专利名称：辅助鉴定人类星状病毒的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定人类星状病毒的方法及其专用引物。
背景技术：
星状病毒科(Astroviridae)是一种感染哺乳类及鸟类的病毒，它的基因体是不分节，正股的RNA，它没有套膜且蛋白壳体为正20面体，主要造成腹泻、下腹痛等症状， 主要是借由水及饮食传播。星状病毒科包括哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽星状病毒属(Avastrovirus)。哺乳动物星状病毒属的代表种为人类星状病毒(Human astrovirus)。禽星状病毒属的代表种为火鸡星状病毒(Turkey astrovirus)。人星状病毒于1975年从腹泻婴儿粪便中分离得到，球形，28-30nm，无包膜，电镜下表面结构呈星形，有5-6个角。核酸为单正链RNA，7. 01Λ，两端为非编码区，中间有三个重叠的开放读码框架。星状病毒与腹泻密切相关，目前认为星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因，仅次于轮状病毒。此外，老年人和免疫缺陷患者也是星状病毒感染的高危人群，人类免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生星状病毒感染均已有报道。星状病毒亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一。该病毒呈世界性分布，粪-口传播，易感者为5岁以下婴幼儿，其中5% -20%为隐性感染。在温带地区，冬季为流行季节。 病毒侵犯十二指肠粘膜细胞，并在其中大量增殖，造成细胞死亡，释放病毒于肠腔中。在急性期，粪中病毒可达1010病毒体克，是医院内感染的主要病原体。潜伏期3-4天，症状包括发热、头痛、恶心、腹泻，后者可持续2-3天，甚至更长。环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)是在实验过程中使核酸链通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，而达到检测目的。由于反应中使用了两对特异性引物，只有两对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进行，因此这种检测方法的特异性很高。其中一对特殊的引物的5’端含有一端与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就形成了一个类似 铃状回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，从而保证了扩增的持续进行，最终，扩增产物在核酸电泳胶上形成连续的梯状条带。从RT-LAMP的原理和特点上不难看出，该方法在RNA 病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方面无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面首先，它的检测时间可以缩短到两个小时以内，灵敏度可以达到检测10个拷贝左右的病毒核酸分子；除了应用一些常用的聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作；第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，在实验设施中反转录与扩增过程在恒温条件下一步完成，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会；第三，扩增反应只有在四条引物完全与识别的靶序列中六个结合区匹配的情况下才能顺利进行，从而大大提高了反应的特异性；第四，RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸酶沉淀，因此肉眼可观察到阳性反应管中的白色混浊物；第五，也可在RT-LAMP反应体系中加入HNB染料，即可通过观察颜色变化指示阳性结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定人类星状病毒的方法及其专用引物。本发明提供的辅助鉴定人类星状病毒的专用引物，为如下(a)或(b)(a)由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示 DNA和序列表的序列4所示DNA组成的专用引物；(b)由序列表的序列1所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列2所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列3所示DNA的反向互补DNA和序列表的序列4所示DNA的反向互补 DNA组成的专用引物。所述专用引物可用于制备辅助鉴定人类星状病毒的试剂盒。本发明还保护一种辅助鉴定人类星状病毒的试剂盒，包括所述专用引物。所述试剂盒还可包括阳性质粒；所述阳性质粒可为含有序列表的序列5所示DNA 的质粒。所述阳性质粒具体可为将星状病毒A-X3178G基因(核苷酸如序列如序列表的序列5所示)反向插入pGH载体的SmaI酶切位点得到的重组质粒。所述弓I物或所述试剂盒可用于辅助鉴定人类星状病毒。本发明还保护一种辅助鉴定人类星状病毒的方法，包括如下步骤(1)提取待测病毒的RNA ；(2)将步骤(1)提取的RNA采用所述专用引物进行环介导逆转录等温扩增；(3)根据步骤O)的扩增产物鉴定待测病毒是否为人类星状病毒。所述环介导逆转录等温扩增的反应程序具体可为64_65°C水浴1-1. ^i°C。所述步骤C3)具体可为将环介导逆转录等温扩增的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳显示的扩增条带鉴定待测病毒是否为人类星状病毒。所述步骤C3)具体还可为将环介导逆转录等温扩增的扩增产物用限制性内切酶 Alu I进行酶切鉴定，根据酶切产物鉴定测病毒是否为人类星状病毒。如果Alu I酶切后得到155bp和64bp的链条DNA片段，待测病毒为候选的人类星状病毒。所述待测病毒具体可为人类星状病毒、人类轮状病毒或诺如病毒。 所述专用弓I物或所述试剂盒可用于辅助检测待测样本中是否含有人类星状病毒。本发明中，设计了用于鉴定人类星状病毒(Human astrovirus)的一组专用引物， 采用该组专用引物可以通过环介导逆转录等温扩增技术鉴定人类星状病毒，进而应用于人类星状病毒在各种水体(污水、再生水、地表水、饮用水)及肠道病患者(人、兽)粪便中的监测。应用本发明的专用引物鉴定人类星状病毒，具有准确、特异、灵敏、快捷的优势，主要体现在以下几个方面首先，扩增反应只有在四条引物完全与识别的靶序列中六个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善；第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，力口之扩增反应在65°C等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会，从而提高了检测的灵敏性和安全性；第三，所有的扩增反应在65°C左右等温条件下进行，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求，有利于基层水质监测及卫生防疫等的推广；第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间(0.5-2小时即可完成)。
图1为星状病毒质粒的结构示意图。图2为实施例2中环介导逆转录等温扩增后各反应管的照片。图3为实施例2中环介导逆转录等温扩增产物的电泳图。图4为实施例2中环介导逆转录等温扩增产物酶切后的电泳图。图5为实施例3中环介导逆转录等温扩增后各反应管的照片。图6为实施例3中环介导逆转录等温扩增产物的电泳图。图7为实施例4中环介导逆转录等温扩增后各反应管的照片。图8为实施例4中环介导逆转录等温扩增产物的电泳图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Betaine :SIGMA。HNB 染料SIGMA。Bst-DNA polymerase :NEB。AMV 反转录酶 Promega0 dNTP :biodee。Marker D2000 天根。实施例中用作阴性对照的水均为天根公司的 RNase-free ddH20。实施例1、辅助鉴定人类星状病毒的专用引物的设计一、辅助鉴定人类星状病毒的专用引物的设计通过NCBI、Blast、Primerexplorer V4 程序，获得 Astrovirus 基因序列并设计四条引物，两条外引物(aF3、aB3)和两条内引物(aFIP、aBIP)。四条引物的序列如下aF3(序列 1) :5，-CAACAGCAACCCTTGGGA-3，；aB3(序列 2) 5' -GGACAGTACCATTGACAGCA-3，；aFIP(序列；3) :5，-GCGTCCTTAACAAGGACAGGGTTTTTGTCGGGTCAAACACCAGTG-3，；aBIP (序列 4) :5，-GTGCAGGCGTTAGGTGCACATTTTTGCGCCAACCATAGAGGTTA-3，。由于LAMP扩增产物为环连接的长链DNA，不同的扩增片段难以通过电泳图谱判定大小作出鉴定。本发明中，通过在扩增引物中引入酶切位点，在扩增反应结束后可采用限制性内切酶消化的方法，较好的实现扩增产物的特异性长度检测。二、阳性对照的制备星状病毒质粒由北京奥科生物技术有限责任公司合成(发货质粒编号为 D9256-4)，结构示意图见图1，是将星状病毒A-X3178G基因(核苷酸如序列如序列表的序列 5所示，通过ncbi数据库获得)反向插入pGH载体的SmaI酶切位点得到的重组质粒。三、辅助鉴定人类星状病毒的试剂盒的制备辅助鉴定人类星状病毒的试剂盒由步骤一设计的四条引物(aF3、aB3、aFIP和 aBIP ；均由北京奥科生物技术有限责任公司合成)和步骤二制备的星状病毒质粒组成。实施例2、试剂盒(专用引物)的特异性
实验样本为2007年从疾病控制中心的腹泻患者(知情同意的志愿者)粪便中提取的人类星状病毒、人类轮状病毒和诺如病毒，公众可以从中国科学院生态环境研究中心获得。人类星状病毒(astrovirus)参考文献Liu C, Grillner L, Jonsson K et al.Identification of viral agents associated with diarrhea in young children during a winter season in Beijing, China. J Clin Virol. 2006,35 :69_72。人类轮状病毒(rotavirus)参考文献He，X. Q. ； Cheng, L. ； Zhang, D. Y. ；Li, W. ；Xie, Χ. Μ.； Ma, Μ. ；Wang, Ζ.J. First Molecular Detection of Group A Rotaviruses in Drinking Water Sources in Beijing, China. Bulletin of Environmental Contamination and ^Toxicology. 2009,83 :120-124。诺如病毒(norovirus):参考文献Liu C, Grillner L, Jonsson K et al. Identification of viral agents associated with diarrhea in young children during a winter season in Beijing, China. J Clin Virol. 2006,35 69-72。采用实施例1制备的试剂盒分别对各个实验样本进行鉴定，步骤如下1、采用天根公司的病毒基因组RNA/DNA提取试剂盒提取待测样本的RNA。2、将提取的RNA采用四条引物(aF3、aB3、aFIP和aBIP)进行环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)。RT-LAMP 体系(25 μ L)如下:aF3 与 aB3 均为 5pmol, aBIP 与 aFIP 均为 40pmol, dNTP lmmol/L，Betaine (甜菜碱)lmol/L，MgSO4 4mmol/L, 2. 5 μ L 10 X Bst-DNAPolymerase Buffer, 8U Bst-DNA polymerase, IOU AMV 反转录酶，5μ L RNA 样品，其余为水。 RT-LAMP 体系混勻，65°C，水浴 1. 5h。同时设立阳性对照和阴性对照即用5μ L星状病毒质粒(1. ^X IO11拷贝数)代替RNA样品作为阳性对照，用5 μ L水代替RNA样品作为阴性对照。阳性对照和阳性样本在扩增反应中可以形成可视的焦磷酸酶沉淀，离心后肉眼可观察到反应管中的白色混浊物。阴性对照和阴性样本不能得到白色混浊物。阴性对照的结果见图2Α，阳性对照的结果见图2Β。人类星状病毒的结果同阳性对照，具有白色混浊物。人类轮状病毒和诺如病毒的结果同阴性对照，没有得到白色混浊物。3、检测环介导逆转录等温扩增的扩增产物为了进一步对步骤2中肉眼观察的判断结果进行确认，进行如下操作(1)环介导逆转录等温扩增完成后，将扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图3。图3中M =Marker D2000 ；CK 阴性对照；1 阳性对照。人类星状病毒的结果同阳性对照，扩增得到各种不同大小的扩增片段。人类轮状病毒和诺如病毒的结果同阴性对照，基本没有得到扩增片段。(2)环介导逆转录等温扩增完成后，将扩增产物用限制性内切酶Alu I进行酶切鉴定。20 μ L酶切反应体系5 μ L扩增产物，2 μ L 10Xbuffer,lyL Alu I内切酶，加无菌水至20μ ;371反应池，651，201^11终止反应。将酶切产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图4。图4中M =Marker D2000 ；CK 阴性对照；1和2 阳性对照。人类星状病毒的结果同阳性对照，酶切得到155bp和64bp的DNA片段。人类轮状病毒和诺如病毒的结果同阴性对照，没有显示得到酶切片段。实施例3、试剂盒(专用引物)的特异性
实验样本同实施例2。采用实施例1制备的试剂盒分别对各个实验样本进行鉴定，步骤如下1、采用天根公司的病毒基因组RNA/DNA提取试剂盒提取待测样本的RNA。2、将提取的RNA采用四条引物(aF3、aB3、aFIP和aBIP)进行环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)。RT-LAMP 体系 Q5 μ L)如下aF3 与 aB3 均为 5pmol，aBIP 与 aFIP 均为 40pmol, dNTP lmmol/L, MgSO4 lmmol/L，2· 5 μ L IOXBst-DNA Polymerase Buffer, 8U Bst-DNApolymerase, IOU AMV反转录酶，5 μ L RNA样品，2μ L(l. 5mmol/L)HNB染料(羟基萘酚蓝)，其余为水。RT-LAMP 体系混勻，64°C，水浴 lh。同时设立阳性对照和阴性对照即用5μ L星状病毒质粒(1. ^X IO11拷贝数)代替RNA样品作为阳性对照，用5 μ L水代替RNA样品作为阴性对照。结果见图5。图5中CK1 阴性对照；CK2 阳性对照；A 人类星状病毒；R 人类轮状病毒；N 诺如病毒。阳性对照和阳性样本均可观察到颜色变化(由反应起始时的紫色变为反应结束时的天蓝色)。阴性对照和阴性样本没有颜色变化(反应起始和反应结束时均为紫色)。3、检测环介导逆转录等温扩增的扩增产物为了进一步对步骤2中肉眼观察的判断结果进行确认，环介导逆转录等温扩增完成后，将扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图6。图6中M =Marker D2000 ；CK 阴性对照；A 人类星状病毒；R 人类轮状病毒；N:诺如病毒。人类星状病毒扩增得到各种不同大小的的扩增片段。人类轮状病毒和诺如病毒的结果同阴性对照，基本没有得到扩增片段。实施例4、试剂盒(专用引物)的灵敏度采用实施例1制备的试剂盒进行灵敏度测定，步骤如下1、用水(天根公司的RNase-free ddH20)将星状病毒质粒梯度稀释为表1中的各个浓度。表1各个稀释液中星状病毒质粒的浓度
权利要求
1.辅助鉴定人类星状病毒的专用引物，为如下(a)或(b)(a)由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的专用引物；(b)由序列表的序列1所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列2所示DNA的反向互补 DNA、序列表的序列3所示DNA的反向互补DNA和序列表的序列4所示DNA的反向互补DNA 组成的专用引物。
2.权利要求1所述专用引物在制备辅助鉴定人类星状病毒的试剂盒中的应用。
3.一种辅助鉴定人类星状病毒的试剂盒，包括权利要求1所述专用引物。
4.权利要求1所述专用引物或权利要求3所述试剂盒在辅助鉴定人类星状病毒中的应用。
5.一种辅助鉴定人类星状病毒的方法，包括如下步骤(1)提取待测病毒的RNA；(2)将步骤(1)提取的RNA采用权利要求1所述专用引物进行环介导逆转录等温扩增；(3)根据步骤O)的扩增产物鉴定待测病毒是否为人类星状病毒。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述环介导逆转录等温扩增的反应程序为 640C -65°C水浴 1-1. 5h。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步骤C3)为将环介导逆转录等温扩增的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳显示的扩增条带鉴定待测病毒是否为人类星状病毒。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步骤C3)为将环介导逆转录等温扩增的扩增产物用限制性内切酶Alu I进行酶切鉴定，根据酶切产物鉴定测病毒是否为人类星状病毒。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待测病毒为人类星状病毒、人类轮状病毒或诺如病毒。
10.权利要求1所述专用引物或权利要求3所述试剂盒在辅助检测待测样本中是否含有人类星状病毒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定人类星状病毒的方法及其专用引物。本发明提供的专用引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。采用该组专用引物可以通过环介导逆转录等温扩增技术鉴定人类星状病毒，进而应用于人类星状病毒在各种水体(污水、再生水、地表水、饮用水)及肠道病患者(人、兽)粪便中的监测。
文档编号C12Q1/70GK102465184SQ201010549298
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者何晓青, 朱轶, 杨丽, 王子健, 程莉 申请人:中国科学院生态环境研究中心