专利名称：一种乙肝病毒耐药性检测方法
技术领域：
本发明涉及乙肝病毒的检测方法技术领域，特别涉及一种乙肝病毒的耐药性的检 测方法。
背景技术：
现有技术中乙肝病毒耐药性的检测方法，有PCR-RFLP法、特异性Taqman探针实时 荧光定量PCR法、斑点杂交法、PCR产物双脱氧法测序、PCR产物焦磷酸测序、克隆测序、基因 芯片以及线性探针反向杂交法等等。其中，PCR-RFLP法已有大量报道，其操作受操作者因素影响较大，另外其显著缺点 为针对每种变异病毒均需要特异性引物与酶切体系。随着核苷类似物应用时间的延长，目 前多数进行核苷类似物耐药检测患者曾应用过两种或以上的药物，另外患者也希望通过耐 药检测明确其体内病毒对于可能应用的挽救药物敏感性如何，因此如同时检测多种药物耐 药情况，PCR-RFLP方法显然非常繁琐。斑点杂交法与特异性Taqman探针实时荧光定量PCR 法因本身检测方法设计问题而放弃。克隆测序工作量太大且昂贵，仅检测了少数特殊患者。现有技术中，线性探针反向杂交法已形成商业化检测试剂盒，即INN0-LIPA HBV DR试剂盒，目前该试剂盒包括INN0-LIPA HBV DR V2与INNO-LIPA HBV DR V3。该试剂盒 目前在国际大型临床注册试验中广泛应用。该试剂盒可采用与该试剂盒配套的Auto-LiPA 自动反应仪或Auto-LiPA 48自动反应仪进行检测，但该仪器价格昂贵。也可以手工检测， 本申请的发明人曾应用该试剂盒对部分样品进行手工检测，手工操作步骤繁琐。另外不管 是手工检测还是仪器检测，其结果均需要肉眼来判读，因此当杂交显色后的条带较弱时，其 结果判断即受到检测者影响。另外该试剂盒对于基因B型或C型患者在rtN236T检测条带 上会有假阳性的情况，而中国患者多以基因B型或C型为主；再加上此试剂盒本身价格非常 昂贵，目前看来，其应用于我国临床检测的价值并不大。PCR产物双脱氧法测序具备以下优点操作相对简便，尤其是目前国内测序反应 多由公司来完成，可节约人力资源；随着测序自动化水平的提高，测序反应本身的成本已大 大降低，再加上其可同时检测多种药物的耐药变异，PCR产物双脱氧法测序不应再作为一种 价格昂贵的耐药检测方法。虽然PCR产物双脱氧法测序具有上述优点，但其的确存在检测 灵敏度的问题。大量研究已证实，PCR产物双脱氧法测序仅能于体内病毒群中检出> 20 30%的变异病毒。变异株能否被扩增以及扩增模板中杂合株的比例即受到偶然因素影响； 而且模板拷贝数较低必然导致PCR产物量相应减少，在进行双脱氧测序时会导致杂合变异 与干扰峰的判断困难，因此也会影响杂合株的检出。现有技术中，针对血清HBV DNA模板数较少而双脱氧法无法检测出的问题，一般通 过两种方法来解决。一方面，可以改善模板提取方法，增加模板HBV DNA的浓集或者换用 HBV DNA提取效率更高的试剂盒，但往往会增加实验成本；另一方面，可以通过多次重复试 验的方式来解决，但同样会增加检测成本与工作量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种乙肝病毒耐药性检测方法，操作简 便，可高通量检测，且可检出低比例的耐药变异病毒。为解决上述技术问题，本发明提供了一种乙肝病毒耐药性检测方法(或者是一种 乙肝病毒焦磷酸测序方法)，包括以下步骤a.血清 HBV DNA 提取；b. PCR 扩增；c.自PCR反应产物中分离单链DNA及焦磷酸法测序。所述步骤a可以进一步包括采用Axygen体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒提取 血清 HBV DNA。所述步骤a还可以进一步包括(1).取200 μ 1患者血清与阴性对照用双蒸水加入1. 5ml的EP管中；(2).加入250 μ 1的V-L液，震荡混勻，室温放置5min ；(3) ·加入75 μ 1的V-N液，震荡混勻，12000转/min离心5min ；(4).取上清转移至2ml的套管中，加入250 μ 1异丙醇/乙酸溶液，混勻后离心；(5).将离心柱插入新的2ml的套管中，将离心后的液体转移至离心柱中，6000转 /min 离心 Imin ；(6).弃去2ml套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管中，加入500μ1的Wl A 液，室温放置Imin, 12000转/min离心Imin ；(7).弃去套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管，加入800 μ 1的W2液，12000 转/min离心Imin ；(8).弃去套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管，12000转/min再次离心lmin， 充分去除残余的洗脱液；(9).弃去套管，将离心柱插入新的1. 5ml的EP管中，加入40 μ 1的TE液，室温放 置lmin，12000转/min离心lmin，EP管中滤过液即为提取的HBV DNA溶液，用作PCR扩增 模板。所述步骤a的步骤(4)中，所述异丙醇/乙酸溶液优选为含质量百分比99%的异 丙醇与含质量百分比的乙酸组成的混合液。所述步骤a也可以进一步包括1)吸取20ul蛋白酶K加入1. 5mL离心管底部；2)加入患者血清200ul至1. 5mL离心管；3)加200ul缓冲液AL至样品管，振荡器间隔振荡混勻15秒；4)置于56°C孵育10分钟，短暂离心1. 5mL管以保证管壁及管盖内溶液流向管底；5)向上述混合液中加200ul无水乙醇至样本管，在振荡器上间隔混勻15秒，短暂 离心，混勻后重复步骤4的操作；6)混合液转移至QIAamp吸附柱置于是2mL收集管上，关盖，SOOOrpm离心1分钟； 再将QIAamp吸附柱转移至一个清洁的2mL收集管内，更换收集管；7)打开QIAamp吸附柱，向其中加入500ul缓冲液AW1，盖紧后8000rpm离心1分
钟，将液体弃掉；
6
8)打开QIAamp吸附柱，向其中加入500ul缓冲液Aw2，关盖，14000rpm离心3分 钟；9)将QIAamp吸附柱置于2mL收集管，12000rpm离心1分钟；标记1. 5mL离心管， 将QIAamp吸附柱置于洁净的1. 5mL的离心管中；10)打开QIAamp吸附柱加入50ul缓冲液AE或双蒸水，15-25°C下放置1分钟， 12000rpm离心1分钟；11)离心所得HBV DNA即为用于PCR扩增的模板DNA。所述步骤b中，PCR扩增的反应体系可以为30iil PCR反应体系中，15 60ng模 板DNA，9. Ommol I^Mg2、1. 04mmol I^dNTPs，1. 8U TaqDNA聚合酶，四种弓丨物各 2ii mol 化人
所述步骤b中，PCR扩增可以为巢式PCR，其引物优选为 外引物
P1 5，AC(A)C(T)gAACATggAgAA(g)CA3，
P2 5，ggT(C)CT(G)A(G)TTT(A)ACAggC(A)AgTTT3，
内引物
RTPOS :gCCAAAATTCgCAgTCCC RTNEG :AAVCCCAAAAgACCCACA。 所述步骤b中，PCR扩增的反应条件可以为 反应步骤反应条件
37 °C, 5min 95 °C, 3min 95°C, 10s 50°C，20s 72°C，30s 50
72°C，5min
4°C
中，自PCR反应产物中分离单链DNA及焦磷酸法测序的具体步骤可以 为(1)将PCR产物30iiL转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入磁珠3iiL和结合 缓冲液47 u L，震荡混勻lOmin ；(2)打开真空泵，将真空预装工具在超纯水中清洗30s，然后转移到96孔PCR板 中，抓取磁珠，分别在70%乙醇、变性缓冲液、洗涤缓冲液中清洗5 10s，再将其放入96孔 测序板中，该板中预先加入测序引物0. 3 u mol/L和退火缓冲液共45 u L，关闭真空泵，充分 震荡摇动，释放磁珠；(3)将放有样品的96孔测序板在80°C放置2min，自然冷却至室温后进行焦磷酸测 序反应；(4)设定程序，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及4种碱基，将试剂舱和 96孔测序板放入机箱进行测序反应。所述步骤c的步骤(1)中，所述结合缓冲液中，可以进一步包括
保温
预变性
变性
退火
延伸
循环数
延伸
冷却至
所述步骤
7
IOmmol/L Tris-HCI ；2mol/L NaCl ；lmmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)；0. 1 % Tween 20 ；所述结合缓冲液pH值为7. 6。所述步骤c的步骤⑵中，所述变性缓冲液可以包括0. 2mol/L NaOH ；所述洗涤缓冲液可以包括10mmol/L Tris-Acetate，其pH值为7. 6 ；所述退火缓冲液可以包括20mmol/LTris-Acetate 和 2mmol/LMg-Acetate，其 pH 值为7.6。本发明乙肝病毒耐药性检测方法可检出低比例的耐药变异病毒，操作简便，可高 通量检测，并可计算变异株比例。
图1为本发明实施例所述rtl81焦磷酸测序结果示意图；图2为本发明实施例所述rt236焦磷酸测序结果示意图。
具体实施例方式目前本领域技术人员普遍认为，基于测序的方法是乙肝病毒基因型耐药检测的金 标准。目前几乎所有的乙肝病毒基因型耐药的检测方法均需PCR作为基础，为了能尽可能 提高耐药株的检出能力，目前采用的方法多需要巢式PCR或者>40个循环的单轮PCR扩 增，如在操作中出现污染将很容易造成假阳性与假阴性检测结果。因此在进行PCR检测时， 应该严格按照PCR实验室分区进行样品制备、PCR反应体系配制、PCR扩增以及PCR结果分 析；应该建立简便有效的污染控制方法；另外在进行模板提取时、PCR扩增以及后续检测时 均需要加入阴性对照。如阴性对照也取得阳性扩增，则应将所有检测标本弃去，迅速查找污 染原因，重新开始检测。以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用 技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。本发明乙 肝病毒耐药性进测方法可检出低比例的耐药变异病毒。本发明实施例中采用乙肝病毒的焦 磷酸测序法检测共检出ADV耐药变异位点78例，其中变异株比例< 30%耐药位点61例，最 低检出耐药变异株比例为8. 9%。目前被我国国家食品药品监督管理局(SFDA)批准用于抗HBV治疗的药物主要包 括两类干扰素类与核苷(酸)类似物类，后者包括拉米夫定(lamivudine，LAM)、阿德福 韦酯(adefovir dipivoxil，ADV)、替比夫定(telbivudine, LdT)与恩替卡韦(entecavir, ETV)。其中ADV自上市以来，在CHB患者，尤其是LAM耐药患者中被广泛应用。但随着ADV 治疗时间延长，ADV耐药的问题逐渐凸显。根据焦磷酸测序法的原理，首先设计PCR引物扩增包含HBV rtl81位与rt236位 氨基酸的序列。然后设计焦磷酸测序引物对HBV rtl81位与rt236位编码序列进行测序。 因为焦磷酸测序法每个测序反应仅能检测约40bp。因此在临床检测中根据受试患者核苷酸类似物治疗经历不同，可针对LAM、ADV、LdT与ETV不同分别采用不同数量的测序反应。本实施例中仅对ADV耐药进行了检测，则只需针对同时检测rtl81位与rt236 位的两个测序反应，而如同时检测ADV与ETV的耐药位点，则至少需要4个反应即针对 rtl80、rtl81与rtl84位的测序反应、针对rt202位与rt204位测序反应、以及分别针对 rt236位与rt250位的测序反应。该试剂盒的设计可同时检测LAM、ADV、LdT与ETV耐药。本实施例中焦磷酸测序法检测ADV耐药的步骤如下。一、血清 HBV DNA 提取采用Axygen体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒提取血清HBV DNA,步骤如下(1).取200 ill患者血清与阴性对照用双蒸水加入1. 5ml的EP管中；
(2).加入250 u 1的V-L液，震荡混勻，室温放置5min ；(3) 加入 75 ill 的 V-N 液，震荡混勻，12000 转 /min 离心 5min ；(4).取上清转移至2ml的套管中，加入250 u 1异丙醇/乙酸溶液(含99%异丙 醇与1%乙酸)，充分混勻后短暂离心；(5).将离心柱插入新的2ml的套管中，将离心后的液体转移至离心柱中，6000转 /min 离心 lmin ；(6).弃去2ml套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管中，加入500 ill的W1A液， 室温放置lmin, 12000转/min离心lmin ；(7).弃去套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管，加入800 ill的W2液，12000 转/min离心lmin ；(8).弃去套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管，12000转/min再次离心lmin， 充分去除残余的洗脱液；(9).弃去套管，将离心柱插入新的1. 5ml的EP管中，加入40 yl的TE液，室温放 置lmin，12000转/min离心lmin，EP管中滤过液即为提取的HBV DNA溶液，可用作PCR扩 增模板。在本发明的另一实施例中，采用如下方法提取血清HBV DNA 1)吸取20ul蛋白酶K加入1. 5mL离心管底部；2)加入患者血清200ul至1. 5mL离心管；3)加200ul缓冲液AL至样品管，振荡器间隔振荡混勻15秒；4)置于56°C孵育10分钟，短暂离心1. 5mL管以保证管壁及管盖内溶液流向管底；5)向上述混合液中加200ul无水乙醇至样本管，在振荡器上间隔混勻15秒，短暂 离心，混勻后重复步骤4的操作；6)混合液转移至QIAamp吸附柱置于是2mL收集管上，关盖，8000rpm离心1分钟； 再将QIAamp吸附柱转移至一个清洁的2mL收集管内，更换收集管；7)打开QIAamp吸附柱，向其中加入500ul缓冲液AW1，盖紧后8000rpm离心1分
钟，将液体弃掉；8)打开QIAamp吸附柱，向其中加入500ul缓冲液Aw2，关盖，14000rpm离心3分 钟；9)将QIAamp吸附柱置于2mL收集管，12000rpm离心1分钟；标记1. 5mL离心管， 将QIAamp吸附柱置于洁净的1. 5mL的离心管中；
10)打开QIAamp吸附柱加入50ul缓冲液AE或双蒸水，15-25°C下放置1分钟， 12000rpm离心1分钟；11)离心所得HBV DNA即为用于PCR扩增的模板DNA。二、PCR扩增的反应体系与反应条件如下所示。PCR反应体系30μ1。为便于焦磷 酸测序仪自动化操作，PCR反应在96孔PCR反应板上进行。在检测样本同时需加入阳性与 阴性对照。PCR反应结束后可对阳性与阴性对照样本进行琼脂糖凝胶电泳，如阳性对照有条 带而阴性对照无条带，则可初步提示模板提取与PCR反应过程正常，继续进行测序反应。焦磷酸测序法PCR反应体系30 μ 1 PCR反应体系中，15 60ng模板DNA，9. Ommol 'U1Mg2+, 1. 04mmol 'L^dNTPs, 1.8U Taq DNA聚合酶，四种引物各2 μ mol · Γ1。巢式PCR反应的引物为外引物P1 5，AC (A) C (T) gAACATggAgAA (g) CA3，P2 5，ggT (C) CT (G) A (G) TTT (A) ACAggC (A) AgTTT3，内引物RTPOS :gCCAAAATTCgCAgTCCCRTNEG :AAVCCCAAAAgACCCACA焦磷酸测序法PCR反应条件反应步骤 反应条件保温37°C，5min预变性95°C，3min变性95°C，10s退火50°C, 20s延伸72°C，30s循环数 50延伸72°C，5min冷却至 4°C三、自PCR反应产物中分离单链DNA，测序(1)将PCR产物30μ L转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入磁珠3μ L和结 合缓冲液[Binding Buffer ；含 IOmmo 1/L Tris-HCI，2mol/L NaCl，lmmol/L 乙二胺四乙酸 二钠盐(EDTA),0. 1% Tween 20，pH 7. 6]47 μ L，常温震荡混勻IOmin0 (2)打开真空泵，将 真空预装工具(Vacuum Prep Tool)在超纯水中清洗30s，然后转移到96孔PCR板中，抓取 磁珠，分别在70%乙醇、变性缓冲液(Denaturation Buffer ；0. 2mol/L NaOH)、洗涤缓冲液 (Washing Buffer ；含 10mmol/L Tris-Acetate, pH 7. 6)中清洗 5 10s，再将其放入 96 孔测序板中，该板中预先加入测序引物0. 3 μ mol/L和退火缓冲液(Annealing Buffer ；含 20mmol/L Tris-Acetate, 2mmol/L Mg-Acetate, pH 7. 6)共45 μ L，关闭真空泵，充分震荡摇 动，释放磁珠。(3)将放有样品的96孔测序板在80°C放置2min，自然冷却至室温后进行焦 磷酸测序反应。(4)设定程序，碱基投放顺序为TAGCGACAGTCGCTCTAGA，根据程序给定剂量， 在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及4种碱基，将试剂舱和96孔测序板放入机箱进
10行测序反应。结果分析采用焦磷酸测序仪配套分析软件进行。首先进行单核苷酸多态性 (SNP)分析判定有无变异。如该位点存在杂合变异，则进行变异株比例分析，判断变异病毒 在病毒群中所占比例。如图1所示，为本发明实施例所述rtl81焦磷酸测序结果示意图；如图2所示，为 本发明实施例所述rt236焦磷酸测序结果示意图。其中，图1表示患者存在rtA181V/T以及 野生株杂合变异，图2示患者rt236位为野生株序列。在检测的200例病例中，共检出ADV 耐药78例，其中病毒学突破组61例，无应答组17例。焦磷酸测序法对于存在杂合变异未 见进一步进行变异株比例分析以判断变异病毒在病毒群中所占比例。检测结果见表1-10。表1-10.焦磷酸测序测序检出ADV基因型耐药
权利要求
一种乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，包括以下步骤d.血清HBV DNA提取；e.PCR扩增；f.自PCR反应产物中分离单链DNA及焦磷酸法测序。
2.根据权利要求1所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤a进一步包 括采用Axygen体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒提取血清HBV DNA ；其具体步骤如下(1).取200μ 1患者血清与阴性对照用双蒸水加入1. 5ml的EP管中；(2).加入250μ 1的V-L液，震荡混勻，室温放置5min ；(3)·加入75 μ 1的V-N液，震荡混勻，12000转/min离心5min ；(4).取上清转移至2ml的套管中，加入250μ 1异丙醇/乙酸溶液，混勻后离心；(5).将离心柱插入新的2ml的套管中，将离心后的液体转移至离心柱中，6000转/min 离心Imin ；(6).弃去2ml套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管中，加入500μ 1的WlA液，室温 放置 Imin, 12000 转 /min 离心 Imin ；(7).弃去套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管，加入800μ 1的W2液，12000转/ min 离心 Imin ；(8).弃去套管中的滤过液，将离心柱重新插入套管，12000转/min再次离心lmin，充分 去除残余的洗脱液；(9).弃去套管，将离心柱插入新的1.5ml的EP管中，加入40μ 1的TE液，室温放置 lmin, 12000转/min离心lmin，EP管中滤过液即为提取的HBV DNA溶液，用作PCR扩增模 板。
3.根据权利要求2所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤a的步骤(4) 中，所述异丙醇/乙酸溶液为含质量百分比99%的异丙醇与含质量百分比的乙酸组成 的混合液。
4.根据权利要求1所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤a进一步包括1)吸取20ul蛋白酶K加入1.5mL离心管底部；2)加入患者血清200ul至1.5mL离心管；3)加200ul缓冲液AL至样品管，振荡器间隔振荡混勻15秒；4)置于56°C孵育10分钟，短暂离心1.5mL管以保证管壁及管盖内溶液流向管底；5)向上述混合液中加200ul无水乙醇至样本管，在振荡器上间隔混勻15秒，短暂离心， 混勻后重复步骤4的操作；6)混合液转移至QIAamp吸附柱置于是2mL收集管上，关盖，SOOOrpm离心1分钟；再将 QIAamp吸附柱转移至一个清洁的2mL收集管内，更换收集管；7)打开QIAamp吸附柱，向其中加入500ul缓冲液AWl，盖紧后8000rpm离心1分钟，将 液体弃掉；8)打开QIAamp吸附柱，向其中加入500ul缓冲液Aw2，关盖，HOOOrpm离心3分钟；9)将QIAamp吸附柱置于2mL收集管，12000rpm离心1分钟；标记1.5mL离心管，将QIAamp吸附柱置于洁净的1. 5mL的离心管中；10)打开QIAamp吸附柱加入50ul缓冲液AE或双蒸水，15_25°C下放置1分钟，12000rpm 离心1分钟；11)离心所得HBVDNA即为用于PCR扩增的模板DNA。
5.根据权利要求1所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤b中， PCR扩增的反应体系为30ii 1 PCR反应体系中，15 60ng模板DNA，9. Ommol I^Mg”， 1. 04mmol I^dNTPs，1. 8U Taq DNA 聚合酶，四种引物各 2umol I71。
6.根据权利要求1所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤b中，PCR扩 增为巢式PCR，其引物为外引物P1 5，AC(A)C(T)gAACATggAgAA (g)CA3，P2 :5， ggT(C)CT(G)A(G)TTT(A)ACAggC(A)AgTTT3'内引物RTPOS :gCCAAAATTCgCAgTCCC RTNEG :AAVCCCAAAAgACCCACA。
7.根据权利要求1所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤b中，PCR扩 增的反应条件为反应步骤反应条件保温37 °C, 5min预变性95 °C, 3min变性95°C, 10s退火50°C，20s延伸72°C，30s循环数50延伸72°C，5min冷却至4°C
8.根据权利要求1所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤c中，自PCR 反应产物中分离单链DNA及焦磷酸法测序的具体步骤为(1)将PCR产物30y L转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入磁珠3 u L和结合缓冲 液47 u L，震荡混勻lOmin ；(2)打开真空泵，将真空预装工具在超纯水中清洗30s，然后转移到96孔PCR板中，抓 取磁珠，分别在70%乙醇、变性缓冲液、洗涤缓冲液中清洗5 10s，再将其放入96孔测序 板中，该板中预先加入测序引物0. 3 u mol/L和退火缓冲液共45 u L，关闭真空泵，充分震荡 摇动，释放磁珠；(3)将放有样品的96孔测序板在80°C放置2min，自然冷却至室温后进行焦磷酸测序反应；(4)设定程序，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及4种碱基，将试剂舱和96孔 测序板放入机箱进行测序反应。
9.根据权利要求8所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤c的步骤(1)中，所述结合缓冲液中，进一步包括 IOmmol/L Tris-HCI ； 2mol/L NaCl ；lmmol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)； 0. 1% Tween 20 ； 所述结合缓冲液PH值为7.6。
10.根据权利要求8所述乙肝病毒耐药性检测方法，其特征在于，所述步骤c的步骤 (2)中，所述变性缓冲液包括0· 2mol/L NaOH ；所述洗涤缓冲液包括10mmol/L Tris-Acetate，其pH值为7. 6 ；所述退火缓冲液包括20mmol/L Tris-Acetate 和 2mmol/L Mg-Acetate,其 pH 值为`7. 6。
全文摘要
本发明公开了一种乙肝病毒耐药性检测方法，包括以下步骤血清HBVDNA提取；PCR扩增；自PCR反应产物中分离单链DNA及焦磷酸法测序。所述步骤b中，PCR扩增的反应体系为30μl PCR反应体系中，15～60ng模板DNA，9.0mmol·L-1Mg2+，1.04mmol·L-1dNTPs，1.8U Taq DNA聚合酶，四种引物各2μmol·L-1。其引物为外引物P15′AC(A)C(T)gAACATggAgAA(g)CA3′，P25′ggT(C)CT(G)A(G)TTT(A)ACAggC(A)AgTTT3′内引物RTPOSgCCAAAATTCgCAgTCCC，RTNEGAAVCCCAAAAgACCCACA。本发明乙肝病毒耐药性检测方法可检出低比例的耐药变异病毒，操作简便，可高通量检测，并可计算变异株比例。
文档编号C12Q1/70GK101892328SQ20101024224
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者冯鑫, 刑卉春, 成军, 杨松, 王 琦, 谢雯, 闫杰 申请人:北京地坛医院