专利名称：发酵木糖的真核细胞的代谢工程的制作方法
技术领域：
本发明涉及真核宿主细胞中的进一步遗传修饰，所述真核宿主细胞已经被转化而 表达赋予宿主细胞使木糖异构为木酮糖的能力的木糖异构酶。所述进一步遗传修饰目的在 于改善木糖代谢的效率，包括例如降低非特异性醛糖还原酶活性、增加木酮糖激酶活性及 增加磷酸戊糖途径的流量(flux)。本发明的修饰的宿主细胞适于在包含木糖作为碳源的各 种方法中生产各种发酵产物。
背景技术：
从植物生物量的半纤维素成分生产经济学可行的乙醇需要戊糖和己糖以同等比 率及高产量同时转化。酵母，特别是糖酵母物种(Saccharomyces spp.)，是用于这一方法的 最合适的候选物，因为它们在己糖上既可以需氧也可以厌氧地快速生长。另外，它们与(遗 传修饰的)细菌相比对于木质纤维素水解产物的毒性环境更具抗性。在先前的研究中有证据表明为了利用木糖而对酿酒酵母(S. cerevisiae)进行 的代谢工程应基于引入木糖异构酶(XI，EC5.3. 1.5) (Bruinenberg et al. (1983，Eur J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 18 :287_292))。与基于木糖还原酶(XR, EC 1. 1. 1. 21)和 木糖醇脱氢酶(XD，EC 1.1.1.9)的酵母株相反，表达XI活性的酵母株显示高醇产量及几 乎不产生木糖醇，如最近的 WO 03/0624430 和 Kuyper et al. (2004，FEMS Yeast Res. 4 655-664)所证实。从理论上看这不令人惊奇，因为经过XR和XD的途径导致NADH平衡受 阻，其可以在无氧条件下例如通过形成木糖醇而缓解。WO 03/0624430揭示了将功能性Piromyces XI导入酿酒酵母中使得通过由XKSl 编码的内源木酮糖激酶(EC 2. 7. 1. 17)及磷酸戊糖途径的非氧化部分的酶而减缓木糖的 代谢，并赋予该酵母转化体在木糖上生长的能力。Kuyper等(如前述)描述了其中已经导入Piromyces XI并且之后在摇瓶中进行 定向进化的酿酒酵母株显示出改良的木糖发酵速率，但是仍需要氧以生长。通过在木糖过 量的条件下的极度限氧方案进行进一步选择，并随后进行厌氧选择，产生了实验室酵母株 (RWB202-AFX)，其达到利用半纤维素的至少一个必要条件，即利用木糖产生可接受的乙醇 产量。然而，这个酵母株中乙醇产生的比速率仍是无法接受地低。特别地，在木糖上生长期 间的糖消耗比速率(345mg木糖/g生物量/小时)仍比在葡萄糖上生长低10倍。迄今为 止通过进化工程进一步改良酵母株RWB202-AFX的尝试仍未成功。WO 03/0624430列出了许多替代性遗传修饰，它们可以导致在表达Piromyces XI 基因的宿主细胞中利用木糖进行的乙醇产生和/或糖消耗的比速率进一步改进至商业利 用半纤维素所需的水平。这些替代性遗传修饰包括(a)提高木糖至宿主细胞中的转运; (b)增强木酮糖激酶活性；(c)增加磷酸戊糖途径的流量；(d)降低对于分解代谢物抑制的 敏感性；(e)增强对乙醇、渗透压(osmolarity)或者有机酸的耐受；以及(f)降低副产物(例如木糖醇、甘油和/或乙酸)的产生。更特别地，WO 03/0624430建议过表达编码己糖 或者戊糖转运蛋白、木酮糖激酶(如酿酒酵母XKS1)、磷酸戊糖途径的酶如转醛醇酶(TALl) 或转羟乙醛酶(TKLl)、糖酵解酶、产乙醇酶如醇脱氢酶的一或多种基因，和/或失活己糖激 酶基因例如酿酒酵母HXK2基因、酿酒酵母MIGl或MIG2基因、(非特异性)醛糖还原酶基 因如酿酒酵母GRE3基因或者参与甘油代谢的酶的基因如酿酒酵母甘油-磷酸脱氢酶1和/ 或2基因。然而WO 03/0624430未揭示这些替代方案中哪些在携带Piromyces XI基因的 宿主细胞中确实使乙醇产量和/或木糖消耗的比速率改进。Karhumaa et al. (2004, “ Development of a Xylose-growing Saccharomyces cerevisiae strain expressing bacterial xylose isomerase“ ， Poster presentation at the second meeting on Physiology of Yeasts and Filamentous Fungi ；March 24-28 2004 Anglet,France. Page 43 ；and,2004, " New Xylose-growing Saccharomyces cerevisiae strain for biofuel ethanol production “ ， Oral presentation at the 26th Symposium on Biotechnology for fuels and chemicals, May 9—12,2004 Chattanooga (TN)，USA. Page 19)揭示了一种表达嗜热栖热菌(Thermus thermophi lus)细 菌XI的酿酒酵母菌株。该菌株进一步含有WO 03/0624430中建议的许多遗传修饰木酮糖 激酶及非氧化的磷酸戊糖途径的所有四种酶的过表达以及酿酒酵母非特异性醛糖还原酶 基因(GRE3)的失活。然而，尽管存在这些遗传修饰，但是这个菌株在木糖上还是不能生长。 只有在适应在木糖上需氧生长之后，才获得能在木糖上具有低速率生长(μ = O.CMh—1)及 低木糖消耗比速率(4. 3mg木糖/g细胞/小时)的菌株TMB3050。由于(在适应期间积累 的)未确定的遗传修饰0对于在木糖上生长是首先明确需要的，因此技术人员从Karhumaa 等的工作中不能推导出哪些已确定的遗传修饰(如木酮糖激酶或者磷酸戊糖途径的任何 酶的过表达或者醛糖还原酶基因的失活)确实有助于经适应的菌株在木糖上生长的能力。因此本发明的一方面提供了用XI基因转化的真核宿主细胞，如真菌宿主细胞，所 述XI基因赋予宿主细胞在木糖上生长的能力，并且所示宿主细胞具有适于商业应用的木 糖消耗和/或产物(乙醇)形成的比速率。发明描述^X木糖异构酶本文所用术语“木糖异构酶”(EC 5. 3. 1. 5)是指催化D-木糖直接异构为D-木酮 糖以及相反过程的酶。所述酶也称为D-木糖酮异构酶(D-xylose ketoisomerase)。一些 木糖异构酶也能催化D-葡萄糖与D-果糖之间的转化，因此有时也称作葡萄糖异构酶。木 糖异构酶需要二价阳离子如镁或者锰作为辅因子。本发明的木糖异构酶可通过下文所述的 其氨基酸序列而进一步定义。同样，木糖异构酶也可以通过编码该酶的核苷酸序列以及与 编码下文描述的木糖异构酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列而定义。木糖异构酶活性单位(U)在本文是指在Kuyper et al. (2003, FEMS Yeast Res. 4 69-78)所述条件下，每分钟产生Inmol木酮糖的酶量。木酮糖激酶本文所用术语“木酮糖激酶” (EC 2. 7. 1. 17)是指催化ATP+D-木酮糖=ADP+D-木 酮糖5-磷酸反应的酶。该酶也称作磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或者ATP:D-木酮糖
55_磷酸转移酶。本发明的木酮糖激酶可通过下文所述的其氨基酸序列而进一步定义。同 样，木酮糖激酶也可以通过编码该酶的核苷酸序列以及与编码下文所述木酮糖激酶的参考 核苷酸序列杂交的核苷酸序列而定义。木酮糖激酶活性单位在实施例1. 13中详细定义。核酮糖5-磷酸差向异构酶本文所用术语“核酮糖5-磷酸差向异构酶”(5. 1. 3. 1)是指催化D-木酮糖5_磷 酸差向异构为D-核酮糖5-磷酸以及相反过程的酶。该酶也称作磷酸核酮糖差向异构酶、 赤藓糖-4-磷酸异构酶、磷酸戊酮糖3-差向异构酶、木酮糖磷酸3-差向异构酶、磷酸戊酮 糖差向异构酶、核酮糖5-磷酸3-差向异构酶、D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶、D-核酮糖 5-磷酸差向异构酶、D-核酮糖-5-P 3-差向异构酶、D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、戊 糖-5-磷酸3-差向异构酶、或者D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。本发明的核酮糖5-磷 酸差向异构酶可以通过下文描述的其氨基酸序列进一步定义。同样，核酮糖5-磷酸差向异 构酶可以通过编码该酶的核苷酸序列以及与编码下文描述的核酮糖5-磷酸差向异构酶的 参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列而定义。核酮糖5-磷酸异构酶本文所用术语“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC 5. 3. 1. 6)是指催化D-核糖5_磷酸 直接异构为D-核酮糖5-磷酸以及相反过程的酶。该酶也称作磷酸戊糖异构酶、磷酸核糖 异构酶、核糖磷酸异构酶、5-磷酸核糖异构酶、D-核糖5-磷酸异构酶、D-核糖-5-磷酸酮 醇_异构酶、或者D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。本发明的核酮糖5-磷酸异构酶 可以通过下文描述的其氨基酸序列进一步定义。同样，核酮糖5-磷酸异构酶可以通过编码 该酶的核苷酸序列以及与编码下文描述的核酮糖5-磷酸异构酶的参考核苷酸序列杂交的 核苷酸序列而定义。转羟乙醛酶本文所用术语“转羟乙醛酶”(EC 2. 2. 1. 1)是指催化如下反应以及相反过程的 酶D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸一景天庚酮糖7_磷酸+D-甘油醛3_磷酸该酶也称作甘油醛转移酶或者景天庚酮糖-7-磷酸D-甘油醛-3-磷酸甘油醛转 移酶。本发明的转羟乙醛酶可以通过下文描述的其氨基酸序列进一步定义。同样，转羟乙 醛酶可以通过编码该酶的核苷酸序列以及与编码下文描述的酮糖转移酶的参考核苷酸序 列杂交的核苷酸序列而定义。转醛醇酶本文所用术语“转醛醇酶”(EC 2. 2. 1. 2)是指催化如下反应以及相反过程的酶景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸μ D-赤藓糖4_磷酸+D-果糖6_磷酸该酶也称作二羟基丙酮转移酶、二羟基丙酮合酶、甲醛转羟乙醛酶、或者景天庚酮 糖-7-磷酸D-甘油醛-3-磷酸甘油转移酶(glyceronetranserase)。本发明的转醛醇酶 可以通过下文描述的其氨基酸序列而进一步定义。同样，转醛醇酶可以通过编码该酶的核 苷酸序列以及与编码下文描述的转醛醇酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列而定义。醛糖还原酶本文所用术语“醛糖还原酶”(EC 1. 1. 1. 21)是指能将木糖或木酮糖还原为木糖醇 的任何酶。在本发明中，醛糖还原酶可以是本发明宿主细胞天然(内源)的并且能将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何非特异性醛糖还原酶。非特异性醛糖还原酶催化如下反应醛糖+NAD (P) H+H+ 醛醇 +NAD (P)+所述酶具有广泛特异性，也称作醛糖还原酶、多醇脱氢酶(NADP+)、醛醇NADP氧 化还原酶、醛醇NADP+ 1-氧化还原酶、NADPH-戊醛糖还原酶、或者NADPH-醛糖还原酶。 这种非特异性醛糖还原酶特别例如是酿酒酵母内源的并且由GRE3基因编码的酶( TrSff etal.，2001，Appl. Environ. Microbiol. 67 5668-74)。因此，本发明的醛糖还原酶可以通过 下文描述的其氨基酸序列进一步定义。同样，醛糖还原酶也可以通过编码该酶的核苷酸序 列以及与编码下文描述的醛糖还原酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列而定义。序列相同件与相似件本发明所述的序列相同性是两或多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两或多 个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，通过序列对比而确定。在本领域中，“相同性”也意 味着氨基酸或者核酸序列之间的序列关联性程度，可以通过这种序列链之间的匹配而确 定。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过将一个多肽与另一个多肽的氨基酸序列及其 保守的氨基酸取代物进行对比而确定。“相同性”和“相似性”可以通过已知方法容易地计 算，所述方法包括但不限于如下文献所述方法Computational Molecular Biology，Lesk， Α. Μ. , ed. , Oxford University Press, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects,Smith,D. W. ,ed. ,Academic Press,New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H.G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G. , Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M. and Devereux,J. ,eds. ,M Stockton Press, New York,1991 ； R Carillo, H. ， and Lipman, D. ， SIAM J. Applied Math. ,48 1073(1988)。确定相同性的优选方法是给出测试序列之间的最大匹配。确定相同性和相似性的 方法编程在可公开获得的计算机程序中。确定两个序列之间相同性和相似性的优选计算机 程序方法包括例如 GCG 程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1) 387(1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN 及 FASTA (Altschul，S. F. et al.，J. Mol. Biol. 215 403-410(1990)。BLAST X 程序可公开得自 NCBI 及其它来源(BLAST Manual, Altschul, S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894 ；Altschul, S.，et al.，J. Mol. Biol. 215 403-410(1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定相同性。进行多肽序列对比的优选参数包括如下参数Algorithm =Needleman and ffunsch,J. Mol. Biol. 48 443-453(1970) ；Comparison matrix :BL0SSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 10915-10919(1992) ；Gap Penalty 12 ； Gap Length Penalty :4。含有这些参数的可用的程序是可公开获得的程序，如得自位于 Madison，WI的Genetics Computer Group的Ogap程序。前述参数是进行氨基酸对比的默 认参数(以及末端间隔无罚分)。进行核酸对比的优选参数包括如下参数Algorithm :Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443_453 (1970) ；Comparison matrix :matches = +10, mismatch = O ；Gap Penalty 50 ；Gap Length Penalty :3。可获得的如得自位于 Madison，Wis 的 Genetics Computer Group的Gap程序。上述是进行核酸对比的默认参数。
任选地，在确定氨基酸相似性的程度中，技术人员也可以考虑所谓的“保守”氨基 酸取代，这对于技术人员是明了的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。 例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂 肪族_羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰 胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧 链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲 硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是缬氨酸_亮氨酸_异亮氨酸，苯丙氨酸_酪氨酸，赖 氨酸_精氨酸，丙氨酸_缬氨酸，及天冬酰胺_谷氨酰胺。本发明揭示的氨基酸序列的取代 变体是揭示的序列中至少一个残基已经被除去并在其位置插入一个不同残基的氨基酸序 列。优选地，所述氨基酸改变是保守的。每个天然发生的氨基酸的优选保守取代如下Ala 变为ser ；Arg变为Iys ；Asn变为gin或his ；Asp变为glu ；Cys变为ser或ala ；Gln变为 asn ；Glu 变为 asp ；Gly 变为 pro ；His 变为 asn 或 gin ；Ile 变为 Ieu 或 val ；Leu 变为 ile 或 val ；Lys 变为 arg、gin 或 glu ；Met 变为 Ieu 或 ile ；Phe 变为 met、Ieu 或 tyr ；Ser 变为 thr ；Thr 变为 ser ；Trp 变为 tyr ；Tyr 变为 trp 或 phe ；及 Val 变为 ile 或 leu。杂交氨基酸序列编码本发明的酶的核苷酸序列也可以通过其在中等或者优选在严格杂交条件下 分别与SEQ ID NO :9-16和18的核苷酸序列杂交的能力而定义。本文所述严格杂交条件是 使至少大约25个、优选大约50、75、或100个、最优选大约200或更多个核苷酸的核酸序列 在大约65°C温度，在包含大约IM盐、优选6XSSC或者具有相当的离子强度的任何其它溶液 中杂交，并且在65°C在包含大约0. IM盐或者更低浓度、优选0.2XSSC或具有相当的离子强 度的任何其它溶液中洗涤。优选地，所述杂交是过夜进行，即至少10小时，优选洗涤是用至 少更换两次的洗涤溶液洗涤至少1小时。这些条件通常允许具有大约90%或者更高序列相 同性的序列特异性杂交。本文所述中等条件是使得至少50个、优选大约200或更多个核苷酸的核酸序列在 大约45°C在包含IM盐、优选6XSSC或者具有相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，并且 在室温在包含大约IM盐、优选6XSSC或具有相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优 选地，所述杂交是过夜进行，即至少10小时，优选洗涤是用至少更换两次的洗涤溶液洗涤 至少1小时。这些条件通常允许具有高至50%序列相同性的序列特异性杂交。本领域技术 人员能修改这些杂交条件以特异性鉴别相同性在50% -90%之间变化的序列。可操纵地连接如本文所用，术语“可操纵地连接”是指多核苷酸元件以功能关系而连接。当一个 核酸与另一个核酸序列以功能关系放置时，该核酸被“可操纵地连接”。例如，如果启动子或 增强子影响编码序列的转录，则其与编码序列的连接是可操纵地连接。可操纵地连接是指 被连接的DNA序列典型是相邻的，并且在需要之处相邻地及符合读框地连接两个蛋白质编 码区。启动子如本文所用，术语“启动子”是指控制一或多个基因转录的核酸片段，位于基因的 转录起始位点的转录方向的上游，通过存在如下结构而在结构上加以鉴别DNA依赖性RNA 聚合酶的结合位点、转录起始位点及任何其它DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、本领域技术人员已知的直接或间接调节所述启动子的 转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启 动子。“可诱导的”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。MM术语“同源”当用于描述给定的(重组)核酸或者多肽分子与给定的宿主生物体 或宿主细胞之间的关系时，是指所述核酸或多肽分子是由相同物种、优选相同品种或菌株 的宿主细胞或者生物体天然产生的。如果与宿主细胞同源，则编码多肽的核酸序列典型地 与另一启动子序列可操纵地连接，或者如果可行，与其天然环境之外的另一分泌信号序列 和/或终止子序列可操纵地连接。当用于描述两个核酸序列之间的关联性时，术语“同源” 是指一个单链核酸序列可以与互补的单链核酸序列杂交。杂交程度依赖于许多因素，包括 序列之间相同性的量及杂交条件，如后文讨论的温度和盐浓度。优选地，相同性区域多于大 约5bp，更优选相同性区域多于10bp。碰术语“异源”当用于描述核酸(DNA或RNA)或者蛋白质时，是指核酸或蛋白质不是 其所处的生物体、细胞、基因组或者DNA或RNA序列的天然发生的一部分，或者所述核酸或 蛋白质是在与其天然发现的不同的细胞或者基因组或DNA或RNA序列的不同位置中发现。 异源核酸或蛋白质对于其被导入的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或者经合成或 重组产生。通常地，尽管不是必要的，这些核酸编码不是由其中所述DNA被转录或表达的细 胞正常产生的蛋白质。相似地，外源RNA编码不是在其中存在外源RNA的细胞中正常表达 的蛋白质。异源核酸和蛋白质也可以是指外来的核酸或蛋白质。本领域技术人员认为的对 于在其中表达的细胞而言是异源或外源的任何核酸或蛋白质均涵盖在术语异源核酸或蛋 白质中。术语异源也用于描述核酸或氨基酸序列的非天然组合，即其中至少两个组合的序 列彼此是外来的的组合。在本文及其权利要求书中，动词“包含”以其非限制性含义使用，是指涵盖了其后 的项目，但是并不排除没有提到的项目。另外，当描述一个元件时，数量短语“一个”不排除 存在多于一个所述元件的可能性，除非上下文清楚地要求有且仅有一个所述元件。因此数 量短语“一个”通常是指“至少一个”。发明详述本发明涉及转化的真核宿主细胞，其具有将木糖异构为木酮糖的能力，例如WO 03/0624430所述。将木糖异构为木酮糖的能力是通过用包含编码木糖异构酶的核苷酸序列 的核酸构建体转化宿主细胞而赋予宿主细胞的。转化的宿主细胞的将木糖异构为木酮糖的 能力是将木糖直接异构为木酮糖。这意味着在由木糖异构酶催化的一个单一反应中即将木 糖异构为木酮糖，与分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化的以木糖醇为中间物的将木糖 转变为木酮糖的两步反应不同。所述核苷酸序列编码优选在转化的宿主细胞中以活性形式表达的木糖异构酶。因 此，宿主细胞中所述核苷酸序列的表达产生在30°C具有至少IOU木糖异构酶活性/mg蛋白 质、优选至少20、25、30、50、100、200、300或500U/mg蛋白质的比活性的木糖异构酶。在转化 的宿主细胞中表达的木糖异构酶的比活性在本文以宿主细胞无细胞裂解物例如酵母无细 胞裂解物的每毫克蛋白质的木糖异构酶活性单位的量表示。木糖异构酶活性、蛋白质量的
9确定及无细胞裂解物的制备如实施例1. 13所述。因此，编码木糖异构酶的核苷酸序列在宿 主细胞中的表达产生具有在30°C至少50U木糖异构酶活性/mg蛋白质、优选至少100、200、 500、750或者1000U/mg蛋白质的比活性的木糖异构酶。优选地，编码木糖异构酶的核苷酸序列在宿主细胞中的表达产生对于木糖其Km低 于50、40、30或者25mM的木糖异构酶，更优选对于木糖其Km为大约20mM或更低的木糖异 构酶。编码木糖异构酶的优选的核苷酸序列可以选自由如下核苷酸序列组成的组(a)编码包含与SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少60、65、 70、75、80、85、90、95、97、98或者99%序列相同性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)包含与SEQ ID NO :9和/或SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少40、50、60、 70、80、90、95、97、98或者99%序列相同性的核苷酸序列的核苷酸序列；(c)其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交的核苷酸序列；(d)其序列由于遗传密码的简并性而与(C)的核酸分子序列不同的核苷酸序列。编码木糖异构酶的核苷酸序列可以编码原核或者真核木糖异构酶，即具有与在原 核或真核生物体中天然发生的木糖异构酶相同的氨基酸序列的木糖异构酶。本发明人发 现特定的木糖异构酶赋予真核宿主细胞将木糖异构为木酮糖的能力不十分依赖于该异构 酶源自原核还是真核生物体，而是依赖于异构酶的氨基酸序列与Piromyces序列(SEQ ID NO 1)的关联性。令人惊奇地，真核Piromyces异构酶与原核异构酶的关联性高于与其它 已知真核异构酶的关联性。Piromyces异构酶与黄单胞菌属(Xanthomonas)酶呈现61% 氨基酸序列相同性，与拟杆菌属(Bacteroides)酶(SEQ ID NO 2)呈现82%氨基酸序列相 同性，而与一些植物木糖异构酶仅呈现49-52%氨基酸序列相同性。未有植物木糖异构酶 在酵母中活性表达的报道。相反，在实施例3中，我们描述了拟杆菌属木糖异构酶赋予真核 宿主细胞将木糖异构为木酮糖的能力及在木糖作为唯一碳源的条件下生长的能力。因此， 优选的核苷酸序列编码具有与上述Piromyces序列相关的氨基酸序列的木糖异构酶。优 选的核苷酸序列编码真菌木糖异构酶(例如来自担子菌(Basidiomycete))，更优选厌氧 真菌的木糖异构酶，例如来自属于 Neocallimastix、Caecomyces、Piromyces、Orpinomyces 或Ruminomyces科的厌氧真菌的木糖异构酶。或者，优选的核苷酸序列编码细菌木糖异构 酶，优选来自革兰氏阴性菌，更优选来自拟杆菌纲或者拟杆菌属、最优选来自多形拟杆菌 (B. thetaiotaomicron)的异构酶(SEQ ID NO 2)。为了增加木糖异构酶以活性形式在真核宿主细胞如酵母中表达的可能性，可以对 编码木糖异构酶的核苷酸序列进行调整适应以优化其密码子为真核宿主细胞所利用。编码 木糖异构酶(或者本发明的其它酶，见下述)的核苷酸序列对于宿主细胞的密码子使用的 适应性可以表示为密码子适应指数(codon adaptiveness index，CAI)。密码子适应指数在 本文定义为基因的密码子使用与高度表达的基因的密码子使用的相关适应性测定。每个密 码子的相关适应性⑷是每个密码子的使用与相同氨基酸最丰余的密码子的比率。CAI指 数定义为这些相关适应性数值的几何平均数。非同义密码子和终止密码子(依赖于遗传密 码)除外。CAI数值范围是0-1，较高的数值表示较高比例的最丰余的密码子(见Sharp and Li，1987， Nucleic Acids Research 15 1281-1295 Jansen et al. ，2003， Nucleic Res. 31 (8) =2242-51)。经调整适应的核苷酸序列优选CAI为至少0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6或
用如上所述的编码木糖异构酶的核苷酸序列转化的宿主细胞优选是能主动或被 动将木糖转运至细胞中的宿主。所述宿主细胞优选含有主动糖酵解。所述宿主细胞可进一 步含有内源磷酸戊糖途径，及可含有内源木酮糖激酶活性，由此由木糖异构形成的木酮糖 可以代谢为丙酮酸。所述宿主进一步优选含有将丙酮酸转变为希望的发酵产物的酶，所述 发酵产物如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3_丙二醇、 乙烯、甘油、β -内酰胺抗生素和头孢菌素。优选的宿主细胞是天然能进行乙醇发酵、优选厌氧乙醇发酵的宿主细胞。所述宿 主细胞进一步优选具有对乙醇的高度耐受性，对低PH的高度耐受性(即能在低于5、4、3或 2. 5的ρΗ条件下生长)及对有机酸如乳酸、乙酸或者甲酸和糖降解产物如糠醛和羟甲基糠 醛的高度耐受性，及对升高的温度的高度耐受性。宿主细胞的任何这些特性或活性可以天 然存在于宿主细胞中，或者可以导入或者通过遗传修饰进行修饰。合适的宿主细胞是真核 微生物如真菌，然而，最合适的宿主细胞是酵母或者丝状真菌。酵母在本文被描述为真核微生物，包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门 (Eumycotina)的所有禾中(Alexopoulos, C. J.，1962，In Introductory Mycology, John Wiley & Sons，Inc. , New York)。酵母可以通过单细胞原植体的芽殖而生长或者通过该 生物体的分裂而生长。优选作为宿主细胞的酵母属于糖酵母属(Saccharomyces)、克鲁 维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺酵母 属(Schwarmiomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)。优选所述酵母能进行厌氧发酵，更优选能 进行厌氧乙醇发酵。丝状真菌在本文被定义为真核微生物，包括真菌亚门的所有丝状形式。这些真菌 特征在于由壳多糖、纤维素及其它复合多糖组成的营养菌丝体。本发明的丝状真菌与酵 母在形态学、生理学和遗传学方面截然不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延长进行， 大多数丝状真菌的碳分解代谢是必须需氧的。作为宿主细胞的优选丝状真菌属于曲霉属 (Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、枝顶抱属(Acremonium)、键 ？包菌属(Fusarium)禾口青霉属(Penicillium)0近年来提议导入各种生物体以从作物糖分中生产生物乙醇。然而，实际上所有主 要的生物乙醇生产方法继续使用糖酵母属的酵母作为乙醇生产株。这是由于糖酵母物种在 工业生产过程中具有许多吸引人的特点，即高酸性、乙醇和渗透压耐受性，厌氧生长的能力 及其高醇发酵能力。作为宿主细胞的优选酵母物种包括酿酒酵母、S. bulderi.S. barnetti, 少孢酵母(S. exiguus)、葡萄汁酵母(S. uvarum)、糖化酵母(S. diastaticus)、乳酸克鲁维 斯酵母(K. Iactis)、马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)、脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)。本发明的宿主细胞因此是用包含编码上述木糖异构酶的核苷酸序列的核酸构建 体转化的宿主细胞。包含编码木糖异构酶编码序列的核酸构建体优选能在宿主细胞中表达 木糖异构酶。为此所述核酸构建体可以如WO 03/0624430所述构建。所述宿主细胞可包含 所述核酸构建体的一个但优选多个拷贝。所述核酸构建体可以附加型维持，并因此包含自 主复制的序列，如ARS序列。合适的附加型核酸构建体可例如基于酵母2 μ或pKDl(Fleer et al.，1991，Biotechnology 2:968-975)质粒。然而，优选所述核酸构建体以一或多个
11拷贝整合进宿主细胞的基因组中。整合进宿主细胞基因组中可以通过非常规重组随机产 生，但优选核酸构建体是通过真菌分子遗传学领域熟知的同源重组方法整合进宿主细胞中 (参见例如 WO 90/14423，EP-A-O 481 008，EP-A-O 635 574 及 US 6, 265, 186).在本发明的第一方面中，本发明的宿主细胞包含增加磷酸戊糖途径流量的遗传修 饰。特别地，所述遗传修饰导致磷酸戊糖途径的非氧化部分流量增加。导致磷酸戊糖途径的 非氧化部分流量增加的遗传修饰在本文理解为是指使所述流量与在除了导致流量增加的 遗传修饰之外在遗传学方面均相同的菌株中的流量相比增加至少1. 1、1.2、1.5、2、5、10或 者20倍。磷酸戊糖途径的非氧化部分的流量的测定可以通过将修饰的宿主在木糖作为唯 一碳源的条件下生长，确定木糖消耗比速率，从木糖消耗比速率中减去木糖醇产生比速率 (如果有木糖醇产生的话)进行。然而，磷酸戊糖途径的非氧化部分的流量与在作为唯一碳 源的木糖上的生长率成比例，优选与在作为唯一碳源的木糖上的厌氧生长率成比例。在作 为唯一碳源的木糖上的生长率(μ_)与磷酸戊糖途径的非氧化部分的流量之间呈线性相 关。木糖消耗比速率(Qs)与生长率(μ)除以糖上的生物量的产量(Yxs)相等，因为糖上的 生物量的产量是恒定的(在给定的系列条件下厌氧，生长培养基，ΡΗ，菌株的遗传背景等 等；即Qs= μ/Yj。因此，增加的磷酸戊糖途径的非氧化部分的流量可以从在这些条件下 最大生长率的增加中推断。增加磷酸戊糖途径的流量的遗传修饰可以通过各种方式导入宿主细胞中。这些方 式包括例如达到较高的木酮糖激酶和/或磷酸戊糖途径的非氧化部分的一或多种酶的稳 态活性水平和/或降低的非特异性醛糖还原酶活性的稳态水平。稳态活性水平中的这些改 变可以通过选择突变体(自发或被化学物质或辐射诱导)和/或通过重组DNA技术(例如 分别过表达或失活编码调节这些基因的酶或因子的基因)而实现。在优选的宿主细胞中，所述遗传修饰包含磷酸戊糖途径(的非氧化部分)的至少 一种酶的过表达。优选所述酶选自编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构 酶、转羟乙醛酶和转醛醇酶的酶。磷酸戊糖途径(非氧化部分)的酶的各种组合均可以过表 达。例如过表达的酶可以至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶；或 者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和转羟乙醛酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和转醛 醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转羟乙醛酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸 差向异构酶和转醛醇酶；或者至少是转羟乙醛酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸 差向异构酶、转羟乙醛酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶、转羟乙醛酶和转 醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛醇酶；或者 至少是核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转羟乙醛酶。在本发明的一 个实施方案中，核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转羟乙醛酶和转醛醇 酶在宿主细胞中均是过表达的。更优选的是其中所述遗传修饰至少包含转羟乙醛酶和转醛 醇酶均是过表达的宿主细胞，因为这种宿主细胞能在木糖上厌氧生长。事实上，在一些条件 下，我们发现仅过表达转羟乙醛酶和转醛醇酶的宿主细胞与过表达所有四种所述酶(即核 酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转羟乙醛酶和转醛醇酶)的宿主细胞具 有相同的厌氧生长速率。另外，过表达核酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构 酶这两种酶的宿主细胞与仅过表达该异构酶或者该差向异构酶的宿主细胞相比是优选的， 因为仅这些酶中的一种的过表达可能产生代谢失衡。
本领域中有许多方式可以在本发明的宿主细胞中使所述酶过表达。特别地，可以 通过增加宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数而使所述酶过表达，例如通过将额外的基因拷 贝整合进宿主细胞基因组中、通过从附加型多拷贝表达载体中表达基因或者通过导入包含 基因多个拷贝的附加型表达载体而实现。或者，本发明宿主细胞中酶的过表达可以通过使用启动子而实现，所述启动子对 于编码被过表达的酶的序列是非天然的，即其是与其可操纵地连接的编码序列异源的启动 子。尽管所述启动子优选与与其可操纵地连接的编码序列异源，但也优选所述启动子与宿 主细胞同源，即内源的。优选地，所述异源启动子与所述编码序列的天然启动子相比，优选 在其中木糖或者木糖和葡萄糖用作碳源、更优选作为主要碳源(即50%以上的可用碳源由 木糖或者木糖和葡萄糖组成)、最优选作为唯一碳源的条件下，能产生较高稳态水平的包含 所述编码序列的转录物(或者每单位时间能产生更多的转录物分子，即mRNA分子)。在这 方面合适的启动子既包括组成型启动子也包括可诱导的天然启动子以及工程化的启动子。 另外，本发明中使用的优选启动子对于分解代谢产物(葡萄糖)抑制不敏感和/或优选不 需要木糖以进行诱导。具有这些特性的启动子可普遍获得并且为技术人员所已知。这些启动子例如包 括糖酵解基因的启动子，如来自酵母或丝状真菌的磷酸果糖激酶(PPK)、磷酸丙糖异构酶 (TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶 (PGK)启动子；关于酵母的这些启动子的详细描述可见于WO 93/03159所述。其它可用的启 动子是核糖体蛋白质编码基因启动子、乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADH1、 ADH4等)、及烯醇化酶启动子(ENO)。其它启动子(组成型和可诱导型)及增强子或上游激 活序列为本领域技术人员所已知。如果需要，则可以对本发明的宿主细胞中使用的启动子 进行修饰以影响其控制特性。用于过表达所述酶的编码序列优选与本发明的宿主细胞同源。然而，也可以同样 应用与本发明宿主细胞异源的编码序列。用于在本发明宿主细胞中过表达核酮糖-5-磷酸异构酶的核苷酸序列是编码具 有核酮糖-5-磷酸异构酶活性的多肽的核苷酸序列，优选所述多肽具有与SEQ ID N0:4具 有至少50、60、70、80、90或95%相同性的氨基酸序列，或者其中所述核苷酸序列能与SEQ ID NO 12的核苷酸序列在中等条件下、优选在严格条件下杂交。用于在本发明宿主细胞中过表达核酮糖-5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列是编 码具有核酮糖-5-磷酸差向异构酶活性的多肽的核苷酸序列，其中优选所述多肽具有与 SEQ ID NO :5具有至少50、60、70、80、90或者95%相同性的氨基酸序列，或者其中所述核苷 酸序列能与SEQID NO 13核苷酸序列在中等条件、优选严格条件下杂交。用于在本发明宿主细胞中过表达转羟乙醛酶的核苷酸序列是编码具有转羟乙醛 酶活性的多肽的核苷酸序列，其中优选所述多肽具有与SEQ ID而6具有至少50、60、70、 80、90或95%相同性的氨基酸序列，或者其中所述核苷酸序列能在中等条件、优选在严格 条件下与SEQID NO 14核苷酸序列杂交。用于在本发明宿主细胞中过表达转醛醇酶的核苷酸序列是编码具有转醛醇酶活 性的多肽的核苷酸序列，其中优选所述多肽具有与SEQID NO 7具有至少50、60、70、80、90 或95%相同性的氨基酸序列，或者所述核苷酸序列能在中等条件、优选在严格条件下与SEQIDNO 15核苷酸序列杂交。酶的过表达当用于描述在遗传修饰的宿主细胞中所述酶的产生时，是指在相同条 件下与未修饰的宿主细胞相比所述酶以较高水平的特异性酶活性产生。通常这意味着在 相同条件下与未修饰的宿主细胞相比，所述酶活性蛋白质(或者在多亚基酶的情况中的蛋 白质)以较高量产生，或者以较高稳态水平产生。相似地，这通常意味着在相同条件下与未 修饰的宿主细胞相比，编码酶活性蛋白质的mRMA以较高量产生，或者以较高的稳态水平产 生。酶的过表达因此优选通过使用本文所述合适的酶分析测定宿主细胞中酶的比活性水平 而确定。或者，酶的过表达可以通过例如使用特异于酶的抗体量化酶蛋白质的特定稳态水 平，或者通过量化编码所述酶的mRNA的特定稳态水平而间接确定。后者可能特别适于磷酸 戊糖途径的酶，因为该酶分析方法并不易于施行，因为酶的底物不可商购。优选与除了导致 过表达的遗传修饰之外在遗传学方面均相同的菌株相比，在本发明的宿主细胞中准备被过 表达的酶被过表达至少1. 1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。应理解这些过表达水平可用于描述 酶活性的稳态水平、酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录物的稳态水平。在本发明的第二个方面中，本发明的宿主细胞包含增加特异性木酮糖激酶活性的 遗传修饰。优选所述遗传修饰通过例如编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达而导致木 酮糖激酶的过表达。编码木酮糖激酶的基因可以是宿主细胞内源的，或者可以是与宿主细 胞异源的木酮糖激酶。用于在本发明宿主细胞中过表达木酮糖激酶的核苷酸序列是编码具 有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中优选所述多肽具有与SEQ ID NO :3具有至少 50、60、70、80、90或95%相同性的氨基酸序列，或者所述核苷酸序列能在中等条件、优选严 格条件下与SEQ IDNO 11的核苷酸序列杂交。特别优选的木酮糖激酶是与Piromyces木酮糖激酶(xylB ；见WO 03/0624430)相 关的木酮糖激酶。这种Piromyces木酮糖激酶实际上与原核生物激酶比与所有已知的真核 生物激酶如酵母激酶(SEQ ID NO 3)更相关。已经表明真核生物木酮糖激酶是非特异性糖 激酶，其具有广泛的底物范围，包括木酮糖。相反，已经表明与Piromyces激酶最相关的原 核生物木酮糖激酶是对于木酮糖更具有特异性的激酶，即具有较窄的底物范围。因此，用于 在本发明宿主细胞中过表达木酮糖激酶的更优选的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活 性的多肽的核苷酸序列，其中优选所述多肽具有与SEQ ID而17具有至少45、50、55、60、 65、70、80、90或95%相同性的氨基酸序列，或者所述核苷酸序列能在中等条件、优选在严 格条件下与SEQ ID NO: 18核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在本发明的宿主细胞中，增加特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰可以与上述增加 磷酸戊糖途径流量的任何修饰组合，但这种组合对于本发明不是必需的。因此，本发明特别 包括仅包含增加特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰的宿主细胞。本领域可利用的达到和分 析本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的各种方式与针对磷酸戊糖途径的酶的上述方式 相同。优选地，与其中除了导致过表达的遗传修饰之外在遗传学方面均相同的菌株相比，在 本发明的宿主细胞中过表达的木酮糖激酶被过表达至少1. 1、1. 2,1. 5、2、5、10或者20倍。 应理解这些过表达水平可用于描述酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的 转录物的稳态水平。在本发明的第三方面中，本发明的宿主细胞包含降低宿主细胞中非特异性醛糖还 原酶活性的遗传修饰。优选地，宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性通过降低编码非特异
14性醛糖还原酶的基因的表达或者使其失活的一或多个遗传修饰而降低。优选地，所述遗传 修饰降低宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的基因的每个内源拷贝的表达或者使其失 活。宿主细胞由于二、多或者非整倍性的结果而可以包含编码非特异性醛糖还原酶的基因 的多个拷贝，和/或所述宿主细胞可含有一些不同的具有醛糖还原酶活性的(异构)酶，这 些酶具有不同的氨基酸序列并由不同的基因编码。在这种情况中也优选降低编码非特异性 醛糖还原酶的每个基因的表达或使其失活。优选地，所述基因是通过缺失该基因的至少一 部分或者通过破坏该基因而失活，文中所用术语“基因”也包括在编码序列上游或下游的任 何非编码序列，所述基因的(部分)缺失或者失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活 性的表达降低。编码在本发明宿主细胞中其活性要被降低的醛糖还原酶的核苷酸序列是编 码具有醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中优选所述多肽具有与SEQ ID N0:8具有 至少50、60、70、80、90或者95%相同性的氨基酸序列，或者所述核苷酸序列在中等条件下、 优选在严格条件下能与SEQ ID NO: 16的核苷酸序列杂交。在本发明的宿主细胞中，降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰可 以与增加磷酸戊糖途径流量的任何修饰组合，和/或与上述增加宿主细胞中特异性木酮糖 激酶活性的任何修饰组合，但是这些组合对于本发明不是必需的。因此，本发明特别包括仅 包含降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰的宿主细胞。在另外的方面中，本发明涉及进一步适应木糖利用的修饰的宿主细胞，其通过选 择自发或者诱导的(例如通过辐射或者化学物质)在木糖上生长，优选在作为唯一碳源的 木糖上生长，更优选在厌氧条件下生长的突变体得到。突变体的选择可以通过培养物的连 续传代而进行，例如Kuyper et al. (2004，FEMS Yeast Res. 4 655-664)所述，或者通过在 恒化器培养物中在选择压力下培养而进行，如本发明实施例4所述。在优选的本发明宿主细胞中，上述至少一种遗传修饰(包括通过突变体选择而获 得的修饰)赋予宿主细胞在作为碳源、优选作为唯一碳源的木糖上优选在厌氧条件下生长 的能力。优选所述修饰的宿主细胞基本上不产生木糖醇，例如产生的木糖醇低于检测限度， 或者例如基于摩尔低于5、2、1、0. 5或者0. 3%消耗的碳。优选地，修饰的宿主细胞具有在作为唯一碳源的木糖上在厌氧条件下以生长率为 至少0. 05,0. 1,0. 2,0. 25或者0. 3/小时生长的能力，或者如果适合的话，则在厌氧条件下 所述生长率为至少0. 03,0. 05,0. 07,0. 08,0. 09,0. 1,0. 12,0. 15或者0. 2/小时。优选地，修 饰的宿主细胞具有在作为唯一碳源的葡萄糖和木糖混合物(重量比为1 1)上在厌氧条 件下以生长率为至少0. 05,0. 1,0. 2,0. 25或者0. 3/小时生长的能力，或者如果适合的话， 则在厌氧条件下所述生长率为至少0. 03,0. 05,0. 1,0. 12,0. 15或者0. 2/小时。优选地，修饰的宿主细胞具有至少346、350、400、500、600、750或者IOOOmg木糖 /g细胞/小时的木糖消耗比速率。优选地，在木糖上，修饰的宿主细胞的发酵产物(如乙 醇)产量是在葡萄糖上所述宿主细胞的发酵产物(如乙醇)产量的至少55、60、70、80、85、 90、95或者98%。更优选地，在木糖上，修饰的宿主细胞的发酵产物(如乙醇)产量等于在 葡萄糖上所述宿主细胞的发酵产物(如乙醇)产量。同样，在木糖上，修饰的宿主细胞的生 物量产量优选是在葡萄糖上所述宿主细胞生物量产量的至少55、60、70、80、85、90、95或者 98%。更优选地，在木糖上，修饰的宿主细胞的生物量产量等于在葡萄糖上所述宿主细胞的 生物量产量。应理解在葡萄糖和木糖上的产量对比中，二者均在需氧条件下对比，或均在厌氧条件下对比。在一个优选方面，本发明的修饰的宿主细胞是生产乙醇的宿主细胞。在另一方面， 本发明涉及生产除了乙醇之外的发酵产物的经转化的宿主细胞。这些非乙醇发酵产物原则 上包括可由真核微生物如酵母或者丝状真菌产生的任何粗制或精细化学物质。这些发酵产 物包括例如乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、 甘油、内酰胺抗生素和头孢菌素。产生非乙醇发酵产物的优选的本发明修饰的宿主细 胞是含有导致醇脱氢酶活性降低的遗传修饰的宿主细胞。另一方面，本发明涉及发酵方法，其中本发明修饰的宿主细胞用于发酵包含木糖 来源(如木糖)的碳源。除了木糖来源之外，发酵培养基中的碳源还可包含葡萄糖来源。木 糖或者葡萄糖来源可以是木糖或者葡萄糖，或者可以是包含木糖或葡萄糖单位的任何碳水 化合物寡聚或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉等。为了从这些碳水化合物中 释放木糖或葡萄糖单位，可以向发酵培养基中加入合适的糖酶(如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀 粉酶等)或者由修饰的宿主细胞产生合适的糖酶。在后者情况中，修饰的宿主细胞可以经 遗传工程化产生并分泌这些糖酶。使用葡萄糖的寡聚或多聚体来源的一个额外优势是例如 可以通过使用限速量的糖酶在发酵期间保持较低浓度的游离葡萄糖。这将防止非葡萄糖糖 类如木糖的代谢和转运需要的系统的抑制。在优选的方法中，修饰的宿主细胞使木糖和葡 萄糖均发酵，优选同时发酵，在这种情况中优选使用对葡萄糖抑制不敏感的宿主细胞，以防 止二次生长。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源之外，发酵培养基进一步包含修饰的 宿主细胞生长需要的合适成分。适合微生物如酵母生长的发酵培养基的成分为本领域所熟 知。发酵方法是生产发酵产物如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠 檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -内酰胺抗生素如青霉素G或青霉素V及其发酵 产物、及头孢菌素的方法。发酵方法可以是需氧或者厌氧发酵方法。本文所述的厌氧发酵 方法是在无氧条件下或者基本上没有氧被消耗的条件下进行的，优选氧的消耗低于5、2. 5 或者lmmol/L/小时，更优选为Ommol/L/小时(即检测不到氧消耗)，其中有机分子既作为 电子供体也作为电子受体。在无氧条件下，糖酵解和生物量形成中产生的NADH不能通过氧 化磷酸化氧化。为了解决这个问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物之一作为电子和 氢的受体，从而再生NAD+。因此，在优选的厌氧发酵过程中，使用丙酮酸盐作为电子(和氢 的受体)，并且还原为发酵产物如乙醇、乳酸、3_羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、 氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。发酵方法优选在对于修饰的宿主细胞最佳的温度下进行。因此，对于大多数酵母 或者真菌宿主细胞，发酵方法是在低于42°C、优选低于38°C的温度进行。对于酵母或者丝 状真菌宿主细胞，发酵方法优选在低于35、33、30或28°C并高于20、22或25°C的温度进行。优选的方法是产生乙醇的方法，其中所述方法包括如下步骤(a)发酵含有木糖 来源及修饰的宿主细胞的培养基，其中所述宿主细胞发酵木糖产生乙醇；任选地(b)回收 所述乙醇。所述发酵培养基还可包含葡萄糖来源，其也被发酵产生乙醇。在所述方法中，乙 醇的体积生产量优选为至少0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0,5. 0或者10. Og乙醇/升/小时。 在所述方法中木糖和/或葡萄糖的乙醇产量优选为至少50、60、70、80、90、95或98%。本文 所述的乙醇产量是理论最大产量的百分比，所述最大产量对于葡萄糖和木糖是0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。另一方面，本发明涉及一种产生选自如下一组的发酵产物的方法乳酸、3-羟 基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生 素和头孢菌素。所述方法优选包括如下步骤(a)发酵含有木糖来源及修饰的宿主细胞的 培养基，其中所述宿主细胞发酵木糖产生发酵产物；任选(b)回收所述发酵产物。在优选的 方法中，所述培养基还含有葡萄糖来源。遗传修饰为了在本发明的宿主细胞中过表达上述酶以及对宿主细胞(优选酵母)进行额 外的遗传修饰，通过本领域熟知的方法用本发明的各种核酸构建体转化宿主细胞。这些 方法例如 Sambrook and Russel (2001) 〃 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或者 F. Ausubel et al, eds. , " Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)的标准手册所描述。对真菌宿主 细胞进行转化和遗传修饰的方法可从例如EP-A-O 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和 WO 00/37671 中获知。用于核酸构建体中以在本发明宿主细胞中过表达酶的启动子已经在上文描述。在 进行过表达的核酸构建体中，编码所述酶的核苷酸序列的3’末端优选与转录终止子序列可 操纵地连接。优选所述终止子序列在选择的宿主细胞如选择的酵母物种中是可操纵的。在 选择的终止子不是关键因素的任何情况中，其可以例如来自任何酵母基因，尽管有时也可 以使用来自非酵母真核生物基因的终止子。转录终止序列进一步优选包含一个聚腺苷酸化 信号。任选地，在所述核酸构建体中可存在一种可选择的标记。如本文所用，术语“标记” 是指编码使得可以选择或者筛选含有所述标记的宿主细胞的性状或者表型的基因。所述标 记基因可以是抗生素抗性基因，因此合适的抗生素可用于从未转化的细胞中选择出转化的 细胞。合适的抗生素抗性标记包括例如二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、‘-0-磷 酸转移酶II (卡那霉素、新霉素和G418抗性)。尽管抗生素抗性标记可以是对于多倍体宿 主细胞的转化最便利的，然而优选使用非抗生素抗性标记，如营养缺陷型标记(URA3、TRP1、 LEU2)或者粟酒裂殖酵母(S. pombe)TPI 基因(由 Russell P R, 1985,Gene 迎125_130 描 述)。在优选的实施方案中，用所述核酸构建体转化的宿主细胞不含有标记基因。构建不含 有重组标记基因的微生物宿主细胞的方法在EP-A-O 635 574中揭示，并且基于使用双向 标记如沟巢曲霉(A.nidulans)amdS(乙酰胺酶)基因或者酵母URA3和LYS2基因。或者， 可以将可筛选的标记如绿色荧光蛋白、lacZ、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸糖 苷酶掺入本发明的核酸构建体中，以可以筛选转化的细胞。任选可以存在于本发明的核酸构建体中的其它元件包括但不限于一或多个前 导序列、增强子、整合因子、和/或报道基因、内含子序列、着丝粒、端粒和/或基质附着 (MAR)序列。本发明的核酸构建体可进一步包含自主复制序列，如ARS序列。合适的附加 型核酸构建体可例如基于酵母2 μ或者pKD 1 (Fleer et al.，1991，Biotechnology 9 968-975)质粒。或者，所述核酸构建体可包含优选通过同源重组进行整合的序列。这些序 列因此可以是与宿主细胞基因组中用于整合的靶位点同源的序列。本发明的核酸构建体
17可以已知的方式提供，通常包括限制和连接核酸/核酸序列的技术，参见如Sambrook and Russel(2001)“ Molecular Cloning :A Laboratory Manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或者 F. Ausubel et al, eds. , " Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)的标准手册所述。使酵母或丝状真菌中基因的失活和破坏的方法为本领域所熟知(见例如 Fincham, 1989, Microbiol Rev. 53(1) 148-70 和 EP-A-O 635 574)。附图描述
图1 在发酵罐中菌株RWB 212在含有2% (w/v)木糖作为碳源的合成培养基上的 厌氧生长典型图，一式两份实验的差异小于5%。A组木糖(·)，乙醇(〇)，甘油(■) 及从气体分析中推导的每升中产生的累积CO2 (-)。B组干重(·)，乙酸盐(〇)，木糖醇 (□)，琥珀酸盐(▲)，乳酸盐(Δ)。图2 在发酵罐中菌株RWB 212在含有2% (w/v)葡萄糖和2% (w/v)木糖作为碳 源的合成培养基上的厌氧生长典型图，一式两份实验差异小于5%。A组葡萄糖(·)，木 糖(〇)，乙醇(■)，甘油(□)及从气体分析中推导的每升中产生的累积的C02(-)。B 组干重(·)，乙酸盐(〇)，木糖醇(■)，乳酸盐(□)，琥珀酸盐(▲)。图3 :A组RWB 212在30g/l木糖作为碳源的厌氧恒化器培养期间的残余木糖浓 度。显示的数据是两个独立恒化器的平均值和实验偏差。B组RWB 212在30g/l木糖作为 碳源的厌氧恒化器培养期间的培养物干重。显示的数据是两个独立恒化器的平均值和实验 偏差。图4 在葡萄糖和木糖(均为20g/l)上厌氧分批培养的三个木糖代谢菌株的CO2 产生概况图。精确的实验条件有所变化，因此实际的数值不可对比。图5 源自RWB 212的选择的菌株在2%葡萄糖和2%木糖上在两批独立厌氧发酵 罐培养期间测定的葡萄糖、木糖、乙醇、甘油和CO2的浓度。
实施例1.材料和方法1. 1.质粒构建为了将TPIl启动子整合在靶基因之前，构建一些质粒。首先将TPIl启动子从 pYX012-Aat (A. A. Winkler, pYX012 的衍生物(R&DSystems, Minneapolis, MN, USA))中切割 为XhoI-EcoRV片段，并与用Sall-PvuII切割的pUG6[3]连接。这样产生了 pUG6PTPI，然后 将其用于PCR扩增产生Kanlox-Pm整合盒。在推定的ORF的位置与靶基因的ATG非常接近的情况中，将这些基因克隆进 pUG6PTPI中。从凝胶中分离一个0.8kb RPEl片段和一个2. 3 kb TKLl片段，用EcoRI 和XhoI (存在于引物中，见表3)切割，并连接进用Ec0Rl-SalI消化的pUG6PTPI中，产生 pUG6PTPI-RPEl 和 pUG6PTPI-TKLl。为了增加木酮糖激酶的活性，将XKSl基因通过PCR扩增，产生SpeI-SalI片段(位 点在引物中，见表3)并克隆进用XbaI-XhoI切割的p415ADH[4]中，产生p415ADHXKS。根据厂商指导使用限制性核酸内切酶(New England Biolabs, Beverly, MA, USA
18and Roche, Basel, Switzerland)禾口 DNA 连接酶(Roche)。使用 Qiaprep spin miniprep 试 剂盒(QiagemHilden，Germany)从大肠杆菌中分离质粒。将DNA片段在琼脂糖(Sigma， St. Louis,MO,USA)凝胶、1XTBE[5]中分离。使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Quiagen)从 凝胶中分离片段。使用VentK DNA聚合酶(New England Biolabs)根据厂商指导扩增RPE1、 TKLl和XKSl。模板是CEN. PKl 13-7D (wt)的染色体DNA。聚合酶链反应(PCR)在Biometra TGradient Thermocycler (Biometra, Gottingen, Germany)中进行，使用如下设置在60°C
退火1分钟，在75 °C延伸3分钟及在94°C变性1分钟，循环30次。1. 2.菌株和培养基在此项研究中使用的酿酒酵母菌株是RWB212(MATA ura3-521eu2_112 IoxP-Ptpi: (-266，-1) TALI gre3 hphMX ρUGPtpi-TKL 1 pUGPTPI-RPE 1 KanloxP-Pm (- ？，_1) RKI1)，其衍生自 CEN. PK102-3A (MATA ura3-52 leu2_112)。在构建期间，将菌株维持在复合物(YP :10g/l酵母提取物(BDDifco)，20g/l蛋 白胨(BD Difco))或者合成培养基(MY)[6]上，补加葡萄糖(2%)作为碳源(YPD或 MYD)及在平板的情况中补加1.5%琼脂。在转化后，通过铺板在含有200 μ g/ml遗传霉 素(geneticin) (G418) (Invitrogen/GIBCO)和 300 μ g/ml 潮霉素 B (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)的YPD上选择整合物。在用质粒转化后，将菌株铺板于MYD上。 根据Gietz and Woods [7]所述转化酵母。将质粒在大肠杆菌菌株XL-Iblue (Stratagene，La Jolla, CA, USA)中扩增。根 据Inoue et al. [8]所述进行转化。将大肠杆菌在LB(Luria-Bertani)平板或者液体 TB(Terrific Broth)培养基中生长以分离质粒[5]。1. 3.菌株构建通过扩增具有KanMX标记和TPIl启动子的PCR片段，并通过同源末端将其定向于 靶定位置，将TPIl启动子的TALl和RKIl整合在开放读框的5，末端。使用Taq DNA聚合酶 (Amersham Pharmacia, Piscataway, USA)根据厂商指导进行 PCR。模板为 pUG6PTPI，PTALdisA 和PTALdisB或者PEKIdisA和PffiIdisB (表3)作为引物。在TKLl 和 RPEl 的情况中，将质粒 pUG6PTPI_TKLl 和 pUG6Pm_RPEl 分别用 PvuII 和SalI线性化，并整合进基因组中。用针对TALl用TALI intern+KanA和对TKL1、RPE1和 RPIl用Ptpi primer+ “intern”进行菌落PCR而证实构建体的正确整合。“intern”引物与 整合的构建体的下游退火，而Ptpi引物与TPIl启动子的3’末端退火。在构建体整合后，用ere重组酶除去KanMX标记。为此将菌株用pSH47[3]转化。 将具有该质粒的菌落再悬浮于具有的半乳糖的YP中，在30°c温育1小时。然后将大约 200个细胞铺板于YPD上。检测所得菌落的KanMX标记和pSH47 (URA3)的丧失情况。另外，将GRE3基因用来自pAG32的hphMX盒置换，赋予潮霉素抗性[9]。将 hphMX 盒使用寡核苷酸 5’ gre3: :Kanlox 和 3’ gre3: :Kanlox 扩增。用 5’ GRE3+KanA 和 3，GRE3+KanB (表3)经PCR证实正确的整合。KanA和KanB分别与A. gossipi TEF启动子 和终止子退火，而其它引物在GRE3开放读框之外退火。使用Taq DNA聚合酶(Amersham Pharmacia,Piscataway,USA)根据厂商指导进行 菌落PCR。将模板细胞再悬浮于2. 5μ 1 0.02Μ NaOH中，向其中加入PCR反应混合物。在 Biometra TGradient Thermocycler (Biometra, Gottingen, Germany)中进行 PCR,使用如下设置在60°C退火1分钟，在72°C延伸3分钟，在94°C变性1分钟，循环30次。然后将所得菌株RWB212(MATA ura3_52 leu2_112 IoxP-Ptpi: (-266, -1)TAL1 gre3: :hphMX pUGPm_TKLl pUGPTPI-RPElKanloxP-PTPI: : (- ？，_1)RKI1)用 pAKX002 以 及p415ADHXKS转化，pAKX002是在TPIl启动子之后含有Piromyces sp. E2 xylA的多拷 贝载体。产生 RWB217(MATA ura3-52 leu2_112 IoxP-Ptpi (-266，-l)TALlgre3: :hphMX PUGPtpi-TKL 1 pUGPTPI-RPEl KanloxP-Pm: (- ？，-1) RKIl {pAKX002, p415ADHXKS})。1. 4.菌株维持将原种培养物在30°C在摇瓶中的补加20g葡萄糖/1的合成培养基[6]上生长。 当达到稳定期时，加入无菌甘油至30% (vol/vol)，将2ml等份贮存在_80°C无菌瓶中。1.5.培养和培养基在合成培养基[6]中在30°C进行摇瓶培养。培养基的pH用2M KOH调节为6. 0，之 后进行灭菌。用冷冻的原种培养物接种500ml摇瓶中含有20g/l木糖的IOOml培养基而制 备预培养物。在30°C在环形摇瓶(200rpm)中温育24-48小时之后，将这种培养物用于接种 摇瓶培养物或者发酵罐培养物。将用于厌氧培养的合成培养基补加溶解于乙醇中的0. Olg/ 1麦角固醇和0. 42g/l Tween 80[10，11]，这于培养基中产生ll_13mM乙醇。1.6.发酵罐中厌氧分批培养在装备了Norprene 管的 2 升实验室发酵罐(Appl ikon，Schiedam, The Netherlands)中在30°C和pH 5. O条件下进行厌氧分批培养，工作体积为1. 5升。以800rpm 搅动培养物，喷射0. 51/分钟高级氮气(< 5ppm氧)。将所述合成培养基补加厌氧生长因 子麦角固醇和Tween 80 (分别为0. 01和0. 42g/l)以及100 μ 1/1硅酮消泡剂(BDH, Poole, UK)。1. 7.培养物干重的确定将培养物样品(10.0ml)用预先称重的硝化纤维素滤膜(滤孔大小0.45μπι; Gelman laboratory, Ann Arbor, USA)过滤。在除去培养基后，将滤膜用去矿物质水洗涤， 在微波炉(Bosch，Stuttgart，Germany)中在360W干燥20分钟并称重。一式两份确定的值 变化小于1%。1. 8.气体分析将废气在冷凝器(2 °C )中冷却，用Permapure干燥器MD-110-48P-4型 (Permapure, Toms River, USA)干燥。O2 禾口 CO2 浓度用 NGA 2000 分析仪(Rosemount Analytical, Orrville, USA)确定。废气流速和特定的氧消耗和二氧化碳产生速率如前述 确定[12，13]。在计算这些生物量比速率时，对取出培养物样品导致的体积变化进行校准。1. 9.代谢物分析在含有Biorad HPX 87H 柱(Biorad, Hercules, USA)的 Waters Alliance 2690 HPLC(Waters,Milford,USA)上通过HPLC分析检测葡萄糖、木糖、木糖醇、有机酸、甘油和乙 醇。将该柱在60°C用0. 5g/l H2SO4以0.6ml/分钟流速洗脱。利用Waters 2410折射率检 测仪和Waters 2487 UV检测仪进行检测。以如下方式经酶促确定木酮糖。反应混合物由 IOOmM Tris-HCl 缓冲液(pH7. 5)及 IOmM MgCl2、0. 30mM NADH 和足量样品(Iml 总体积)组 成，所述分析通过加入0. 2U山梨醇脱氢酶(Sigma，St Louis, USA)起始。木酮糖浓度使用 对于NADH的6. Smr1CnT1吸收系数计算
20
1. 10.碳回收及乙醇蒸发碳回收(Carbon recoveries)以形成的产物中的碳除以消耗的糖碳总量而计算 并基于48%的生物量的碳含量。为了校正发酵过程中的乙醇蒸发，假定产生的乙醇量等于 测定的累积CO2产生量减去由于生物量合成产生的CO2产生量(每克生物量为5. 85mmol CO2[14])和与前述的乙酸盐形成相关的C02[2]。1. 11微阵列分析如前所述进行从恒化器取样细胞、探针制备和与Affymetrix Genechip 微阵列 的杂交[15]。每一生长条件的结果衍生自3个独立培养的复制培养物。1. 12.数据获得和分析阵列图像的获得和定量以及数据过滤用Affymetrix软件包Microarray Suite v5. 0, MicroDB ν3· O 禾口 Data Mining Tool ν3·0 进 亍。在对比前，用Microarray Suite v5. O使用来自全部基因特征的平均信号将所有 阵列全局设定为靶值为150。从YG-S98阵列上的9335个转录物特征，施加一滤波器以提 取6383个酵母开放读框，其中有6084个不同基因。这一差异是由于当在阵列设计中使用 次最佳探针组时一些基因被呈现超过一次而导致的。为了表示一式三份测定值中的偏差，如Boer et al. [16]所述计算变异系数 (C. V.；标准偏差除以平均值)。为了进一步的统计学分析，使用运行Significant Analysis of Microarrays (SAM vl. 12) add in的Microsoft Excel [17]以用于8个数据集的可能的配对形式的对比。如果 使用SAM(预期中位错误发现率(FDR)为)发现基因在各种条件下彼此显著改变至少2 倍，则它们被认为表达改变。随后用Genespring(Silicon Genetics)进行所获得的显著改 变表达水平的集合的分层簇集(Hierarchical clustering)。1. 13 酶分析木糖异构酶活性在37°C在含有50mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 0)、IOmM木糖、IOmM MgCl2和适量的无细胞提取物的反应混合物中分析。形成的木酮糖的量通过半胱氨酸_咔 唑方法(9)确定。或者木糖异构酶活性在30°C通过Kersters-Hildersson et al. (Kinetic characterization of D-xylose isomerases by enzymatic assays using D-sorbitol dehydrogenase. Enz. Microb. Technol. 9 (1987) 145-148)开发的酶分析方法确定。转化的酿 酒酵母菌株的无细胞提取物中木糖异构酶的体外活性依赖于二价阳离子(Mg2+或者Co2+)。木酮糖激酶和木糖还原酶活性如Witteveen et al. (28)所述分析。一活性单位 是指在分析条件下每分钟产生Inmol木酮糖需要的酶量。形成的木酮糖通过Dische and Borenfreund (Dische and Borenfreund, 1951, J. Biol. Chem. 192 583-587) fffi^Tj^M^., 或者通过使用在80°C运行的Biorad HPX-87N Column的HPLC及使用0. OlM Na2HPO4作为 洗脱剂以0.6ml/分钟洗脱确定。木糖和木酮糖通过Refractive Index检测仪在60°C内部 温度进行检测。比活性以每mg蛋白质的活性单位表示。蛋白质使用Bio-Rad蛋白质试剂(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)及牛Y -球蛋白作为标准确定。2.结果2. 1磷酸戊糖途径(PPP)基因的过表达
先前我们已经示出在酿酒酵母中表达真菌木糖异构酶在原则上足以使得该酵母 在作为唯一碳源的木糖上厌氧生长，条件是应用足够的选择压力[2]。然而选择的菌株仍不 能达到工业化需要(表1)。为了研究限速步骤在磷酸戊糖代谢中的可能性，决定构建过度产生将木糖转变为 果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸所需要的所有酶的菌株。所述过表达的酶是木糖异构 酶(XI)、木酮糖激酶(XKS)、核酮糖-5-磷酸异构酶(R5PI)、核酮糖-5-磷酸差向异构酶 (R5PE)、转羟乙醛酶(TKT)和转醛醇酶(TAL)。另外，缺失由GRE3编码的非特异性醛糖还原 酶，其介导不希望的木糖醇产生[18]。由于PPP中一些酶底物不可商购，因此决定通过DNA 阵列而不是通过酶活性测定检测过表达情况。表1列出的结果进一步证实靶基因的转录在 菌株RWB 212中被成功修饰。表1 在参考菌株酿酒酵母CEN. PK113-7D及在工程化的木糖异构酶表达菌株酿酒 酵母RWB212中编码木酮糖激酶和磷酸戊糖途径酶的结构基因的mRNA水平。这两个菌株均 在需氧、葡萄糖受限的恒化器培养中生长(D = 0. IOtT1)。转录水平用Affymetrix GeneChip 微阵列确定。数据是对于每个菌株进行的三个独立培养分析的平均值士平均偏差。ACTl (Ng and Abelson,1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 77 3912-3916)禾口 PDAl(Wenzel et al., 1995，Nucleic. Acids Res. 23 883-884)作为内部标准。 η. d.=未确定(未呈现在Affymetrix微阵列中)；aNC =未改变2. 2工稈菌株的牛理学鉴定工程菌株的一个显著性质是其不需要任何选择压力而在木糖上厌氧生长的能力 (图1)。在基本培养基中的木糖上厌氧生长持续进行，生长速度高达o.ogtr1。木酮糖未积 累，但是木糖醇形成，尽管极少，但是可以检测到(图1)。菌株RWB 212在木糖上的生物量、乙醇和甘油产量与通过进化工程获得的RWB 202-AFX相当(表2)。从表2中可以计算木糖 消耗比速率大于1. Og木糖/g生物量/小时(Qs = 0. 09/0. 085 = 1. 059gr Xyl/gr X/h)， 对比之下RWB 202-AFX的是345mg木糖/g生物量/小时，而获得的产量与在葡萄糖上获得 的产量至少是相似的。2. 3混和底物的利用如在导言中指出，半纤维素水解产物被经济转变为乙醇需要葡萄糖和木糖均发 酵，优选同时发酵。为了核实菌株RWB 212关于混和的糖利用的性质，将该酵母生长在葡萄 糖和木糖的混合物中(木糖和葡萄糖均为ZOgr1)。图2描述的结果示出这两种糖均被完 全消耗，但是葡萄糖是优选的底物。在葡萄糖消耗大约80%之后，木糖开始消耗。3.酵母中多形拟杆菌木糖异构酶的功能件表汰将编码多形拟杆菌VPI-5482木糖异构酶的核苷酸序列(登记号AA075900或者 NP 809706 ；SEQ ID NO :10)克隆进多拷贝酵母表达载体中，产生p426GPDBtXI。将这个 质粒用于转化 RWB215(MATura3-52 leu2_112 loxP-PTPI (-266，-1) TALI gre3: :hphMX pUGPTPI-TKLlpUGPTPI-RPEl KanloxP-Pm: : (- ，_1)RKI1)，将其用 p415ADHXKS 进一步转化 以过表达木酮糖激酶。挑取两个独立转化体，这两个转化体均能在木糖为唯一碳源的基本 培养基上生长，在转化体的裂解物中测定特异性木糖异构酶活性为140+/-20U/mg蛋白质， 相比之下对于表达Piromyces木糖异构酶的菌株的活性为大约1300U/mg蛋白质。4. RffB 212 的诜择将菌株RWB 212 (见上述)通过在厌氧培养恒化器(duplo)中与作为碳源的30g/ 1木糖一起培养而置于选择压力下，估计生长速率为0. 06/小时。选择方法通过确定培养物 干重和残余木糖浓度而监测。初始残余的木糖浓度为大约30mM，但是在26个世代后(300 小时)，残余的木糖浓度降低至低于15mM(图3A)，也观测到生物量浓度相应增加(图3B)。在530小时从这些恒化器培养物中取样，并将这些样品铺板于补加了 2%葡萄糖 的基本培养基琼脂平板上。在30°C培养62小时后，将这些平板的单一菌落在新鲜葡萄糖平 板上划线培养。在30°C温育72小时后，选择两个菌落(每个独立的恒化器选择一个菌落) 并接种预培养物(需氧摇瓶，含有葡萄糖的基本培养基)以用于在20g/l葡萄糖和20g/l 木糖上的厌氧发酵罐分批培养。从图4的CO2废气信号中可见这些培养物与亲代菌株RWB 212及另一个选择菌株 RWB 202-AFX相比具有出众的木糖利用特性。“新的”选择菌株当消耗木糖时呈现CO2产生 率增加，这在亲代菌株中未观测到。图5描述了主要在木糖消耗期间这两个独立分批培养 物的上清中碳源和产物的测定浓度。这两个实验的全部(即葡萄糖+木糖期)乙醇体积生 产率高于0. 5g/L.小时，第一批培养物也表明在木糖消耗期的体积生产率高于0. 5g/L小 时。5.菌株 RffB 204.206.208 和 210 的测试测试的菌株如专利文件和Kuyper et al. ,2005, FEMSYR 5 :399_409所述构建。修 饰的基因如下表列出。所使用的菌株中过表达和缺失的基因列表
23 在导入上表中列出的修饰之后，将所有菌株均用两种质粒转化表达Piromyces 木糖异构酶的PAKX002和表达内源木酮糖激酶的质粒p415ADHXKS。在上述文章中用这两 种质粒转化的RWB 212以单独编号命名RWB 217。用这两种质粒对RWB 212重复转化产生 RffB 223。在转化后，将单菌落在具有葡萄糖的合成培养基琼脂平板上划线培养。从这些平 板接种具有合成培养基和20g/l木糖的摇瓶培养物并在30°C温育48小时。每一摇瓶培养 物用于接种一个具有合成培养基和20g/l木糖的厌氧发酵罐。在温育48小时后，通过目测确定用RWB 204接种的摇瓶未生长。所有四个摇瓶均 用于接种一个发酵罐。发酵罐中的生长情况通过测定废气中CO2的浓度而监测。为了进行参考，在图1中也给出了 RWB 217禾PRWB 223 (均具有Tal、TKL、RPEj^ RKI过表达)的CO2概况。在100小时期间，在RWB204和RWB 206分批培养的废气中未测 出明显CO2产生。从这些CO2产生图中确定的生长率对于RWB 208、217和223为0. 121Γ1， 对于RWB210确定为0. OSr10从这些结果中可以看出，转醛醇酶和转羟乙醛酶的过表达对 于在木糖上厌氧生长是必需的。另外，在RWB 210中核糖5-磷酸差向异构酶的额外过表达 降低在木糖上的生长率。RPEl的过表达可能破坏木酮糖-5P、核酮糖-5P与核糖-5P之间 的平衡，阻碍转羟乙醛酶的活性。在这些实验条件下，R5P-差向异构酶和-异构酶的额外 过表达未进一步改良厌氧木糖发酵的性能。表2 在发酵罐中厌氧分批培养期间，由野生型CEN. PK 113-7D、选择的菌株RWB 202-AFX和工程菌株RWB 212的生长参数、糖消耗和产物形成。数值表示两个独立分批培养 的平均值和实验偏差。
产物:
生物量(g Γ1) CO2 (mmoles I"1) 乙醇e(mM) 木糖醇(mM) 木酮糖(mM)d 甘油(mM) 乙酸(mM) 琥珀酸(mM) 乳酸(mM)a在葡萄糖消耗阶段确定。b基于从CO2产生中推导的乙醇浓度计算，见1.10。e 从CO2产生中推导，见1.10。d瞬时积累。这个值表示在对数中期期间的最高浓度。在生长 结束时，所有木酮糖均已经被再消耗，在所有其它培养物中，木酮糖浓度保持在低于检测限度。
2.07 ± 0.06 197.1 ±3.4 181.6 士 3.9 <0.01 <0.01 22.9 ± 0.2 3.42 ±0.11
0.26 士 0.01
1.70 ±0.02
1.64 土 0.01 196.9 土 1.3 180.3± 1.4 <0.01 <0.01 24.2 ±0.1 6.93 ± 0.02 0.27 土 0.02 1.49 ±0.02
1.81 ±0.08
199.7± 1.5
186.8±2.2 2.76 ± 0.03 7.98 ± 0.09 18.3 ±0.3 2.26 ±0.16 0.75 ± 0.00 0.95 ± 0.02
1.70 ±0.04 199.9± 1.5 188.5 ± 1.3 0.38 ±0.04 <0.01 17.8±0.2 1.40 ±0.07 0.39 ±0.02 1.46 ±0.01
2.97 土 0.04
391.6±0.6
370.7±0.4 0.78 士 0.00 <0.01 32.7 ± 0.3 3.54 ±0.02 0.96 ± 0.00 2.78 ± 0.03 表4:本文中使用的质粒 参考文献1. Bruinenberg, P. Μ. , De Bot, P. H. M, Van Di jken, J. P. and Scheffers, W. Α. (1983)The role of the redox balance in the anaerobic fermentation of xyloseby yeasts. Eur. J. App 1. Microbiol. Biotechnol. 18，287-292.2. Kuyper, M. ，Winkler, A. A. ，Van Dijken, J. P. and Pronk, J. T. (2004)Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylosefermentation :a proof of principle. FEMS Yeast Res.4,655-664.3· Guldener，U· , Heck, S.，Fiedler，T·，Beinhauer，J· and Hegemann, J. H. (1996) A new efficient gene dismption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. 24,2519-2524.4. Mumberg, D.，Muller，R. and Funk，M. (1995) Yeast Vvectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156，119-122.5. Sambrook, K. .，Fritsch，E. F. . and Maniatis，I. (1989)Molecular cloning :A laboratory manual，2nd edn.，Cold spring harbour, New York.6. Verduyn, C.，Postma，E.，Scheffers，W. A. and Van Di jken，J. P. (1992) Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts :a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast 8，501—517.7. Gietz, R. D. and Woods, R. A. (2002) Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymo1. 350，87-96.8. Inoue，H.，Nojima，H. and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96，23—28.9. Goldstein, A. L. and McCusker, J. H. (1999) Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 15， 1541-1553.10. Andreasen，A. A. and Stier，T. J. (1953) Anaerobic nutrition of Saccharomyces cerevisiae.I. Ergosterol requirement for growth in a defined medium. J. Cell Physiol. 41, 23-36.
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权利要求
一种具有将木糖直接异构为木酮糖能力的真核宿主细胞，其中所述宿主细胞包含增加磷酸戊糖途径流量的遗传修饰，且所述宿主细胞具有至少346mg木糖/g生物量/小时的木糖消耗比速率。
2.权利要求1的宿主细胞，其中所述遗传修饰包括磷酸戊糖途径非氧化部分的至少一 个基因的过表达。
3.权利要求2的宿主细胞，其中所述基因选自编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮 糖-5-磷酸差向异构酶、转羟乙醛酶和转醛醇酶的基因。
4.权利要求2的宿主细胞，其中所述遗传修饰包括至少编码转羟乙醛酶和转醛醇酶的 基因的过表达。
5.权利要求2-4任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包括增加特异性木酮糖 激酶活性的遗传修饰。
6.权利要求5的宿主细胞，其中所述遗传修饰包括编码木酮糖激酶的基因的过表达。
7.权利要求2-6任一项的宿主细胞，其中所述过表达的基因是宿主细胞内源的。
8.权利要求1-7任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括降低宿主细胞中非特异性 醛糖还原酶活性的遗传修饰。
9.权利要求8的宿主细胞，其中所述遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的基因的 表达或者使所述基因失活。
10.权利要求9的宿主细胞，其中所述基因是通过缺失该基因的至少一部分或者破坏 该基因而失活。
11.权利要求8或9的宿主细胞，其中宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的每个基因 的表达均被降低或失活。
12.前述任一项权利要求的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母，优选是属于如下 属之一的酵母糖酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，假丝酵母 属(Candida)，毕赤酵母属(Pichia)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，汉逊酵母属 (Hansenula)，克勒克酵母属(Kloeckera)，许旺酵母属(Schwanniomyces)和耶氏酵母属 (Yarrowia)。
13.权利要求12的宿主细胞，其中所述酵母属于如下物种之一酿酒酵母 (S. cerevisiae)、S. bulderi、S. barnetti、少孢酵母(S. exiguus)、葡萄汁酵母 (S. uvarum)、糖化酵母(S. diastaticus)、乳酸克鲁维斯酵母(K. Iactis)、马克斯克鲁维酵 母(K. marxianus)、脆壁克鲁维酵母(k. fragilis)。
14.权利要求1-11任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌，优选是属 于如下属之一的丝状真菌曲霉属(Aspergillus)，木霉属(Trichoderma)，腐质霉属 (Humicola),枝顶孢属(Acremonium),镰孢菌属(Fusarium)禾口青霉属(Penicillium)0
15.前述任一项权利要求的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达赋予宿主细胞产生至少 一种发酵产物能力的一或多种酶，所述发酵产物选自乙醇、乳酸、3_羟基丙酸、丙烯酸、乙 酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。
16. 一种生产乙醇的方法，其中所述方法包括如下步骤(a)发酵含有木糖来源及权利要求1-14任一项的修饰的宿主细胞的培养基，其中所述 宿主细胞发酵木糖成为乙醇，及任选地(b)回收所述乙醇。
17.权利要求16的方法，其中所述培养基还含有葡萄糖来源。
18.权利要求16或17的方法，其中乙醇体积生产率为至少0.5g乙醇/升/小时。
19.权利要求16-18任一项的方法，其中乙醇产量为至少50%。
20.一种生产发酵产物的方法，所述发酵产物选自乳酸，3-羟基-丙酸，丙烯酸，乙酸， 琥珀酸，柠檬酸，氨基酸，1，3_丙二醇，乙烯，甘油，β -内酰胺抗生素和头孢菌素，所述方法 包括如下步骤(a)发酵含有木糖来源及权利要求15的修饰的宿主细胞的培养基，其中所述宿主细胞 发酵木糖成为发酵产物，及任选地，(b)回收所述发酵产物。
21.权利要求20的方法，其中所述培养基还含有葡萄糖来源。
全文摘要
本发明涉及真核宿主细胞中的进一步遗传修饰，所述真核宿主细胞已经被转化而表达赋予宿主细胞使木糖异构为木酮糖的能力的木糖异构酶。所述进一步遗传修饰目的在于改善木糖代谢的效率，包括例如降低非特异性醛糖还原酶活性、增加木酮糖激酶活性及增加磷酸戊糖途径的流量。本发明的修饰的宿主细胞适于在利用木糖来源或者木糖和葡萄糖来源作为碳源的发酵过程中生产包括乙醇在内的各种发酵产物。
文档编号C12P7/18GK101914462SQ20101024313
公开日2010年12月15日 申请日期2005年7月15日 优先权日2004年7月16日
发明者威廉默斯·特奥多鲁斯·安东尼厄斯·马里亚·德拉特, 约翰内斯·彼得·范戴肯, 西普克·马尔滕·凯珀, 阿龙·阿德里安·温克勒, 雅各布斯·托马斯·普龙克 申请人:代尔夫特技术大学