专利名称：短葶飞蓬的dna多态性检测方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及短葶飞蓬的DNA多态性检测方法及其用途，具体地，本发明采用扩增 片段长度多态性技术进行短葶飞蓬的DNA多态性检测
背景技术：
扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)是在随 机扩增多态性(RAPD)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术上发展起来的DNA多态性检测 技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制 备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时 弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时 检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定 方面的研究，构建遗传图谱和指纹图谱等。AFLP比RAPD、ISSR能更全面地揭示遗传差异， 指纹图谱更详细。短葶飞蓬[Erigeronbreviscapus (Vant.)Hand.-Mazz]，俗名为灯盏花、灯盏细 辛、灯盏草、灯顶草、地朝阳、东菊、双葵花等，产于湖南，广西，贵州，云南，西藏等省区，常见 于海拔1200-3500米的中山和亚高山开旷山坡，草地林缘，为民间常用的中草药，全草入 药，具散寒解表、祛风除湿、活络止痛的作用。迄今为止，针对短葶飞蓬的研究主要集中于化学成分的提取和鉴定，生理形态、栽 培技术以及同工酶方面，而对于其分子水平的研究工作较少。鉴于短葶飞蓬具有重要的医 用价值，可作为重要的经济植物，因此，得到高信息量的短葶飞蓬遗传数据，摸索建立其DNA 分子指纹图谱，在短葶飞蓬的资源保护、引种驯化、遗传育种、新品种保护等方面都具有重大意义。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种短葶飞蓬的DNA多态性检测方法。本发明的另一个目的是提供上述方法的用途。本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。本发明提供了一种短葶飞蓬的DNA多态性检测方法，所述方法采用扩增片段长度 多态性技术对短葶飞蓬的DNA多态性进行检测，具体包括以下步骤1)短葶飞蓬基因组DNA 的酶解与连接；2)预选择扩增；3)选择扩增；其中，步骤3)中进行选择扩增的引物序列包 括EcoRI 为 5，-GACTGCGTACCAATTCAGG-3，或 5，-GACTCCGTACCAATTCCGA-3，，禾口Mse I 为 5，-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3，。优选地，所述方法步骤1)中的酶解是对短葶飞蓬基因组DNA进行EcoRl/Msel双 酶切，所述酶切体系如下EcoRl酶消化体系(20ul体系/样品)为EcoRI lul (10U/ul)， 10X缓冲液2ul，样品(总DNA)5ul，ddH2012ul ；Msel酶消化体系(20ul体系/样品)为Msel 2ul (lU/ul)，10 X缓冲液2ul，EcoRl酶切产物15ul，ddH20 lul ；酶切反应条件如下 EcoRl酶消化条件为37°C 2小时，65°C 30分钟，终止反应；Msel酶消化条件65°C 2小时， 80 °C 30分钟，终止反应。优选地，所述方法步骤1)中采用以下接头连接酶切片段的末端EcoRl 接头为 5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，(正向)，3，-CATCTGACGCATGGTTAA-5，(反向)；Msel 接头为 5，-GACGATGAGTCCTGAG-3，(正向)，3，-TACTCAGGACTCAT-5，(反向)；连接反应条件如下T4DNA连接酶，22°C 3小时，65°C 10分钟，终止反应。优选地，所述方法步骤1)中得到的连接产物经过20倍稀释后作为DNA模板进行 步骤2)中的预选择扩增。优选地，所述方法步骤2)中进行预选择扩增的引物序列包括EcoRl 5，-GTAGACTGCGTACCAATTC-3，，禾口Mse I :5’ -GACGATGAGTCCTGAG-3，。优选地，所述方法步骤2)中预选择扩增的扩增体系(20ul体系/样品)为模板DNA 4ul，引物 lul，AFLP Core Mix 15ul，ddH20 13. 8ul,MgCl2 1. 6ul, dNTPs (2. 5Mm) 1. 6ul, Taq 酶(lU/ul)lul，10X 缓冲液 2ul ；PCR 反应条件如下:94°C 2min,94°C 20s，56°C 30s，共 20 个循环，72°C 2min，60°C 30min。优选地，所述方法步骤2)中预选择扩增得到的产物经过20倍稀释后作为DNA模 板进行步骤3)中的选择扩增。优选地，所述方法步骤3)中选择扩增的扩增体系(20ul体系/样品)为DNA模板 4ul，引物 lul，AFLP Core Mix 15ul ;PCR 反应条件如下94°C 2min，94°C 20s，66°C 30s, 每循环降 1°C，共 10 个循环，72°C 2min，94°C 20s，56°C 30s，共 20 个循环，72°C 2min,60°C 30mino优选地，所述方法还包括采用变性电泳和银染方法检测步骤3)中所得到的扩增 产物的步骤。此外，本发明提供了上述方法在建立短葶飞蓬DNA分子指纹图谱中的应用。本发明还提供了上述方法在短葶飞蓬的遗传育种、资源保护、引种驯化或品种优 化中的应用。由此可见，本发明提供了一种短葶飞蓬的DNA多态性检测方法，采用扩增片段长 度多态性(AFLP)技术进行短葶飞蓬的DNA多态性检测，按照在100 500bp范围内的条带 数目及分布情况，以及多态性条带数目，筛选出最合适的引物组合，可得到高信息量的灯盏 花遗传数据。此外，本发明还优化了进行AFLP反应的各种反应条件。通过本发明提供的方 法，可得到高信息量的灯盏花遗传数据，建立其DNA分子指纹图谱，在灯盏花的遗传育种、 资源保护、引种驯化、品种优化起到关键作用，对促进灯盏花种植产业化、规范化和科学化 具有重大意义。
以下结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中
图1为实施例1中所提取总DNA的基因组部分检测电泳结果图，其中从右往左依 次为Marker，样品1_7。图2为实施例1中采用Ecorl酶切基因组DNA的部分电泳结果图，其中从右往左 依次为Marker，样品1-20。图3为实施例2中采用引物E3M4进行AFLP反应得到的部分扩增电泳结果图。图4为实施例2中采用引物E1M5进行AFLP反应得到的部分扩增电泳结果局部放 大图，其中箭头1指示的条带在样品1中特异扩增；箭头2指示的条带在样品1、5、15、17中 扩增；箭头3指示的条带在样品1、17中扩增；箭头4指示的条带在样品2中特异扩增；箭 头5指示的条带在样品1中没有扩增；箭头6指示的条带在样品1、15、17中扩增；箭头7的 条带在样品1中没有扩增；箭头8指示的条带在样品21中特异扩增。图5为实施例2中对40份实验样品的AFLP聚类分析结果图。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。实施例1总DNA提取本实施例分别提取了 40份灯盏花实验材料的总DNA，以备用于AFLP对这些材料进 行遗传多样性及分子标记指纹图谱分析研究。表1实验材料名称及来源 具体的DNA提取方法如下取0. 2g实验材料的幼嫩叶片加液氮研磨至粉末状，加 入1ml提取缓冲液(含2% CTAB)置于65°C保温lh，其间不断摇勻。取出后lOOOOrpm离 心10min(4°C )。离心结束后将上清液转到另一干净离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇 (24 1)，其间不断摇勻。静置片刻后lOOOOrpm离心10min(4°C)，取出上清液加入等体积 的异丙醇置于-20°C进行沉淀约30min。5000rpm离心5min(4°C )，弃去上清液，加入1ml 75%的酒精洗涤沉淀，重复二次。然后将离心管在室温无菌风干至透明状，加入30 yl TE 或ddH20溶解沉淀。加入2 ill RNA酶将离心管置于37°C温箱中l_2h后，-20°C保存，上样 3U 1,0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量。核酸的嘌呤、嘧啶中都有共轭双键，对紫外光有强烈的吸收，天然双链DNA在 260nm处的吸收值与280nm处吸收值比值(A260/A280)在1. 80左右，低则说明制剂中蛋白 质可能未除尽，高则说明制剂中还有RNA。本发明采用CTAB法提取的总DNA样品大部分都 呈现乳白色，少数几个有颜色，可能是酚类物质未去除干净，材料出现褐化现象，或者是色 素未去除干净。用0.8%琼脂糖凝胶电泳(参照《分子克隆实验指南(第三版)》，黄培堂等 译，科学出版社2002年9月出版)检测的结果见图1，DNA为一条清晰完整的带，没有明显 的拖尾，有少部分未降解完全的RNA带。总体上，DNA片段大小较一致，经过计算和酶切反 应检测(用EcoRI和Msel进行双酶切，EcoRI酶消化条件37°C 2hrs 65V 30min终止反 应；Msel酶消化条件65°C 2hrs 80°C 30min终止反应)(结果见图2)也表明DNA的含量 (100ng/u 1)和质量也达到了 AFLP实验的要求。实施例2 AFLP反应本实施例为对实施例1中提取的基因组DNA进行AFLP反应，具体包括以下步骤1)酶切和连接对实施例1中提取的基因组DNA进行EcoRl/Msel双酶切，酶切体系和条件如下(1) EcoRI 酶消化体系(20ul 体系 / 样品):EcoRI lul (10U/ul)，10 X 缓冲液 2ul， 样品(总 DNA)5ul，ddH20 12ul ；EcoRI 酶消化条件37°C 2h，65°C 30min，终止反应；(2)Msel 酶消化体系(20ul 体系 / 样品):MseI 2ul (lU/ul)，10X 缓冲液 2ul，样 品(EcoRI 酶切产物)15ul, ddH20 lul ；Msel酶消化条件65°C 2小时h，80°C 30分钟min，终止反应；将酶切产物与合成的接头片段连接，其中的接头序列如下(1)EcoRI 接头5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，(正向)，3，-CATCTGACGCATGGTTAA-5，(反向)；(2)Msel 接头5，-GACGATGAGTCCTGAG-3，(正向)，3，-TACTCAGGACTCAT-5，(反向)。连接条件为T4DNA连接酶，22°C 3h，65°C lOmin，终止反应。2)预选择扩增将5ul连接混合液与等体积的限制性酶解液(EcoRI和Msel)混合后，在16°C下保 温过夜，取5ul混合液，然后加lOmmol/L Tris(pH 8. 5)至100ul，按20倍稀释此混合液作
7为预选择扩增的模板DNA。预扩增引物为EcoRI:5，-GTAGACTGCGTACCAATTC-3，，禾口Mse I :5’ -GACGATGAGTCCTGAG-3，。进行预选择扩增体系(20ul体系/样品)模板DNA 4ul，引物(Msel/EcoRl) lul， AFLP Core Mix 15ul，ddH20 13. 8ul,MgCl2 1. 6ul，dNTPs (2. 5Mm) 1. 6ul，Taq酶(lU/ul) lul， 10 X缓冲液2ul。预选择扩增反应条件94°C2min，94°C 20s,56°C 30s，共 20 个循环，72°C 2min， 60 °C 30min。3)选择扩增预选择扩增得到的产物稀释20倍后作为选择扩增的模板DNA。引物序列分别为表2中列出的7对引物组合。选择扩增体系(20ul体系/样品)模板DNA 4ul，引物(Msel-XXX/ EcoRl-XXX)lul, AFLP Core Mix 15ul ；选择扩增反应条件94°C 2min，94°C 20s，66°C 30s，每循环降1°C，共10个循环， 72°C 2min，94°C 20s,56°C 30s，共 20 个循环，72°C 2min,60°C 30min。4)检测扩增产物通过变性电泳和银染方法显示条带。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增反应产物进行检测上样液20ul， marker (Size standard-600) 0. 2ul，样品 3ul (稀释 10 倍)。银染方法如下1) 200ml 10%酒精(乙醇)+0. 5% 乙酸，3_5min ；2) 200ml 0. 2% AgN03, 5_8min ；3)水洗 lmin ；4) 200ml 0. 2% Na2S203, lmin (在 200ml 水中加入 1% Na2S203 400ul)；5) 200ml 1. 5% NaOH+1 % 甲醛显色；6)水洗。选取100bp_500bp范围内的条带，按照相同迁移位上有扩增带记为1，无带为 0的方法记录电泳谱带，仅清晰、可重复的扩增带才被记录。得到的AFLP数据矩阵用 NTSYSpc-2. 02软件进一步进行分析。不同选择扩增的引物结果如表2所示。表2 AFLP引物筛选及扩增结果 表2中的各引物序列如下
El (SEQ.ID.NO1)5，-GACTGCGTACCAATTCAGG--3
E2 (SEQ.ID.NO2)5，-GACTGCGTACCAATTCACT--3
E3 (SEQ.ID.NO3)5，-GACTCCGTACCAATTCAGA--3
E4 (SEQ.ID.NO4)5，-GACTCCGTACCAATTCACT--3
E5 (SEQ.ID.NO5)5，-GACTCCGTACCAATTCCGA--3
M2 (SEQ.ID.NO6)5，-GATGAGTCCTGAGTAACTC--3
M4 (SEQ.ID.NO7)5，-GATGAGTCCTGAGTAACGA--3
M5 (SEQ.ID.NO8)5，-GATGAGTCCTGAGTAACAA--3本发明从众多已知的引物组合中，筛选出对于灯盏花来说进行AFLP反应的最佳 引物组合E1M5或E5M5。从表2中可以看出，7对引物共扩增出352条条带，多态性条带为151条，占总 条带的42. 89%，引物E1M5扩增得到的扩增条带和多态性条带最多，多态性位点比例达 52.63%。引物E3M4的部分扩增结果如图3所示。引物E1M5对样品1、2、3、15、17、21的特 异性电泳条带局部放大图见图4。总体来说，用AFLP方法可以检测得到各样品间有好的多态性。AFLP指纹特征非 常明显，尤其是六个新选育种材料(即表1中样品1号、2号、3号、15号、17号、21号)的 AFLP图谱特征有明显差异，且不同于其它灯盏花材料，由此说明这些材料遗传物质(基因) 不同于其它材料。将得到的AFLP数据矩阵用NTSYSpc-2. 02软件进一步进行分析，聚类分 析结果见图5。由图5可以看出，供试的40份材料遗传距离在0. 05-0. 26之间，在遗传距 离为0. 186 (GS = 0. 814)处，可将供试的40个样品分为5个聚类群，其中19号样品、20号 样品、36号样品与其它各样品间的差异较大，可单独把它各列为一类；样品11和14归为一 类；其余35个样品归为一类。从遗传多样性角度来看，这些材料的多样性指数不高，表明这 些材料之间亲缘关系较近，它们的一些性状如产量、有效药用成分含量、生态适应性差异或 变异，仅是由一部分基因变化引起的。
权利要求
一种短葶飞蓬的DNA多态性检测方法，其特征在于，所述方法为扩增片段长度多态性技术，包括以下步骤1)短葶飞蓬基因组DNA的酶解与连接；2)预选择扩增；3)选择扩增。其中所述步骤3)中进行选择扩增的引物序列包括EcoRI为5’ GACTGCGTACCAATTCAGG 3’或5’ GACTCCGTACCAATTCCGA 3’，和Mse I为5’ GATGAGTCCTGAGTAACAA 3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤1)中的酶解是对短葶飞蓬 基因组DNA进行EcoRl/Msel双酶切；优选地，所述酶切体系如下EcoRl酶消化体系(20ul体系/样品)为EcoRI lul (10U/ ul)，10X缓冲液2ul，样品(总DNA)5ul，ddH20 12ul ；Msel酶消化体系(20ul体系/样品) 为 Msel 2ul (lU/ul)，10X 缓冲液 2ul, EcoRI 酶切产物 15ul, ddH20 lul ；更优选地，所述酶切反应条件如下EcoRl酶消化条件为37°C 2小时，65°C 30分钟，终 止反应；Msel酶消化条件为65°C 2小时，80°C 30分钟，终止反应。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用以下接头连接酶切片段的末端 EcoRI 接头为 5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，(正向)，3，-CATCTGACGCATGGTTAA-5，(反向)； Msel 接头为 5，-GACGATGAGTCCTGAG-3，(正向)，3，-TACTCAGGACTCAT-5，(反向)； 优选地，所述连接反应条件如下T4DNA连接酶，22°C 3小时，65°C 10分钟，终止反应。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法步骤1)中得到的 连接产物经过20倍稀释后作为DNA模板进行步骤2)中的预选择扩增。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法步骤2)中进行预 选择扩增的引物序列包括EcoRI :5’ -GTAGACTGCGTACCAATTC-3’，禾口 Mse I :5’ -GACGATGAGTCCTGAG-3，；优选地，所述方法步骤2)中预选择扩增的扩增体系(20ul体系/样品)为模板DNA 4ul，引物 lul，AFLP Core Mix 15ul, ddH20 13. 8ul,MgCl2 1. 6ul, dNTPs (2. 5Mm) 1. 6ul, Taq 酶(lU/ul)lul，10X 缓冲液 2ul ；更优选地，PCR反应条件如下94°C 2min，94°C 20s,56°C 30s，共20个循环，72 °C 2min,60 °C 30min。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法步骤2)中预选择 扩增得到的产物经过20倍稀释后作为DNA模板进行步骤3)中的选择扩增。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法步骤3)中选择扩 增的扩增体系为(20ul体系/样品)DNA模板4ul，引物lul, AFLP Core Mix 15ul ；优选地，PCR反应条件如下94°C 2min，94°C 20s，66°C 30s，每循环降1°C，共10个循 环，72°C 2min，94°C 20s，56°C 30s，共 20 个循环，72°C 2min，60°C 30min。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用变性电泳和银染方法检测步骤3)中所得到的扩增产物的步骤。
9.权利要求1至8中任一项所述方法在建立短葶飞蓬DNA分子指纹图谱中的应用。
10.权利要求1至9中任一项所述方法在短葶飞蓬的遗传育种、资源保护、引种驯化或 品种优化中的应用。
全文摘要
本发明提供一种短葶飞蓬的DNA多态性检测方法及其用途。本发明采用扩增片段长度多态性技术进行短葶飞蓬的DNA多态性检测，筛选出最合适的引物组合并优化了反应条件。采用本发明的方法，可以有效应用于短葶飞蓬的遗传育种、资源保护、引种驯化或品种优化等方面。
文档编号C12Q1/68GK101914629SQ20101027196
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者胡志祥, 谢德汝, 鸭乔, 龙祥 申请人:云南施普瑞生物工程有限公司