专利名称：一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是医药生物技术，更详细地讲是关于海冰微藻和细菌等微生物提炼的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖及其制备方法。
背景技术：
大量的研究发现临床上许多疾病与机体的自由基损伤、氧化损害有关。抗氧化多糖的发现，无疑为氧化损伤相关疾病的治疗带来了新的希望，与其他外源性抗氧剂相比，抗氧化多糖具有低毒、安全、来源广等特点。在研究抗氧化多糖的过程中发现，多糖的抗氧化性可能是多糖抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗辐射等其他活性的作用机理之一。微生物来源的抗氧化多糖，尤其是细菌和真菌的胞外多糖，具有易于分离纯化、产量高等优势颇受青睐。南极海洋环境寒冷，一些区域终年覆盖冰雪，空间的特殊性和海冰形成活动季节的大幅浮动，使微生物栖息环境具有高度的多样性，形成了不同的微生物群落。生存于南极生态系统中的微生物的多样性是开发具有特殊应用价值的活性物质(包括EP^)的资源库。南极海冰中发现了大量的微生物(海冰微藻和细菌)及其产生的胞外多糖，这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中，提供了海冰和冰水界面的有机碳，是能源传输的主要物质；并可保护细胞在结冰时免受冰晶的伤害，缓冲PH以及盐浓度的变化，可以降低其它化学物质的伤害。与常规环境的细菌相比，极地细菌胞外多糖的结构组成具有特异性，其复杂的糖链缠结与分子内的缔合增加，形成了独特多聚体三级结构和物理特性。极地细菌胞外多糖富含糖醛酸羧基基团，氨基糖氨基化合物，硫酸盐和羟基基团；且有高比例的羟基基团，尤其硫酸化程度，这些功能基团均与抗氧化活性相关。因此从南极微生物中发现结构新颖、活性独特的胞外多糖，阐明其结构与功能的关系，对于南极微生物资源的开发利用具有重要的意义。然而，具有抗氧化活性的南极微生物胞外多糖的研究尚未见报道。因此，从海冰微藻和细菌中获取和提炼胞外多糖是医药生物技术的重大突破，也是开辟和利用南极海冰自然资源的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能消除上述缺点，具有方法简单、结构新颖、活性独特、性能稳定、功能奇特、成本低廉、药用价值大，抗氧化性强、可调节和提高机体免疫力等特点的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖及其制备方法。尤其是采用液体深层发酵、分离纯化的制备方法，以及科学的试验手段，首创性的从海冰中获得微生物抗氧化活性菌胞外多糖及其提炼方法，开创了南极海冰微生物综合利用的新方法和途径，开发了海冰微生物的药用价值和用途，获得了海冰微生物提炼具有抗氧化活性菌胞外多糖的方法，自然资源得到有效地开发和利用，降低了生产和使用成本，提高了社会和经济效益，海冰微生物多糖的获得是医药生物技术的重大突破，为开发研究抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗辐射等其他活性的作用机理，改善和提高机体免疫力的药品和食品奠定了基础，是抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的专用制备方法。
本发明的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖是指NJ-B3多糖，它是一株多糖产率高的南极菌I^seudoalteromonas sp. NJ-B3，通过工艺，得到分离纯化的多糖，初步分析其结构组成；并提供了该多糖清除氧自由基的活性，为其在生物技术领域的应用奠定基础。多糖NJ-B3由甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为4 1，多糖NJ-B3分子量为2112Da。 其制备方法为种子制备一深层发酵一制备发酵液一去除蛋白一分离纯化一冷冻干燥一多糖纯品。本发明的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法，即菌胞外多糖-NJ-B3多糖提取纯化方法如下1、种子制备培养基蔗糖25g，豆粉 12. 5g, K2HPO4O. 2g, Na2SO4O. lg，FeSO4 ·7Η200· 01g，CaC032g， 陈海水lOOOmL，pH值7. 2，121°C灭菌20min;按5%的比例接入NJ-B3的菌悬液，10°C、 120rpm，培养4 备用。2、深层发酵制备胞外多糖发酵液培养基蔗糖50g，豆粉 25g，K2HPO4O. 2g，Na2SO4O. lg, FeSO4 · 7H20 0. 01g，CaC033g， 陈海水lOOOmL，pH值7. 2，121°C灭菌20min。100L发酵罐的加料量为70L，按5 7%的比例接入NJ-B3种子液，发酵温度利用外接低温循环水控制，发酵温度利用循环冷冻机控制， 罐内温度保持在10 士 1°C;通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；不断搅拌，搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。培养120小时，胞外多糖产量可达3. 8g/L。3、胞外多糖发酵液的后处理将发酵液以lOOOOr/min转速离心IOmin去菌体。将去菌体发酵液加入三倍体积的 95%乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀。采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-B3胞外多糖溶液中加入1. 5倍体积的10% TCA溶液，混合均勻，于冰箱中静置4 他，再以5000r/ min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析，层析柱100cmXl. 2cm，凝胶类型=S^hadex G-50 ；离子交换层析，层析柱25cmXl. 6cm，凝胶类型DEAE-kpharose Fast Flow的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。结合胞外多糖的组成分析，对本发明做进一步说明。本发明方法制备的NJ-B3多糖的分子量及单糖组成分析方法及结果如下1、采用高效凝胶渗透色谱法(HP-GPC)测定南极菌NJ-B3胞外多糖分子量。分析条件TSK-GEL G2000PW, 300 X 7. 5mmID 色谱柱；流动相 0. lmol/L Na2SO4 溶液，流速 IOml/ min;柱温60°C，进样量2μ1，示差折光检测器检测。以标准Dextran T系列葡聚糖作标准曲线，计算分子量。分析结果表明NJ-B3多糖的分子量为2112Da。2、单糖组成分析IOmg纯化多糖中加入2mol/L三氟乙酸2ml置于100°C水浴中水解18h，减压浓缩至干，加入IOmg盐酸羟胺和0. 5ml吡啶，放入90°C水浴中加热反应30min分钟并振荡。取出后冷至室温，加入0. 5ml醋酸酐，90°C下继续反应30min分钟进行乙酰化。反应产物减压浓缩至干，加入0. 5ml氯仿萃取。同时将D-阿拉伯糖，D-木糖、D-半乳搪、D-葡萄糖和 D-甘露糖按上述步骤转化成糖氰乙酸酯衍生物作为标准对照，接着进行气相(GC)色谱分析。气相色谱分析条件0V-225柱，载气队，90ml/min ；柱温240°C，检测器温度250°C，气化室温度280°C，氢火焰离子检测器。分析结果表明NJ-B3多糖由甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为4 1。本发明制备的NJ-B3胞外多糖为能够有效清除体外的O2 和· 0H，显示出良好的抗氧化活性。该多糖在医药、生物技术领域、食品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。本发明的特点在于1.首次以南极海冰菌I^seudoalteromonas sp. NJ-B3为菌株发酵生产胞外多糖， 建立该菌株合成分泌的胞外多糖的优化发酵生产工艺；2.提供了一种南极菌胞外多糖的潜在用途体外抗氧化试验表明，NJ-B3多糖能够显著的清除多种活性氧自由基，并能有效抑制连苯三酚的自氧化速率。具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的研究还未见报道，本发明制备的多糖纯品为生物技术产品，在医药、生物技术领域、食品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。
具体实施例方式结合实施例进一步对本发明做详细的说明实施例1、菌悬液的制备南极菌NJ-B3源自中国第M次南极科学考察乌拉圭站(S62° 11’ 50. 52”， W58° 55.，50. 4”)采集的海冰样品，采用佐贝尔2216E培养基筛选、分离获得，经16S rDNA 鉴定为I^seudoalteromonas属。NJ-B3采用hbell2216E固体培养基划线保存于4°C冰箱中，NJ-B3接入装有2216E液体培养基的三角瓶，10°C、150rpm振荡培养48h，做菌悬液用。Zobell2216E固体培养基蛋白胨5g，酵母粉lg，琼脂粉15g，陈海水1000ml ；Zobell2216E液体培养基蛋白胨5g，酵母粉lg，陈海水1000ml ；实施例2、南极菌NJ-B3胞外多糖的制备1、种子培养基为蔗糖 25g，豆粉 12. 5g，K2HPO4O. 2g，Na2SO4O. lg, FeSO4 · 7H20 O.Olg，CaC032g，陈海水 IOOOmL, pH 值 7. 2，121°C灭菌 20min ；按 5% 的比例接入 NJ-B3 的菌悬液，IO0C、120rpm,培养4 备用。2、深层发酵制备胞外多糖发酵液培养基蔗糖50g，豆粉 25g，K2HPO4O. 2g，Na2SO4O. lg, FeSO4 · 7H20 0. 01g，CaC033g， 陈海水1000mL，pH值7. 2，121°C灭菌20min。100L发酵罐的加料量为70L，按5 7%的比例接入NJ-B3种子液，发酵温度利用循环冷冻机控制，罐内温度保持在10士 1°C ；通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。发酵120h，胞外多糖产量可达3. Sg/ L03、胞外多糖的后处理将发酵液以lOOOOr/min转速离心IOmin去菌体。将去菌体发酵液加入三倍体积的 95%乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀。采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-B3胞外多糖溶液中加入1. 5倍体积的10% TCA溶液，混合均勻，于冰箱中静置4 他，再以5000r/ min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。凝胶过滤层析和离子交换层析优选凝胶过滤层析柱=IOOcmXl. 2cm，凝胶类型kphadex G-50 ；离子交换层析柱25cmXl. 6cm，凝胶类型DEAE_S印harose Fast Flow。实施例3、NJ-B3胞外多糖的抗氧化测试(1) NJ-B3多糖对0 · _的清除作用向干燥比色皿内依次加入pH7.8，0.05mol/L磷酸盐缓冲液、0. 13mol/L蛋氨酸、 2X 10_5mOl/L核黄素、不同浓度的样品多糖溶液或1. 3X10^mol/L抗坏血酸、7 X 10_4mOl/L 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)各0.4mL。(空白不加蛋氨酸，空白与对照均不加清除剂)，以双蒸水稀释至4. OmL。混合液在35°C恒温，40001x下光照20min进行还原，以黑暗中止反应。 用721分光光度计在560nm处测量各管溶液的光吸收值。计算平均清除率d d = (A 对照-A 样品)X 100 % /A 对照B3多糖对0 2·-的清除效率见表1。表1NJ-B3多糖对02 · _的清除作用
权利要求
1.一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖，其特征在于是指NJ-B3胞外多糖，它是一株多糖产率高的南极菌I^seudoaleromonas sp. NJ-B3,通过工艺，得到分离纯化的多糖，该多糖具有清除氧自由基的活性。
2.用于权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法，其特征在于该制备方法为种子制备一深层发酵一制备发酵液一去除蛋白一分离纯化一冷冻干燥一多糖纯品。
3.如权利要求1或2所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法， 其特征在于是NJ-B3胞外多糖的制备方法，从南极菌NJ-S2发酵液中分离提取的胞外多糖EPS- I的步骤如下a、种子制备培养基蔗糖 25g，豆粉 12. 5g，K2HPO4O. 2g，Na2SO4O. lg，FeSO4 · 7Η200· Olg，CaC032g，陈海水1000mL，pH值7. 2，121°C灭菌20min ；按5%的比例接入NJ-B3的菌悬液，10°C、120rpm， 培养48h备用；b、深层发酵制备胞外多糖发酵液培养基蔗糖 50g，豆粉 25g，K2HPO4O. 2g，Na2SO4O. lg, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaC033g，陈海水IOOOmL, pH值7. 2，121°C灭菌20min，100L发酵罐的加料量为70L，按5%的比例接入 NJ-B3种子液，发酵温度利用外接低温循环水控制，发酵温度利用外接低温循环水控制，罐内温度保持在12士 1°C;通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；不断搅拌，搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡，培养120小时，胞外多糖产量可达3. 8g/L ；c、胞外多糖发酵液的后处理；将发酵液以lOOOOr/min转速离心IOmin去菌体，将去菌体发酵液加入三倍体积的95% 乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀，采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-B3胞外多糖溶液中加入1. 5倍体积的10% TCA溶液，混合均勻，于冰箱中静置4 乩，再以5000r/min 的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品，多糖粗品复溶， 经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。
4.如权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖，其特征在于所述的多糖NJ-B3是由甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为4 1，多糖NJ-B3分子量为2112Da。
5.如权利要求1或2所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法， 其特征在于凝胶过滤层析柱100cmXl. 2cm，凝胶类型=S^hadex G-50。
6.如权利要求1或2所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法， 其特征在于离子交换层析柱25cmXl. 6cm，凝胶类型DEAE_SepharoseFast Flow。
7.如权利要求1或2所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法， 其特征在于所述的南极菌胞外多糖NJ-B3的应用，可有效清除体外的O2 和· 0H，具有良好的抗氧化活性。
全文摘要
一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖是指NJ-B3胞外多糖，由甘露糖和葡萄糖按4∶1成分组成，其分子量为2112Da。具有清除氧自由基的活性，方法简单、活性独特、性能稳定、药用价值大，抗氧化性强、可调节和提高机体免疫力等特点。首创性的从海冰中获得微生物抗氧化活性菌胞外多糖及其提炼方法，开创了海冰微生物综合利用的新方法和途径，开发了海冰微生物的药用价值和用途，获得了海冰微生物提炼具有抗氧化活性菌胞外多糖的方法，海冰微生物多糖的获得是医药生物技术的重大突破，为开发研究抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗辐射等其他活性的作用机理，改善和提高机体免疫力的药品和食品奠定了基础，是抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的专用制备方法。
文档编号C12R1/01GK102399838SQ20101028240
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者何培青, 李江, 林学政, 沈继红, 黄晓航 申请人:国家海洋局第一海洋研究所