专利名称：一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法
技术领域：
本发明涉及用一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法。
背景技术：
木质素是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生资源，但因其结构复杂、化学性 质非常稳定，是公认的难降解的芳香族化合物之一，一直以来都无法被有效利用，已成为工 业生产中重要的废弃物和严重的环境污染物。由于木质素与半纤维素、纤维素相互镶嵌结合，木质素以衬质包裹着纤维素和半 纤维素，沉积或填充于纤维素构成的微晶纤维中，形成一道天然屏障，严重阻碍了纤维素的 生物降解和利用。因此，木质素难于降解已成为有效转化地球上最大可再生碳源纤维素的 最大障碍。因此，若要有效利用纤维素，就必须首先解决木质素的降解问题。白腐真菌是自然界中木质素降解的主力军，具有独特的木质素降解酶系和降解能 力，其中漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在木质素降解过程中发挥着重要作用，它能高效地 催化氧化多种酚型和非酚型化合物，其功能和用途不断被发现和拓展，成为近些年酶工程 学和环境科学等领域研究的一个热点。生产漆酶的微生物目前主要是围绕着陆生微生物而展开。用陆生微生物生产的漆 酶，其稳定性和环境耐受性一般都不是特别理想，而木质纤维素植物的降解一般均需要在 粗狂的条件下进行，其木质素降解效率常受到限制，因此有必要筛选性能更优异的菌株生 产出酶活高、稳定性和环境耐受性好的漆酶。海洋微生物由于其环境所致，具有不同于陆生微生物的独特性能。海洋微生物的 种类繁多，现有的研究已经表明，海洋微生物的种类占了地球微生物种类的80%以上，远远 多于已经得到的陆生微生物数量。海洋寡养、高盐的独特环境为孕育出显著不同于陆生微 生物特性的微生物提供了一个特殊的环境。生活在寡养环境的微生物往往具有降解大分子 物质成为自身可利用的营养物质的酶系，纤维素的降解为可利用的糖类是寡养环境下微生 物采用的有效获取营养的主要方式，因此海洋微生物是筛选产漆酶的优异菌株的一个理想 选择。从海洋中筛选出内生拟盘多毛孢菌来生产漆酶，利用其适应高盐环境的特点，生产出 具有高酶活、高环境耐受性的漆酶，以便用于比较粗狂条件下的木质纤维素资源的降解。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆 酶的液体发酵方法。海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法的步骤如下1)菌种筛选从东海10 20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品5 IOg加入灭菌人工海水 50ml，160 250r/m转速下振荡20 30min，静置10 20min取上清液0. 25 0. 5ml，涂 布PDA平板，26 30°C，培养15 20天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，26 30°C培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显 示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体 产酶培养基进行发酵培养，26 30°C培养8 12天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的 菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌-海洋内生拟 盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为愈创木酚lg，酒石酸铵0. Ig, 蛋白胨 2. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g，琼脂 18g，加人工海水至 1000ml, 菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月 13 日，分类命名为 pestalotiopsissp. j63 ；2)菌种保藏把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上J6 30°C下培养6 10天，斜面保藏 于4°C，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；3)菌种活化在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯 经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10 2(^，在沈 30°C下培养6 10天， 完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为=NaCl 29. 8g, MgSO4 5. 4g，KCl 0. 73g, MgCl2. 6H20 10. 7g, CaCl2 0. 8306g,蒸溜水 1. OL ；4)种子培养基将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到 内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为葡萄糖6 12g，酒石酸铵1 4g， KH2PO4 0.5 2g，Na2HPO4 0. 2g，微量元素液5 15ml，酵母提取物1 4g，调pH至4. 5 6. 0，用人工海水定容至1000ml，26 30°C下培养2 4天，其中，微量元素溶液的组成为 MgSO4 · 5H20 0. 5g/L, FeSO4 0. 2g/L, ZnSO4 · 7H20 0. Olg/L, MnCl2 · 4H20 0. 003g/L, H3BO4 0. 03g/L, CoCl2 · 6H200. 02g/L ；5)发酵产酶培养基内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5 10%体积比接种量接种于液体发酵产酶 培养基，温度沈 30°C、装液量30 40%、起始pH 4. 5 6. 0、转速120 200r/m发酵 6 10天，得到4757IU/ml的漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为不同的碳源组合， 酒石酸铵 1 4g, KH2PO4 0. 5 2g，Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 · 5H20150 250 μ Μ，微量元素液 10 15ml，酵母提取物1 4g，调pH至4. 5 6. 0，用自来水定容至1000ml。本发明与现有技术相比具有的有益效果1)该海洋内生拟盘多毛孢菌能耐受较高的盐浓度，并在较高的盐浓度环境下生长 良好，为富含盐的木质纤维素资源提供新的途径；2)培养基简单、价廉；3)该海洋内生拟盘多毛孢菌液体生产漆酶，得到适宜海洋微生物的独有液体发酵 工艺。液体发酵的工艺粗放，酶活较高；4)培养过程简单，易于控制和放大。
具体实施例方式海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法的步骤如下
1)菌种筛选从东海10 20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品5 IOg加入灭菌人工海水 50ml，160 250r/m转速下振荡20 30min，静置10 20min取上清液0. 25 0. 5ml，涂 布PDA平板，26 30°C，培养15 20天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，26 30°C培 养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显 示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体 产酶培养基进行发酵培养，26 30°C培养8 12天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的 菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌-海洋内生拟 盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为愈创木酚lg，酒石酸铵0. Ig, 蛋白胨 2. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g，琼脂 18g，加人工海水至 1000ml， 菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月 13 日，分类命名为 pestalotiopsissp. j63 ；2)菌种保藏把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上J6 30°C下培养6 10天，斜面保藏 于4°C，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；3)菌种活化在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯 经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10 2(^，在沈 30°C下培养6 10天， 完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为=NaCl 29. 8g, MgSO4 5. 4g，KCl 0. 73g, MgCl2. 6H20 10. 7g, CaCl2 0. 8306g,蒸溜水 1. OL ；4)种子培养基将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到 内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为葡萄糖6 12g，酒石酸铵1 4g， KH2PO4 0.5 2g，Na2HPO4 0. 2g，微量元素液5 15ml，酵母提取物1 4g，调pH至4. 5 6. 0，用人工海水定容至1000ml J6 30°C下培养2 4天，其中，微量元素溶液的组成为 MgSO4 · 5H20 0. 5g/L, FeSO4 0. 2g/L, ZnSO4 · 7H20 0. Olg/L, MnCl2 · 4H20 0. 003g/L, H3BO4 0. 03g/L, CoCl2 · 6H200. 02g/L ；5)发酵产酶培养基内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5 10%体积比接种量接种于液体发酵产酶 培养基，温度26 30°C、装液量30 40%、起始pH 4. 5 6. 0、转速120 200r/m发酵6 10天，得到漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为不同的碳源组 合，酒石酸铵 1 4g, KH2PO4 0. 5 2g, Na2HPO4 0. 2g, CuSO4 · 5H20 150 250 μ Μ,微量元 素液10 15ml，酵母提取物1 4g，调pH至4. 5 6. 0，用自来水定容至1000ml。以下通过实施例对本发明作进一步的描述实施例11)菌种筛选从东海IOm深的海水底取污泥、海草样品，取样品5g加入灭菌人工海水50ml， 160r/m转速下振荡20min，静置IOmin取上清液0. 25ml，涂布PDA平板，26 °C，培养15天；挑 取菌落，接种于分离选择培养基，260C培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚
5的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶 的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，26°C培养8天测定漆 酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一 株新型的海洋真菌-海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成 为愈创木酚 lg，酒石酸铵 0. lg，蛋白胨 2. 6g，MgSO4 ·7Η20 0. 5g，KH2PO4 IgjNa2HPO4 0. · 2g， 琼脂18g，加人工海水至1000ml，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为 2010 年 11 月 13 日，分类命名为 pestalotiopsissp. j63 ；2)菌种保藏把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，26°C下培养6天，斜面保藏于4°C，保藏 期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；3)菌种活化在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯经 1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10g，在^TC下培养6天，完成活化，得到活化 的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为=NaCl 29.8，MgS045.4，KCl 0. 73，MgCl2. 6H20 10.7， CaCl2 0. 8306，蒸馏水 1. OL ；4)种子培养基将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得 到内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为葡萄糖6g，酒石酸铵lg，KH2PO4 0. 5g，Na2HPO4 0. 2g，微量元素液5ml，酵母提取物lg，调pH至4. 5，用人工海水定容至 1000ml，26°C下培养2天，其中，微量元素溶液的组成为=MgSO4 ·5Η20 0. 5g/L, FeSO4O. 2g/L， ZnSO4 · 7H20 0. Olg/L, MnCl2 · 4H20 0. 003g/L, H3BO4 0. 03g/L, CoCl2 · 6H20 0. 02g/L ；5)发酵产酶培养基内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5%体积比接种量接种于液体发酵产酶培养 基，温度^°C、装液量30%、起始PH 4. 5、转速120r/m发酵6天，得到4757IU/ml的漆酶； 其中，液体发酵产酶培养基组成为不同的碳源组合，酒石酸铵lg，KH2PO4 0. 5g, Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 ·5Η20 150 μ Μ,微量元素液IOml，酵母提取物lg,调pH至4. 5，用自来水定容至 1000ml。实施例21)菌种筛选从东海20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品IOg加入灭菌人工海水50ml， 250r/m转速下振荡30min，静置20min取上清液0. 5ml，涂布PDA平板，30 V，培养20天；挑 取菌落，接种于分离选择培养基，30°C培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚 的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶 的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，30°C培养12天测定漆 酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一 株新型的海洋真菌-海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成 为愈创木酚 lg，酒石酸铵 0. lg，蛋白胨 2. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g， 琼脂18g，加人工海水至1000ml，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为 2010 年 11 月 13 日，分类命名为 pestalotiopsissp. j63 ；
2)菌种保藏把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，30°C下培养10天，斜面保藏于4°C，保 藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；3)菌种活化在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯 经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖20g，在30°C下培养10天，完成活化，得到 活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为=NaCl 29. 8，MgSO4 5. 4，KCl 0. 73，MgCl2. 6H20 10. 7，CaCl2 0. 8306，蒸馏水 1. OL ；4)种子培养基将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到 内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为葡萄糖12g，酒石酸铵4g，KH2PO4 2g，Na2HPO4 0. 2g，微量元素液15ml，酵母提取物4g，调pH至6. 0，用人工海水定容至 1000ml，30°C下培养4天，其中，微量元素溶液的组成为=MgSO4 · 5H20 0. 5g/L，FeSO4 0. 2g/ L, ZnSO4 · 7H20 0. Olg/L, MnCl2 · 4H20 0. 003g/L, H3BO4 0. 03g/L, CoCl2 · 6H20 0. 02g/L ；5)发酵产酶培养基内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按10%体积比接种量接种于液体发酵产酶培养 基，温度301、装液量40%、起始？!1 6.0、转速200r/m发酵10天，得到4757IU/ml的漆 酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为不同的碳源组合，酒石酸铵4g，KH2PO4 2g，Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 · 5H20 250 μ Μ,微量元素液15ml，酵母提取物4g，调pH至6. 0，用自来水定容至 1000ml。实施例3内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5% (ν/ν)接种量接种到液体发酵培养 基上，液体培养基组成葡萄糖10g，酒石酸铵2g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 · 5H20 200 μ M(终浓)，微量元素液IOml，酵母提取物2g，调pH至5. 5，用自来水定容至IOOOml。在 温度、装液量40%、发酵起始pH 5. 5、发酵8-10天测定液体发酵漆酶活达到421. 5IU/ ml。酶活单位IU定义为每分钟氧化IymolABTS所需的酶量为一个漆酶活力单位。酶活测 定方法发酵培养基lOOOOr/m离心lOmin，上清液即为粗酶液。取经过适当稀释后的粗酶 液0. lml，加入NaAc-HAc (ρΗ4· 5)缓冲液2. 5ml，混勻，加入ABTS0. 4ml，反应在25°C下进行， 测定;3min内反应液在420nm处OD值的变化。实施例4内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5% (ν/ν)接种量接种于液体发酵培养基，不 同的液体培养基组成(A 葡萄糖5g ；B 蔗糖5g ；C 麦芽糖5g ；D 麸皮5g ；E 可溶性淀 粉:5g)，稻草粉 5g，酒石酸铵 2g，KH2PO4 lg, Na2HPO4O. 2g，CuSO4 · 5H20 200 μ Μ,微量元素液 10ml，酵母提取物l-4g，自来水定容至1000ml，调pH 5.5。在温度^°C、装液量40%、发 酵起始PH5. 5，发酵10天测定液体发酵漆酶活分别为1925IU/ml、1680IU/ml、1400IU/ml、 333IU/ml、1455IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。实施例5内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5% (ν/ν)接种量接种到含不同浓度稻草粉 的液体发酵培养基上，液体培养基组成(稻草粉分别为5g、10g、15g)，酒石酸铵2g，KH2PO4lg, Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 · 5H20 200 μ M，微量元素液10ml，酵母提取物2g，自来水定容至 1000ml, pH 5. 5，在温度^°C、装液量40%、起始pH 5. 5、发酵6天测定液体发酵漆酶活分 别为123IU/ml、1016IU/ml、1462IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。实施例6内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5% (ν/ν)接种量接种到液体发酵培养基上， 液体培养基组成(A 稻草粉5g ；B 稻草粉IOg ；C 稻草粉15g ；D 稻草粉20g)，麦芽糖3g， 酒石酸铵 2g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 · 5H20 200 μ Μ,微量元素液 10ml，酵母提取物 2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5。在温度、装液量40%、起始pH 5. 5发酵7天，测定 液体发酵漆酶活分别为138IU/ml、804IU/ml、3738IU/ml、4757IU/ml。酶活测定和定义同上 实施例。实施例7内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5% (ν/ν)接种量接种到液体发酵培养基上， 液体培养基组成(A 稻草粉5g ；B 稻草粉IOg ；C 稻草粉15g ；D 稻草粉20g)，麦芽糖5g， 酒石酸铵 2g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 · 5H20 200 μ Μ,微量元素液 10ml，酵母提取物 2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5。在温度、装液量40%、起始pH 5. 5发酵7天，测定 液体发酵漆酶活分别为254IU/ml、4(^8IU/ml、1658IU/ml、4293IU/ml。酶活测定和定义同上 实施例。实施例8内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5% (ν/ν)接种量接种到液体发酵培养基上， 液体培养基组成(A 稻草粉5g ；B 稻草粉IOg ；C 稻草粉15g ；D 稻草粉20g)，麦芽糖10g， 酒石酸铵 2g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 · 5Η20200 μ Μ，微量元素液 10ml，酵母提取物 2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5。在温度、装液量40%、起始pH 5. 5发酵7天，测定 液体发酵漆酶活分别为8IU/ml、143IU/ml、2156IU/ml、3298IU/ml。酶活测定和定义同上实 施例。实施例9内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5% (ν/ν)接种量接种到液体发酵培养基上， 液体培养基组成葡萄糖10g，酒石酸铵2g，KH2PO4 IgjNa2HPO4 0. 2g，微量元素液10ml，酵母 提取物2g，自来水定容至1000ml，pH 5. 5。在温度^°C、装液量40%、起始pH 5. 5、CuSO4 的添加量分别为0、100μΜ、500μΜ、1πιΜ、1.5πιΜ、2πιΜ，发酵7天测定液体发酵漆酶活分别达 到 1. 3IU/ml、385IU/ml、51. 4IU/ml、21. lIU/ml、lIU/ml、lIU/ml。酶活测定和定义同上实施 例。实施例10内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5% (ν/ν)接种量接种到不同起始PH值的液 体发酵培养基上，液体培养基组成葡萄糖10g，酒石酸铵2g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0.2g，微 量元素液10ml，酵母提取物2g，自来水定容至1000ml，调不同pH值。在温度^°C、装液量 40%、起始pH分别调节为3. 03、4. 03、5. 00、5. 93、7. 03、7. 90发酵7天测定液体发酵漆酶活 分别达到 1. lIU/ml、150IU/ml、430IU/ml、418IU/ml、210IU/ml、18IU/ml。酶活测定和定义同 上实施例。实施例11内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以不同的接种量接种到液体发酵培养基上，液体培养基组成葡萄糖 IOg,酒石酸铵 2g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g，CuSO4 · 5H20 200 μ Μ,微量 元素液10ml，酵母提取物2g，自来水定容至1000ml，ρΗ 5.5。在温度、装液量40%、 起始pH 5.5，分别以1%、3%、5(%、7(%、9(%的接种量发酵7天，测定液体发酵漆酶活分别为 102IU/ml、255IU/ml、445IU/ml、360IU/ml、298IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。
权利要求
1. 一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法，其特征在于它的步骤如下1)菌种筛选从东海10 20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品5 IOg加入灭菌人工海水 50ml，160 250r/m转速下振荡20 30min，静置10 20min取上清液0. 25 0. 5ml，涂 布PDA平板，26 30°C，培养15 20天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，26 30°C培 养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显 示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体 产酶培养基进行发酵培养，26 30°C培养8 12天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的 菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌-海洋内生拟 盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为愈创木酚lg，酒石酸铵0. Ig, 蛋白胨 2. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，KH2PO4 lg, Na2HPO4 0. 2g，琼脂 18g，加人工海水至 1000ml, 菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月 13 日，分类命名为 pestalotiopsissp. j63 ；2)菌种保藏把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，26 30°C下培养6 10天，斜面保藏于 4°C，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；3)菌种活化在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯经1升 人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10 20g，在26 30°C下培养6 10天，完成活 化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为=NaCl 29. 8g，MgSO4 5. 4g，KCl 0. 73g, MgCl2. 6H20 10. 7g, CaCl2 0. 8306g，蒸馏水 1. OL ；4)种子培养基将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到内 生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为葡萄糖6 12g，酒石酸铵1 4g， KH2PO4 0.5 2g，Na2HPO4 0. 2g，微量元素液5 15ml，酵母提取物1 4g，调pH至4. 5 6. 0，用人工海水定容至1000ml，26 30°C下培养2 4天，其中，微量元素溶液的组成为 MgSO4 · 5H20 0. 5g/L, FeSO4 0. 2g/L, ZnSO4 · 7H20 0. Olg/L, MnCl2 · 4H20 0. 003g/L, H3BO4 0. 03g/L, CoCl2 · 6H20 0. 02g/L ；5)发酵产酶培养基内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5 10%体积比接种量接种于液体发酵产酶培养 基,温度26 30°C、装液量30 40%、起始pH 4. 5 6. 0、转速120 200r/m发酵6 10 天，得到4757IU/ml的漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为不同的碳源组合，酒石酸铵 1 4g, KH2PO4 0. 5 2g, Na2HPO4 0. 2g, CuSO4 ·5Η20150 250 μ Μ，微量元素液 10 15ml, 酵母提取物1 4g，调pH至4. 5 6.0，用自来水定容至1000ml。
全文摘要
本发明公开了一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法。方法的步骤为(1)菌种筛选从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株新型海洋真菌；(2)菌种保藏菌种接种于修饰的PDA培养基中培养，并于4℃下斜面保藏；(3)菌种活化和扩培菌种的孢子接种于添加了特殊成分的PDA培养基，活化得到的孢子接种于种子培养基中进行扩培；(4)制备海洋内生拟盘多毛孢菌液体发酵培养基；(5)发酵采用新配制的培养基进行液体发酵和产酶，确定了优化的产酶条件。本发明所开发的生产漆酶的方法，以新型的海洋内生拟盘多毛孢菌为产生菌，具有培养基粗狂、来源广泛和价廉等特点。
文档编号C12N1/14GK102134555SQ20101057633
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者冯晓雨, 姚善泾, 林东强, 薛栋升, 陈慧英 申请人:浙江大学