专利名称：乙型肝炎病毒的耐药性的识别方法
技术领域：
本发明涉及通过确认乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子区域的基因型而识别HBV对拉米夫定(ラミブジン)等乙型慢性肝炎治疗药的耐药性的方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)的感染者，全世界估计已达到3亿人左右。HBV的感染引起急性和慢性肝炎(乙型肝炎)，并且导致肝硬化、肝癌。
乙型肝炎的诊断，除肝组织像以外，还使用ALT、HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBV聚合酶、HBV-DNA量等血清标记。其中，抗病毒药的疗效判定，重视血中HBV-DNA量。即HBV-DNA量明显下降或达到测定灵敏度以下、并长期维持该状态，其他指标也良好时，可判断为显示高度疗效。
HBV基因为由约3200碱基对组成的环状不完全双链DNA。该HBV基因的复制存在逆转录过程。复制过程大致可分成以下4个阶段。
①由细胞核内的内源性DNA聚合酶形成完全双链的环状DNA，并闭环而形成共价闭环双链DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的阶段。该cccDNA具有超螺旋结构。
②以cccDNA作模板由细胞的RNA聚合酶II转录成mRNA的阶段。其中最长的3.5Kb的RNA作为前基因组RNA，成为逆转录的模板。该RNA的5’和3’末端存在“ε”信号(衣壳化信号，encapsidation signal)，其中5’侧的信号对前基因组RNA和病毒聚合酶包装入核心的粒子内起着重要作用。
③经核心粒子内的依赖RNA的DNA聚合酶合成作为引物的寡核苷酸，以前基因组DNA作模板进行逆转录，合成(-)链DNA的阶段。
④以残留在前基因组RNA的5’末端的寡核苷酸作引物，以(-)链DNA作模板合成(+)链DNA的阶段。
一般认为通过抑制这些过程的某一个，使HBV的基因复制中止，便可抑制病毒的增殖。特别是HBV的复制存在逆转录过程，人免疫缺陷病毒(HIV)的增殖也有逆转录过程，因此开始筛选依赖RNA的DNA聚合酶抑制剂作为治疗药。
拉米夫定也特异性地抑制人免疫缺陷病毒(HIV)复制过程中的逆转录，当初作为HIV治疗药进行开发，但发现对HBV也有增殖抑制作用，自1992年开始作为乙型慢性肝炎的治疗药进行开发。
拉米夫定对HBV的作用机制并未清楚了解，但据认为有下列机制。拉米夫定是核苷(胞苷)衍生物类抗病毒药，在细胞内经磷酸化形成三磷酸衍生物，成为活性型。该药对HBV增殖的抑制机制之一是通过抑制依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)而抑制前基因组RNA的逆转录。
另一机制认为是被掺入病毒DNA链，中止其伸长。此外也有报告说，作为对免疫系统的间接影响，如果通过服用拉米夫定而引起病毒减少，则血流中的病毒蛋白减少，T细胞对HBV抗原便恢复低反应性(Boni C等，Journal of ClinicalInvestigation，102，968-975，1998)。
根据这样的作用机制，拉米夫定作为HBV感染症的治疗药已被广泛使用，但也存在血中病毒量难以减少的病例，其后出现耐药株和肝炎复发的问题的也很多。为了选择拉米夫定有效的病例，作为讨论病毒基因变化与疗效的关系的研究，主要是很多关于作为拉米夫定的靶的DNA聚合酶的B和C结构域的研究(Ono-Nita SK等，Hepatology，29，939-945，1999)(Allen MI等，Hepatology，27，1670-1677，1998)，探讨其他区域的报告很少。
而作为HBV基因型的研究，报告了比较HBs区域的序列，确定基因型A-D的基因型的例子(Journal of Medical Virology，2002，68，522-528)。该报告揭示，由于该基因型的不同，干扰素对HBr的疗效不同。此外，还报道了核心启动子区域的基因中HBV-DNA 1896位碱基G突变成A、1899位碱基G突变成A等。然而这些基因的变化，被认为不是病毒的基因型，而是感染后的突变，并且与HBV治疗的关系也不清楚(唐泽达信等、日本临床增刊号、分子肝炎病毒学基础·临床·预防下卷甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、1995年，52-57)。因此，虽然报告了核心启动子区域的基因突变，但没有报告该区域的突变是HBV基因型的概念。
非专利文献1Ono-Nita等Hepatology，29，939-945，1999非专利文献2Allen MI等Hepatology，27，1670-1677，1998非专利文献3Yuh等Journal of Virology，66，4073-4084，1992
非专利文献4Honigwachs等，Journal of Virology，63，919-924，1989非专利文献5Lopez-Cabrera等Proceedings of the national Academy of Sciences of theUnited States of America，87，5069-5073，1990非专利文献6唐泽达信等，日本临床增刊号、分子肝炎病毒学基础·临床·预防下卷甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、1995年，52-57。
发明的揭示HBV肝炎的药物治疗中，客观地了解该药物的效果与HBV的关系，对于治疗方针和药物的选择是有益的信息。本发明提供从基因工程角度得到对于HBV肝炎的治疗方针与药物选择有益的信息的方法。
本发明者假定HBV肝炎进行药物治疗时的效果受到病毒方面的因素的影响。新发现参与病毒增殖过程的基因型的不同，特别是HBV核心启动子区域的碱基序列的多样性与药物对HBV的效果差异有关，从而完成了本发明。
即，本发明为识别HBV的耐药性的方法，包括确认乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子领域的核酸序列中的基因突变。
而且，本发明还涉及通过分离精制血中的HBV-DNA、经PCR使HBV核心启动子区域扩增、确定碱基序列，从而鉴定影响药物疗效的核心启动子基因突变的方法。
本发明还涉及鉴定(检出)HBV核心启动子核酸序列的变化(突变)帮助预测以拉米夫定为代表的有依赖RNA的DNA聚合酶抑制作用的药物治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的效果的方法。特别通过鉴定(检出)HBV核心启动子核酸序列的至少一个突变，帮助预测给药后血中HBV量的下降。
本发明还涉及鉴定(检出)HBV核心启动子核酸序列的特定部分的序列(例如序列编号2、序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6、序列编号7记载的序列)的至少一个突变的方法，较好是鉴定(检出)序列编号1记载的7位核酸C、28位核酸T、33位核酸A、57位核酸A、73位核酸T、106位核酸A、107位核酸T、200位核酸A、250位核酸G或253位核酸G中的任一个或者一个以上的核酸的变化的方法。
更好的是本发明涉及鉴定(检出)序列编号1记载的7位核酸C变为T、或28位核酸T变成C、或33位核酸A变成G、或57位核酸A变成G或C、或73位核酸T变为G、或106位核酸A变为T或C或G、或107位核酸T变为C或G、200位核酸A变为T或C、250位核酸G变为A、253位核酸G变为A中的任一个或者一个以上的突变的方法。一般认为HBV的耐药性或敏感性的不同起因于HBV基因型的种类的不同。因此，本发明提供HBV的核心启动子存在上述任一突变的HBV的基因型，提供利用该基因型的耐药性预测方法。本发明还提供鉴定HBV基因型的方法。
本发明的鉴定(检出)基因突变的方法包括确定核酸序列的方法。还包括以核酸作为探针或引物使核酸相互形成双链(杂交)的方法。
本发明还提供用于检出上述HBV核心启动子区域的基因突变的诊断剂、诊断试剂盒。
本发明还涉及利用具有HBV核心启动子的序列编号1或其一部分的基因序列的核酸的新型HBV治疗药。该核酸作为诱饵核酸，使HBV核心启动子的野生株基因序列特异性地结合于作为靶的蛋白质，阻碍原来的靶即HBV自身的核心启动子与该蛋白质结合，从而具有拮抗作用。因此，通过将本发明的诱饵核酸给予机体，可抑制HBV核心启动子的转录，从而抑制HBV的增殖。
关于HBV的核心启动子区域，各报告多少有些差异，基本上将转录开始部位的上游约200bp作为核心启动子区域进行鉴定(Yuh CH，等，Journal ofVirology，66，4073-4084，1992；Honigwachs J等，Journal of Virology，63.919-924，1989；Lopez-Cabrer M等，Proceedings of the national Academyof Sciences of the United States of America，87，5069-5073，1990)。
本发明为了便于说明，将HBV的双链DNA的限制酶EcoRI部位GAATTC的第一个T作为核酸编号1来表示碱基序列的编号。使用该简便的编号时，本发明所说的HBV核心启动子区域规定为从核酸编号1631到核心蛋白起始氨基酸的核酸编号1900。
该区域存在着对增殖很重要的增强子II区域(Enh II)及将前基因组RNA包入核心粒子内所必需的衣壳化信号(ε)区域，成为HBV的DNA聚合酶和肝细胞特异性核内因子的结合部分，因此认为一旦发生突变，会使病毒的增殖、复制发生重要变化。该ε区域对于HBV的DNA聚合酶的引发和逆转录活性是必需的(Urban M.，等Journal of General Virology(1998)，79，1121-2231)。此外，增强子II区域(Enh II)中存在着以足迹法(footprinting)或者甲基化干扰分析(methylation interference)鉴定的足迹II或Boxα、足迹I、Boxβ的调节元件。
本发明着眼于结合聚合酶等的区域，以及对病毒基因复制的调节起重要作用的增强子区域，鉴定对乙型肝炎的治疗药、特别对拉米夫定的疗效产生影响的核心启动子的基因突变。
根据本发明检出对乙型慢性肝炎患者的治疗前诊断有用的HBV核心启动子的基因突变，可对耐药株和肝炎复发少的テイラ一メ一ド医疗作出贡献，并可开发新的诊断剂。此外，由于能鉴定以拉米夫定等逆转录抑制剂难于取得疗效的病毒，因此通过使用这样的突变病毒序列可开发对此类病毒也有较高疗效的新型抗HBV药物。
本发明具体为包括确认核心启动子区域的核酸序列而鉴定HBV的基因突变在内的方法。该区域对病毒增殖是重要的部位，由于基因序列的不同，对于用于HBV治疗的药物的敏感性不同，本发明者的研究推论证明了这一关系。该研究过程中发现通过确认核心启动子区域中6个短的区域、并且是其中特定的核酸序列的变化，可简便地识别HBV耐药性的不同。
以下，以具有代表性的HBV治疗药拉米夫定为例说明本发明，但本发明并不仅限于拉米夫定的治疗。
用具有代表性的治疗药拉米夫定治疗HBV，在显示血中病毒量的HBV-DNA量以及反映肝细胞内病毒量的标记即HBe抗原量的高效价病例中存在很多病毒量难以减少的病例，很多在其后出现耐药株和肝炎复发的问题。
然而，在HBV-DNA量和HBe抗原量的高效价病例中也存在拉米夫定奏效、血中HBV-DNA量迅速减少、肝炎静止化的病例。
本发明者用接受拉米夫定治疗的乙型慢性肝炎患者的治疗前血清和治疗开始6个月后的血清，以TMA法测定血中的HBV-DNA量，在治疗6个月后HBV-DNA量下降至检出限以下(5000拷贝/ml以下)时，判定为病毒阴性组，在检出限以上时作为病毒阳性组，通过差异显著性检定寻找预后因子。
然后，通过六波罗等的方法(Journal of Medical Virology，62，471-478，2000)，用市售的核酸提取试剂盒从采集的治疗前血清样本提取HBV-DNA，以PCR法使HBV核心启动子区域扩增，在3％琼脂糖凝胶中进行电泳后，从凝胶中切出阳性条带，精制核酸，用直接测序法确定碱基序列。再将治疗前的核心启动子区域的碱基序列与野生株比较，选出发生基因突变的部位，对治疗6个月后的病毒阳性组与阴性组进行指标的差异显著性检定，分析可预测拉米夫定疗效的基因突变部位。
其结果是，发现以前报告的HBe抗原阳性、HBV-DNA量可作为有意义的预后标记，但年龄、性别、以往病史、病型、血小板值、白蛋白值、ALT值、胆红素值未见显著差异。分析核心启动子区域的基因突变，检出3个位置上与拉米夫定治疗效果有显著相关性的基因突变。
而且，该HBV核心启动子区域的基因突变至少有一个时，也发现6个月后的病毒阳性组与阴性组之间有显著差异(P＜0.0001)，证明通过确认该突变可以预测拉米夫定的疗效。可认为有该基因突变的HBV与没有该突变的HBV是不同基因型的HBV。该基因型的不同可能与HBV的增殖能力等生物学机能相关。
这样，已阐明本发明的HBV核心启动子区域的突变与跟HBV的DNA聚合酶和肝细胞特异性核内因子有关的HBV增殖、复制的抑制效果相关，通过鉴定该变异，可促使拉米夫定治疗的有效率提高。因而，HBV的核心启动子区域的基因突变可用作拉米夫定治疗效果的预测标记。
发明的实施方式本发明的基因突变的鉴定(检出)方法，例如可通过确定HBV的核心启动子区域的核酸序列而进行。确定核酸序列的方法基本上使用Maxam及Gilbert法或双脱氧法的改良法。其详细解说见《Molecular CloningA Laboratory Manual，ThirdEdition(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)》或《新生化学实验讲座2核酸II构造与性质，p.59-100》。此外，许多厂商销售各种试剂盒，也可以加以利用。
确定核酸序列所用的DNA，可以用PCR使本发明的核心启动子区域扩增，直接用直接测序法确定核酸序列。也可以将PCR产物一次克隆进载体之后确定序列。或者可以使用发现点突变的测序法。
本发明的核酸序列的突变的检出方法，除确定基因序列以外，也可使用能检出一个至几个碱基的不同的任何方法。例如，可利用SSCP、DGGE、CFLP、RFLP等基因突变的检出法。此外，还可利用用于一碱基突变的SNP的检出的invader法。另外，利用互补核酸形成双链的杂交原理的突变检出法也可被使用。这些基因、核酸突变的检出法，有使用探针或引物的方法或者将两者组合的方法。这些探针或引物不限于核酸，包括可与靶核酸通过杂交而结合的探针或引物。
以下的实施例是本发明的例证，但本发明的范围不限于这些。
实施例<实施例1>与拉米夫定治疗和病毒转阴有关的预后因子的寻找给慢性乙型肝炎感染患者53人(男性40例，女性13例，平均年龄49.8±9.4岁，慢性肝炎38例，肝硬化15例)连日口服拉米夫定，每日100mg，分析给药前的数据和给药后的数据。服用拉米夫定6个月时，用TMA法测定的HBV-DNA降至低于灵敏度(3.7LGE/ml以下)时，判定为病毒转阴。
对于病毒阴转和仍为阳性的患者的年龄、性别、HBeAg阳性率、治疗前的HBV-DNA量、以往病史、病型、血小板值、白蛋白、ALT、胆红素值等，以Fisher的直接法、Mann-Mhitney U检定法检定差异的显著性，探讨其是否可成为疗效的预测因子。
表1
根据表1找出以前报告的HBe抗原阳性、HBV-DNA量可作为有意义的预后标记，而年龄、性别、以往病史、病型、血小板值、白蛋白值、ALT值、胆红素值未见显著差异。
<实施例2>确定HBV核心启动子区域的碱基序列在实施例1进行拉米夫定治疗的53例中，从43例的治疗前患者血清50μl中用DNA提取试剂盒(スマイテスト，(株)ゲノムサイエンス研究所)按使用说明提取病毒NDA。
在反应液(200μM dNTP，50mM KCl，10mM Tris·HCl[pH 8.3]，2.0mM MgCl2，0.001％明胶)25μl中加入提取的DNA 2μl、0.5U的AmpliTaq Gold(PE appliedBiosystems)，用下列引物各0.25mM进行扩增，即，is 25’-GAG ACC ACC GTG ACCGCC CA(1611-1630)和CB45’-AAA AGA GAG TAA CTC CAC AG(1954-1935)。
PCR方案是在预热后进行94℃30秒、55℃1分钟的循环，重复43个循环。循环变温加热器使用DNA Engine(MJ Research Corp.Watertown，MA)。PCR阴性样本是用outer primer set进行第一次PCR后，第二次PCR重复30个循环。该PCR阴性的样本是用es25’-ACG TCG CAT GGA GAC CAC CG(1601-1620)、CB25’-GGAAAG AAG TCA GAA GGC AA(1974-1955)作为outer primer set进行第一次PCR后，用is2和CB4这两个引物重复30个循环，进行第二次PCR。
该PCR产物以3％琼脂糖凝胶进行电泳后，从凝胶切出条带，用GFX PCR DNA andGel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia Biotec Inc)精制。测序则采用双脱氧法，用Taq Dye Deoxy Terminator cycle sequencing kit使之反应，以fluorescent DNA sequencer(Applied Biosystems)进行分析。确定了序列的43例患者的核心启动子区域序列如
图1-1～图1-3表示。
H5至262共31个样本是经拉米夫定治疗6个月后血中DNA量减少到检出限以下的患者的序列。A17至A5共11个样本是DNA未减少到检出限以下、拉米夫定的疗效小的患者的序列。
各图最上面一列表示作为基础的序列(野生型)的序列。可见各图上面31个样本和下面12个样本其序列存在差异。并可见其不同集中于一定的区域。拉米夫定有效组(有效组)中，碱基编号1671～1682位的区域(序列编号2)有较多样本具有与作为基础的序列不同的序列。特别是1674位(序列编号1的28位)的核酸T变为C、1679位(序列编号1的33位)的A变为G，而拉米夫定无效组(无效组)未见这样的变化。
此外，拉米夫定有效组中，在碱基编号1701～1721位的区域(序列编号3)有较多样本具有与作为基础的序列不同的序列。特别是1703位(序列编号1的57位)的核酸A变成C或G、1719位(序列编号1的73位)的T变为G，在拉米夫定不显现治疗效果的无效组未见这样的变化。
同样，在有效组中碱基编号为1736～1761位的区域(序列编号4)有较多样本具有与作为基础的序列不同的序列。特别是1752位(序列编号1的106位)的核酸A变为T或C或G，1753位(序列编号1的107位)的T变成G或C，在无效组未见这样的变化。
此外，有效组中碱基编号1799～1817的区域(序列编号5)有较多样本具有与作为基础的序列不同的序列，在1802位、1803位、1809位、1810位、1811位、1812位、1814位出现变化，而无效组未见这样的变化。并且，有效组在1843～1860位的区域(序列编号6)有较多样本具有与作为基础的序列不同的序列。特别是1846位(序列编号1的200位)的核酸A变为T或C，在无效组未见这样的变化。有效组在1893～1902位的区域(序列编号7)有较多样本具有与作为基础的序列不同的序列。特别是1896位(序列编号1的250位)的核酸G变为A、1899位(编号1的253位)的G变为A，在无效组未见这样的变化。
<实施例3>根据核心启动子区域的基因突变进行分析(A)根据基因突变部位进行统计分析再按实施例1的方法，对有效患者9人和无效患者2的样本确定核心启动子区域的序列，考虑总共53个样本的拉米夫定的疗效与核酸序列变化(突变)的关系，用Fisher的直接法检定差异的显著性。表2表示有显著差异的突变以及阳性组未见、而在转阴组出现的突变。
表2
表2的转阴组(n＝40)是拉米夫定治疗有效组，阳性组(n＝13)是拉米夫定治疗无效组。因此显示几个点出现显著差异。
此外，对于核心启动子突变(A1762T、G1764A)，转阴组、阳性组分别有82.5％、84.6％，未见显著差异。
(B)整个核心启动子区域的突变的统计分析对于出现表2所示的核酸变化的样本和完全未见变化的样本是否能预测拉米夫定的疗效，以Fisher的直接法检定差异的显著性。
表3
P＜0.0001出现某一变化的患者，53人中有38人，其中35人的拉米夫定治疗具有效果。而一个变化也未见的患者有15人，其中10人未见疗效。这表明该核心启动子区域的核酸序列的变化与拉米夫定疗效有显著关联。拉米夫定具有抑制依赖RNA的DNA聚合酶的作用，可认为其参与HBV的增殖抑制。
根据本发明，通过在治疗前或治疗中检出病毒基因突变，可预测以拉米夫定为代表的HRV治疗的效果，提高治疗成绩或者可预期控制耐药株和肝炎复发等的效果。
附图的简单说明图1-1表示进行拉米夫定治疗的患者的HBV核心启动子区域的核酸序列的比较。最上列表示作为基础的序列，上面31个样本表示拉米夫定有疗效的样本，下面12个样本表示无治疗效果的样本。
图1-2表示进行拉米夫定治疗的患者的HBV核心启动子区域的核酸序列的比较。最上列表示作为基础的序列，上面31个样本表示拉米夫定有疗效的样本，下面12个样本表示无治疗效果的样本。
图1-3表示进行拉米夫定治疗的患者的HBV核心启动子区域的核酸序列的比较。最上列表示作为基础的序列，上面31个样本表示拉米夫定有疗效的样本，下面12个样本表示无治疗效果的样本。
序列表<110>株式会社先端生命科学研究所(Advanced Life Science Institute，Inc.)<120>乙型肝炎病毒的耐药性的识别方法<130>SAP 705-PCT<150>JP 2002359372<130>2002-12-11<160>7<210>1<211>299<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>1gtcttacata agaggactct tggactctca gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac 60ttcaaagact gtttgtttaa agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc 120tttgtactag gaggctgtag gcataaattg gtctgttcac cagcaccatg caactttttc 180acctctgcct aatcatctca tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg 240ggtggctttg gggcatggac attgacccgt ataaagaatt tggagcttct gtggagtta 299<210>2<211>12<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>2ctctcagcaa tg12<210>3<211>21<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400>3gcatacttca aagactgttt g 21<210>4<211>27<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>4ggagttgggg gaggagatta ggttaaa 27<210>5<211>19<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>5ctgttcacca gcaccatgc19<210>6<211>18<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>6ctcatgttca tgtcctac18<210>7<211>12<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>7gctttggggc at1权利要求
1.识别HBV耐药性的方法，其特征在于，确认乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子区域的核酸序列中的基因突变。
2.如权利要求1所述的方法，其特征还在于，乙型肝炎病毒(HBV)的耐药性是对具有依赖RNA的DNA聚合酶抑制作用的药物的耐药性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征还在于，具有依赖RNA的DNA聚合酶抑制作用的药物是拉米夫定。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征还在于，核心启动子区域的核酸序列是序列编号1记载的序列。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征还在于，确认HBV核心启动子区域的核酸序列内的相当于序列编号2、序列编号3、序列编号4、序列编号5、编号6或序列编号7所示的核酸序列的部分序列的至少一部分中的基因突变。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征还在于，确认序列编号1的7位核酸C、28位核酸T、33位核酸A、57位核酸A、73位核酸T、106位核酸A、107位核酸T、200位核酸A、250位核酸G或253位核酸G中的任一个或一个以上的核酸发生了变化的基因突变。
7.如权利要求6所述的方法，其特征还在于，确认序列编号1记载的7位核酸C变为T、28位核酸T变为C、33位核酸A变为G、57位核酸A变为G或C、73位核酸T变为G、106位核酸A变为T或C或G、107位核酸T变为C或G、200位核酸A变为T或C、250位核酸G变为A或253位核酸G变为A中的任一个或一个以上的基因突变。
8.鉴定HBV基因型的方法，其特征在于，HBV基因型具有序列编号1记载的7位核酸C、28位核酸T、33位核酸A、57位核酸A、73位核酸T、106位核酸A、107位核酸T、200位核酸A、250位核酸G或253位核酸G中的任一个或一个以上的核酸的基因突变。
9.鉴定HBV基因型的方法，其特征在于，HBV基因型具有序列编号1记载的7位核酸C变为T、28位核酸T变为C、33位核酸A变为G、57位核酸A变为G或C、73位核酸T变为G、106位核酸A变为T或C或G、107位核酸T变为C或G、200位核酸A变为T或C、250位核酸G变为A或253位核酸G变为A中的任一个或一个以上的基因突变。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其特征还在于，通过确定HBV的碱基序列进行基因突变的确认或基因型的鉴定。
11.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其特征还在于，通过使用了探针或引物的方法进行基因突变的确认或基因型的鉴定。
12.HBV治疗药，其特征在于，使用了由序列编号1～7中任一项所述的核酸序列或其一部分组成的核酸。
全文摘要
提供HBV耐药性的简便识别方法。该识别HBV耐药性的方法就是确认乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子区域的核酸序列中的基因突变。
文档编号C12N15/51GK1726287SQ20038010591
公开日2006年1月25日 申请日期2003年12月10日 优先权日2002年12月11日
发明者六波羅明紀, 松本晶博, 田中栄司, 清澤研道 申请人:株式会社先端生命科学研究所