专利名称：一种人肺细胞beas-2b/cyp2a13及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人重组基因肺上皮细胞，特别涉及一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13及其应用。
背景技术：
选择一个理想的模型是做好科研工作的必备条件，细胞无疑是科研中比较理想、 也很常用的研究模型。一方面单一的细胞可减少实验间的误差，保证研究结果的可控性和可重复性；另一方面细胞试验周期短、成本低、实验条件要求不高。因此备受广大科研工作者的青睐。随着研究的不断深入，人类已进入后基因组研究时代，其核心内容就是研究基因的功能。由于大部分细胞系中特定蛋白低表达或不表达，因此亟需构建高表达目的蛋白的细胞模型。目前一般采用腺病毒的方法构建瞬时表达目的蛋白的细胞，但往往效果不尽人意。主要是由于瞬时表达的细胞，目的蛋白的表达不稳定，且不同实验间的差异有时非常大。此外，用腺病毒构建稳定表达细胞的效率低、成果率小，往往费时费力。因此，亟需使用稳定可靠的载体系统通过稳定转染和单克隆筛选，以获得稳定高表达目的蛋白的特定细胞。鉴于上述因素，本发明利用新型慢病毒系统构建稳定表达人细胞色素P450 2A13 (CYP2A13)的肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)，简称为BEAS-2B/CYP2A13细胞，以期为研究药物代谢活化作用以及呼吸系统肿瘤及分子机制提供理想的细胞模型。
发明内容
发明目的
本发明采用新型慢病毒系统来构建细胞模型，具体来说提供一种人肺细胞BEAS-2B/ CYP2A13及其应用。一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2010127 ；保藏时间为2010年12月7日。保藏地址为中国武汉武汉大学。一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的制备方法，其特征在于具体制备步骤如下
A. pLJMl-GFP-CYP2A13质粒构建及验证
通过内切酶双酶切以及酶连的方法构建含有目的CYP基因的慢病毒质粒 pLJMl-GFP-CYPs,即对本实验室现有的pFastBac 1-CYP2A13质粒与慢病毒专用空载质粒 pLJMl-GFP同时进行酶切，回收酶切产物后分别进行酶连，然后转化DH5 α感受态细胞，通过氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆提取重组质粒，对重组质粒使用各基因特异引物进行PCR 验证；B.慢病毒载体包装以及感染BEAS-2B细胞
传细胞至60mm培养皿中，细胞密度达到80-90%融合度时进行转染；制备脂质体转染复合物=DMEM无血清，无双抗，转染每皿的复合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs质粒、3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast转染试剂，将复合物加至培养皿中的DMEM液面下，吹打3-4次混勻，将此细胞放至37°C CO2培养箱培养，6- 后更换新鲜完全培养基； 转染24h后，通过观察细胞绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率；收集病毒上清，此即为含有CYP2A13基因的完整慢病毒上清；使用该完整慢病毒上清过滤后感染BEAS-2B细胞，同时加入10ug/mL的polybrene和HEPES ；感染24h后重复感染一次。构建稳定表达 CYP2A13 的 BEAS-2B 细胞 BEAS-2B/CYP2A13 ；
C.BEAS-2B/CYP2A13 细胞的验证
分别收取慢病毒感染成功后一周和两周的各BEAS-2B/CYP2A13细胞总蛋白，使用 CYP2A13的特异性抗体，采用免疫印迹方法验证BEAS-2B/CYP2A13细胞中的蛋白表达；
D.流式细胞仪分选BEAS-2B/CYP2A13细胞株
为保证转染细胞的纯度，使用流式细胞仪对BEAS-2B/CYP2A13细胞株进行了 GFP阳性细胞分选；未转染的正常细胞无荧光，转染细胞的荧光强度明显增强，通过分选，将荧光强度较强的细胞分选出来，以保证细胞为100%转染细胞；
E.BEAS-2B/CYP2A13单克隆细胞的挑选及验证
将GFP阳性的BEAS-2B/CYP2A13细胞，以每孔1个细胞的浓度接种到96孔细胞培养板， 结果7-10天后，对形成单克隆的细胞进行放大培养，直到细胞满足实验和保存要求为止； 对筛选出的单克隆细胞进行验证，选取CYP2A13蛋白表达高且稳定的细胞作为后续实验和保存之用。一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的应用，其特征在于该细胞对于CYP2A13的特征性底物AFBl反应的高效敏感性，可运用于任何研究CYP2A13的功能及其在环境化学物致呼吸系统肿瘤的效应及机制上，也可用于相关药物的活性筛选及研发。
有益效果
1.本发明采用新型慢病毒系统来构建细胞模型。该体系具有如下优势高效转染，质粒转染效率可以达到95%以上，且片段不已丢失；包装的病毒系统可侵染多种细胞类型，包括非分化细胞和难以转染的细胞(如原代细胞、血细胞、干细胞等)；包装基因整合到基因组 DNA上，表达水平高，变异率低，不干扰细胞的正常功能；表达稳定、可遗传。2、本发明以细胞色素P450 2A13 (CYP2A13)为目的基因，以永生化的人正常肺细胞(BEAS-2B)作为载体细胞，利用慢病毒系统构建稳定表达CYP2A13的BEAS-2B细胞 (BEAS-2B/CYP2A13)并获得成功。通过基因、蛋白及功能研究，结果显示该细胞具有表达稳定、反应灵敏等特点，是研究药物代谢活化作用以及呼吸系统肿瘤及分子机制的理想模型， 值得推广应用。3、在国内外率先利用慢病毒系统构建了稳定表达CYP2A13的BEAS-2B细胞，这是本发明最重要的关键技术。该技术相比其它病毒载体系统而言，具有转染效率高、表达稳定、易于筛选等优点，对于转染永生化的原代细胞具有独特的优势。4、利用该技术，可以构建任何稳定表达目的基因的原代细胞或细胞株，为基因的功能研究及
疾病的机制研究提供了重要的载体，一旦推广，必将产生显著的社会效益和可观的经济效益。
图1 PLJM1-GFP-CYP2A13重组质粒PCR验证。随机选择3个克隆载体，利用CYP2A13 引物进行PCR验证，结果发现，3个质粒都在预期大小(1500bp)的位置出现了明亮的条带， 提示质粒构建成功。图中M为DNA Maker。图2感染后不同时间细胞中GFP蛋白的表达情况。分别在质粒转染前、转染后4 天和1周，运用荧光显微镜通过观察荧光蛋白GFP的强度评价细胞的转染效率。图中所示， 不管是BEAS-2B/CYP2A13细胞还是空载细胞(BEAS-2B/VeCtor)，转染后1周明显强于转然后4天，而未转染细胞则无荧光。图3 BEAS-2B/CYP2A13细胞的蛋白表达验证。采用免疫印迹法检测细胞中 CYP2A13的表达情况，并以Tubulin作为内参，其中1和2分别为转染后1周和2周的细胞； P为阳性对照，是体外表达的CYP2A13微粒体蛋白；V为空载细胞BEAS-2B/VeCtor ；N为未转染的BEAS-2B细胞。图4各转染细胞的流式细胞仪检测结果。其中左图为未转染的BEAS-2B细胞，其荧光强度很弱，右图为BEAS-2B/CYP2A13细胞明显右移。以BEAS-2B细胞的荧光强度为分界线，将分界线右侧的细胞分选出来，已获得100%转染效率的目的细胞。图5 BEAS-2B/CYP2A13单克隆细胞的基因和蛋白表达验证。其中图A为CYP2A13 的蛋白表达验证，1-7分别为各细胞株挑选的单隆隆细胞蛋白；图B为6号和7号单克隆细胞的基因表达验证；图C为6号和7号单克隆细胞的蛋白验证。GADPH为内参，V为空载细胞，N为未转染细胞；P为阳性对照，M为DNA Marker。图6 AFBl对BEAS-2B/CYP2A13细胞的毒性效应。其中图A为不同浓度AFBl处理M小时后细胞的活性变化，图B为利用IOOnM的AFBl处理不同时间后细胞的活性变化， Vector表示空载细胞，是BEAS-2B/CYP2A13细胞的对照细胞。
具体实施方式
实施例1
1. PLJM1-GFP-CYP2A13质粒构建及验证
通过内切酶双酶切以及酶连的方法构建含有目的CYP基因的慢病毒质粒 pLJMl-GFP-CYPs,即对本实验室现有的pFastBac 1-CYP2A13质粒与慢病毒专用空载质粒 pLJMl-GFP同时进行酶切，回收酶切产物后分别进行酶连，然后转化DH5 α感受态细胞，通过氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆提取重组质粒，对重组质粒使用各基因特异引物进行PCR 验证。 2.慢病毒载体包装以及感染BEAS-2B细胞传细胞至60mm培养皿中，细胞密度达到80-90 %融合度时进行转染。制备脂质体转染复合物=DMEM (无血清，无双抗)，转染每皿的复合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs质粒、 3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast转染试剂，将复合物加至培养皿中的DMEM 液面下，吹打3-4次混勻，将此细胞放至37°C CO2培养箱培养，6- 后更换新鲜完全培养基。转染24h后，通过观察细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达情况确定转染效率。收集病毒上清，此即为含有^ ^基因的完整慢病毒上清。使用该完整慢病毒上清过滤后感染BEAS-2B细胞，同时加入10ug/mL的polybrene和HEPES。感染24h后重复感染一次。构建稳定表达 CYP2A13 的 BEAS-2B 细胞(BEAS-2B/CYP2A13)。3. BEAS-2B/CYP2A13 细胞的验证
分别收取慢病毒感染成功后一周和两周的各BEAS-2B/CYP2A13细胞总蛋白，使用 CYP2A13的特异性抗体，采用免疫印迹方法验证BEAS-2B/CYP2A13细胞中的蛋白表达。4.流式细胞仪分选BEAS-2B/CYP2A13细胞株
为保证转染细胞的纯度，使用流式细胞仪对BEAS-2B/CYP2A13细胞株进行了 GFP阳性细胞分选。未转染的正常细胞无荧光，转染细胞的荧光强度明显增强，通过分选，将荧光强度较强的细胞分选出来，以保证细胞为100%转染细胞。5. BEAS-2B/CYP2A13单克隆细胞的挑选及验证
将GFP阳性的BEAS-2B/CYP2A13细胞，以每孔1个细胞的浓度接种到96孔细胞培养板， 结果7-10天后，对形成单克隆的细胞进行放大培养，直到细胞满足实验和保存要求为止。 对筛选出的单克隆细胞进行验证，选取CYP2A13蛋白表达高且稳定的细胞作为后续实验和保存之用。该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2010127。 保藏时间为2010年12月7日。保藏地址为中国武汉武汉大学。结果人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的构建
通过对重组质粒使用CYP2A13的特异引物进行PCR验证，可见各PCR产物片段与基因长短一致，证实pLJMl-GFP-CYPs各质粒构建成功(图1)；利用该质粒感染细胞4天和1 周，通过荧光显微镜观察发现，随着培养时间的延长，细胞的绿色荧光强度逐渐增强，而未转染细胞则无荧光，提示细胞转染成功并具有较高的感染效率(图2)；采用CYP2A13的特异性抗体对转染细胞的CYP2A13蛋白进行免疫印迹法验证，结果发现所挑选的细胞都高表达CYP2A13细胞，而空载细胞核未转染细胞则不表达CYP2A13，结果提示细胞的稳定表达成功(图3)；为了获得单克隆的BEAS-2B/CYP2A13细胞，通过流式细胞仪对细胞进行分选，以未转染细胞为对照，将荧光强度阳性的细胞分选出来(图4);随后对上述细胞进行单克隆筛选，并分别运用免疫印迹法和RT-PCR法对单克隆细胞的CYP2A13蛋白和mRNA进行验证，结果发现所有细胞都较好地表达了 CYP2A13蛋白(图5A)，所挑选的单克隆细胞都稳定高表达 CYP2A13 mRNA (图5B)和CYP2A13蛋白(图5C)，结果提示单克隆的BEAS-2B/CYP2A13构建成功。实施例2
1.细胞对AFBl作用的剂量依赖性运用研究
利用实施例1获得的BEAS-2B/CYP2A13细胞，以空载细胞BEAS_2B/Vector为对照，分别给予细胞0、10、100、1000和10,000 nM的AFBl，处理24小时，然后采用MTT法检测各剂量处理下的细胞活性，评价细胞不同剂量AFBl处理下的毒性效应，构建剂量-效应关系。
2.细胞对AFBl作用的时间依赖性运用研究
利用实施例1获得的BEAS-2B/CYP2A13细胞，以空载细胞BEAS_2B/Vector为对照，运用100 nM AFBl分别处理细胞M、48和72小时，然后采用MTT法检测各时间点处理下的细胞活性，评价细胞在AFBl处理不同时间下的毒性效应，构建时间-效应关系。结果人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的运用研究
由图6A可见，相对于空载细胞BEAS-2B/Vector而言，BEAS-2B/CYP2A13细胞对AFBl 十分敏感，从最低浓度起，其细胞活性均显著低于BEAS-2B/VeCtor细胞(P<0.01)，半数抑制浓度(IC5tl)为350nM，而BEAS_2B/Vector细胞在IOOOOnM的AFBl时仍然保持95%以上的细胞活性。如图5B所示，随着时间的延长，BEAS-2B/CYP2A13细胞的活性逐渐下降，而 BEAS-2B/VeCtor细胞则无明显改变；在各个时间点，BEAS-2B/CYP2A13的细胞活性均显著低于BEAS-2B/Vector细胞(P<0. 01)。结果证明，该BEAS-2B/CYP2A13细胞对AFBl的反应是灵敏的，是理想的细胞模型，可适用于CYP2A13的功能研究以及药物筛选和活性研究。
权利要求
1.一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: C2010127。
2.一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的制备方法，其特征在于具体制备步骤如下A.pLJMl-GFP-CYP2A13质粒构建及验证通过内切酶双酶切以及酶连的方法构建含有目的CYP基因的慢病毒质粒 pLJMl-GFP-CYPs,即对本实验室现有的pFastBac 1-CYP2A13质粒与慢病毒专用空载质粒 pLJMl-GFP同时进行酶切，回收酶切产物后分别进行酶连，然后转化DH5 α感受态细胞，通过氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆提取重组质粒，对重组质粒使用各基因特异引物进行PCR 验证；B.慢病毒载体包装以及感染BEAS-2B细胞传细胞至60mm培养皿中，细胞密度达到80-90 %融合度时进行转染；制备脂质体转染复合物=DMEM无血清，无双抗，转染每皿的复合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs质粒、3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast转染试剂，将复合物加至培养皿中的DMEM液面下，吹打3-4次混勻，将此细胞放至37°C CO2培养箱培养，6- 后更换新鲜完全培养基； 转染24h后，通过观察细胞绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率；收集病毒上清，此即为含有CYP2A13基因的完整慢病毒上清；使用该完整慢病毒上清过滤后感染BEAS-2B细胞，同时加入10ug/mL的polybrene和HEPES ；感染24h后重复感染一次；构建稳定表达 CYP2A13 的 BEAS-2B 细胞 BEAS-2B/CYP2A13 ；C.BEAS-2B/CYP2A13 细胞的验证分别收取慢病毒感染成功后一周和两周的各BEAS-2B/CYP2A13细胞总蛋白，使用 CYP2A13的特异性抗体，采用免疫印迹方法验证BEAS-2B/CYP2A13细胞中的蛋白表达；D.流式细胞仪分选BEAS-2B/CYP2A13细胞株为保证转染细胞的纯度，使用流式细胞仪对BEAS-2B/CYP2A13细胞株进行了 GFP阳性细胞分选；未转染的正常细胞无荧光，转染细胞的荧光强度明显增强，通过分选，将荧光强度较强的细胞分选出来，以保证细胞为100%转染细胞；E.BEAS-2B/CYP2A13单克隆细胞的挑选及验证将GFP阳性的BEAS-2B/CYP2A13细胞，以每孔1个细胞的浓度接种到96孔细胞培养板， 结果7-10天后，对形成单克隆的细胞进行放大培养，直到细胞满足实验和保存要求为止； 对筛选出的单克隆细胞进行验证，选取CYP2A13蛋白表达高且稳定的细胞作为后续实验和保存之用。
3.一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的应用，其特征在于利用CYP2A13的特征性底物黄曲霉毒素Bl对细胞进行测试；使用0-10,000 nM的AFB1，处理细胞对h，采用MTT法评价剂量-效应关系；使用100 nM处理细胞M-72小时，采用MTT法评价时间-效应关系；通过与空载细胞BEAS-2B/Vector进行比较，评价BEAS-2B/CYP2A13细胞对AFBl的敏感性。
全文摘要
本发明涉及人重组基因肺上皮细胞，特别涉及一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13及其应用。一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOC2010127。在国内外率先利用慢病毒系统构建了稳定表达CYP2A13的BEAS-2B细胞，这是本发明最重要的关键技术。该技术相比其它病毒载体系统而言，具有转染效率高、表达稳定、易于筛选等优点，对于转染永生化的原代细胞具有独特的优势。
文档编号C12Q1/02GK102168061SQ201010596659
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者李孜音, 李建民, 杨雪娇, 王守林, 陆慧媛 申请人:南京医科大学