专利名称：一种植物叶绿素酶的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种植物叶绿素酶的纯化方法，具体地，依次采用有机溶剂沉淀、离子 交换层析和非变性凝胶电泳方法，简洁地从植物蛋白粗提液中分离得到纯化的叶绿素酶， 属于植物生物技术领域。
背景技术：
叶绿素酶(Chl0r0phyllase，EC 3. 1. 1. 14)，催化叶绿素水解生成脱植醇叶绿素和 植醇。1913年，Willstatter和Moll首次报道了植物中存在叶绿素酶，其后，叶绿素酶的 生理功能及其应用研究得到了迅速的发展，概括为(1)叶绿素酶的生理功能；(2)细胞内 分布；(3)酶的生化动力学特征；(4)基因克隆与诱导表达；(5)油脂加工的脱绿。上述研究与应用的基础在于得到纯的叶绿素酶蛋白。目前，植物叶绿素酶的分离 纯化主要是利用硫酸铵分级沉淀、疏水层析、离子交换、分子筛过滤等方法，过程复杂，酶收 率低° 例如 Tsuchiya 等(Tsuchiya T, et al. Purification and characterization of two isozymesof chlorophyllase from mature leaves of Chenopodium album. Plant CellPhysiology,1997,38(9) :1026-1031)在分离藜叶绿素酶的过程中采用硫酸铵沉淀、 ToyopealHW-55疏水层析、Con A层析、Heparin层析、Mono Q离子交换色谱和Superdex 200分子筛过滤6步纯化，得到纯的叶绿素酶，但过多的纯化步骤，造成严重的酶活损失，仅 Toyopeal HW-55 —步，酶收率就降低了 91. 4%，最终收率只有0. 24-0. 51%。Shioi 等(Shioi Y, et al. A simple purification method for the preparation ofsolublized chlorophyllase from Chlorella protothecoides, AnalvticalBiochemistry, 1980,105 (1) :74-79)采用硫酸铵分级沉淀、S印harose CL-6B
G-200分子筛层析纯化小球藻的叶绿素酶，提高了酶的收率，简化了纯化程序， 但是对于复杂的植物细胞体系，该方法所得酶的纯度达不到要求。因此，改良植物叶绿素酶纯化的方法，简化纯化步骤，在保持酶活性的同时，达到 纯度要求，具有一定的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物叶绿素酶的纯化方法，简化纯化步骤，在保持酶 活性的同时达到叶绿素酶纯度的要求。实现上述目的的技术方案如下(1)有机溶液沉淀植物蛋白粗提液，在4°C下边搅拌边缓慢加入有机溶剂，有机溶剂可选用乙醇、甲 醇或丙酮中的任一种，控制有机溶剂的体积比浓度为20-40% ；随后10000-12000rpm离心 沉淀，弃去上清液，向每Ig沉淀中加入含有质量体积比浓度为0. 的TritonX-IOO磷酸 缓冲液(20mmol/L，pH7. 0) 10_15mL，于4°C下缓慢搅拌lh，随后10000-12000rpm离心，弃去 沉淀，上清液即为酶液I。
(2)离子交换层析将步骤(1)得到的酶液I上样于DEAE-kphacel或DEAE-S^harose CL-6B离子交 换层析柱，然后用含有0- . 3g/L NaCl的磷酸缓冲液QOmmol/L，ρΗ7. 0)洗脱，收集具有叶 绿素酶活性的组分，加入超滤浓缩离心管中，3000rpm，4°C离心，得到的浓缩液即为酶液II。(3)非变性凝胶电泳将步骤O)中得到的酶液II与上样缓冲液OOmmol/L、pH6. 8的Tris-HCl ；质量 体积比为10%的甘氨酸；质量体积比为0. 的十二烷基磺酸钠)混合加样于丙烯酰胺质 量浓度为5-6%的浓缩胶及丙烯酰胺质量浓度为12-14%的分离胶上，电泳。电泳后将分离 胶每0. 5cm横向割成条带，分别放入磷酸缓冲液O0mmol/L，pH7. 0)中，37°C过夜浸出蛋白， 收集有叶绿素酶活性的组分即为纯化的叶绿素酶液III。上述酶的纯度可采用质量浓度为14%的丙烯酰胺，质量体积比为的十二烷基 磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为25mmol/L Tris-甘氨酸(pH 8. 3)，以考 马斯亮蓝R-250染色，甲醇/冰醋酸/蒸馏水(1 1 8)脱色。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明依次采用有机溶剂沉淀、离子交换层析、非变性凝胶电泳方法纯化植物叶 绿素酶，与现有的植物叶绿素酶纯化方法相比，纯化步骤少。将本发明纯化的酶液按所述检 测方法检测，结果为单一条带，表明产物纯度高。
具体实施例方式实施例1利用本发明的方法纯化银杏叶绿素酶，具体为(1)有机溶剂沉淀将银杏叶蛋白粗提液在4°C下，边搅拌边缓慢加入丙酮，丙酮的体积百分比浓度 为40%，10000rpm离心后倾去上清液，收集沉淀部分，向每Ig沉淀加入含有质量体积比 为 0. 24% 的 TritonX-100 磷酸缓冲液(20mmol/L，ρΗ7· 0) IOmL,于 4°C下缓慢搅拌 Ih,随 后IOOOOrpm离心，收集上清液，弃去沉淀，上清液为银杏叶绿素酶液I ；此步酶的回收率为 20. 5%。(2)离子交换层析将步骤(1)的酶液I上样于DEAE-S印hacel，用含14. 6g/L NaCl的磷酸缓冲液 (20mmol/L,pH7. 0)洗脱，收集含有叶绿素酶活性的组分，加入超滤浓缩离心管中，3000rpm， 4°C离心，得到浓缩液，浓缩液即为银杏叶绿素酶液II ；此步酶的回收率为10.8%。(3)非变性凝胶电泳将步骤⑵中的酶液I I与上样缓冲液(20mmol/L、pH6. 8的Tris-HCl ；质量体积 比为10%的甘氨酸；质量体积比为0. 的十二烷基磺酸钠)混合加样于丙烯酰胺质量浓 度为5%的浓缩胶和丙烯酰胺质量浓度为14%的分离胶上，电泳。电泳后将分离胶每0. 5cm 横向割成条带，分别放入磷酸缓冲液O0mmol/L，pH7.0)中37°C过夜浸出蛋白，收集合有叶 绿素酶活性的组分即为纯化的银杏叶绿素酶液III，此步得到的叶绿素酶液III经质量浓 度为14%的丙烯酰胺，质量体积比为的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为 单一蛋白条带。
实施例2与实施例1基本相同，其不同之处在于使用的植物材料为菜椒；步骤(1)中使用的有机溶剂为乙醇，体积百分比浓度为30% ；步骤O)中的离子交换介质为DEAE-kpharose CL-6B。实施例3与实施例1基本相同，其不同之处在于使用的植物材料为豌豆叶；步骤(3)中浓缩胶的丙烯酰胺质量浓度为6%，分离胶的丙烯酰胺质量浓度为 12. 5%。
权利要求
1.一种植物叶绿素酶的纯化方法，其特征在于，依次采用有机溶剂沉淀、离子交换色谱 和非变性凝胶电泳等方法，纯化植物蛋白粗提液中的叶绿素酶。
2.根据如权利要求1所述的有机溶剂沉淀方法，其特征在于，有机溶剂选用丙酮、甲 醇、乙醇中的任一种，其在植物蛋白粗提液中的体积比浓度为20-40 %。
3.根据权利要求1所述的离子交换色谱方法，其特征在于，所述离子交换介质分别优 选 DEAE-Sephacel、DEAE-Sepharose CL-6B。
4.根据如权利要求1所述的非变性凝胶电泳方法，其特征在于，浓缩胶中丙烯酰胺的 质量浓度为5-6%，分离胶中丙烯酰胺的质量浓度为12-14%。
全文摘要
本发明属于植物生物技术领域，公开了一种植物叶绿素酶的纯化方法。本发明以植物蛋白粗提液为材料，依次采用有机溶剂沉淀、离子交换色谱和非变性凝胶电泳方法，纯化叶绿素酶。利用本发明的植物叶绿素酶纯化方法，步骤简单、周期短、操作方便，克服了经典方法存在的步骤多、酶失活等缺陷。
文档编号C12N9/16GK102115736SQ20101057640
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者唐蕾, 张宏建, 张建华, 毛忠贵 申请人:江南大学