pastoris基因组，在Pichia pastoris中表达Canstatin-Ν蛋白；再用离子交换方法和亲 和层析方法纯化Canstatin-N蛋白。
4.根据权利要求1所述的用于治疗血管瘤的蛋白质，其特征在于利用所述蛋白质制 备治疗人血管瘤的医药制品。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗血管瘤的蛋白质，是以人脐带静脉基因组DNA作为模版，设计基因片段特异引物，用反转录PCR方法扩增血管能抑素(canstatin)的N端1～89氨基酸基因片段，并在其序列的C末端加上his纯化标签；然后再重组于Pichia pastoris基因组，在Pichia pastoris中表达Canstatin-N蛋白；再用离子交换方法和亲和层析方法纯化Canstatin-N蛋白，所得蛋白质具有序列表中<400>1项下的序列。本发明以人脐带静脉基因组DNA为模板进行扩增得到的Canstatin-N蛋白，可有效地抑制人血管内皮细胞，有效地抑制和治疗血管瘤，为生产特效的抑制血管瘤的药物的研究和开发创造了必要的条件，具有重要的理论和实践意义。
文档编号C12N15/12GK101962404SQ201010214720
公开日2011年2月2日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者张添元, 张爱联, 潘英文, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所