专利名称：八月红梨果实可溶性糖含量的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明提供了八月红梨果实可溶性糖含量的分子标记，属于分子遗传育种领域，可用 于梨果实可溶性糖含量性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。背景技术：
梨iPyrus L.)原产我国，是我国第三大果树树种。梨因其果实营养价值高，香甜多汁， 而深受消费者喜爱。可溶性糖含量是影响梨果品质风味的重要因素之一，是决定甜度口感 的首要因素，而我国消费者普遍喜爱高甜度口感的梨，因此培育果实可溶性糖含量高的品 种已经成为梨育种的重要目标之一。由于梨为多年生木本果树作物，与果实品质相关的性状大都是由多基因控制、易 受环境影响的数量性状，在分离后代表现为广泛的表型变异，其基因型与表现型间的对应 关系难以确定。而以往的传统育种是基于经典数量遗传学理论，把控制某一性状的多个基 因作为整体进行研究和选择，在现有基础上改良目标性状难度越来较大。近年来，随着分子 标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善， 使得数量性状基因座(Quantitative trait loci, QTL)定位变成了现实，也为提高目标数 量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性 状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子 标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位 置。基于获得的标记基因型分离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并 开发可应用于分子标记辅助选择(Molecular-assisted selection，MAS)育种的技术，这已 在许多重要农作物上取得了成功应用。目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些 病害或生长性状，对重要品质性状梨可溶性糖含量的QTL定位及分子标记的研究尚没有开 展。因此，开展梨果实可溶性糖含量主效基因的QTL定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立 杂交后代早期辅助选择技术体系，对于提高梨果可溶性糖含量品质改良效率，缩短育种进 程，节约生产成本显得尤为重要。三
发明内容
技术问题
本发明的目的是定位梨果实可溶性糖含量QTL，并提供与QTL位点紧密连锁的分子标 记，通过检测这些分子标记可以预测梨果实可溶性糖含量，为实现对该性状的早期鉴定和 筛选提供分子辅助选择技术支持。技术方案
一种梨果实可溶性糖含量QTL连锁的分子标记，是通过下列步骤获得
a)利用梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交获得F1后代单株；
b)采用SRAP 弓I 物 me6 :5'-TGAGTCCAAACCGGTAG-3'禾口 pml9:5'-CTTCAAGCGGTGCATTCC-3'以梨基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙 烯酰胺凝胶上电泳分离，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其杂交后代基因组DNA进行分析，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，将得到的多态性标记位点导 入Joinmap3. 0作图软件，构建‘八月红’梨的遗传连锁图谱；
c)对‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交后代的F1群体单株的果实可溶性糖含量进行测定， 利用MapQTL5. 0作图软件的区间作图法，将F1群体每个单株的果实可溶性糖含量与‘八月 红’梨遗传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值彡2. 5为标准，大于2. 5 说明存在一个QTL位点，检测到在母本‘八月红’的第4连锁群上检测到可溶性糖含量的 QTL位点Psg-Ι，其LOD值为2. 56，是主效QTL，距离最近的一个分子标记为me6pml9-1300， 大小为150bp JgPsg-I的距离为OcM，该标记可以作为梨果实可溶性糖含量的标记。所述 QTL位点Psg-I位于‘八月红’梨第7连锁群上，其解释12. 4%的可溶性糖含量特征。所述分子标记在梨分子育种中的应用，其特征在于用梨基因组DNA，采用SRAP引 物me6 :5，-TGAGTCCAAACCGGTAG-3，和pml9 5' - CTTCAAGCGGTGCATTCC-3，进行PCR扩增，扩 增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得一个分子标记大小为1300bp， 则表明梨果实可溶性糖含量的主效QTL位点存在，该QTL位点Psg-I位于‘八月红’梨第4 连锁群上，其解释12. 4%的可溶性糖含量特征。有益效果
(1)本发明首次对决定‘八月红’梨果实可溶性糖含量的数量性状位点进行了 QTL定 位，这为实现基于分子育种的多基因控制性状改良奠定了重要的基础和必要的前提。(2)本发明中确定了 ‘八月红’果实可溶性糖含量的QTL位点，对该数量性状决定 的贡献率较高，位点的贡献率为12. 4%。因此，基于此位点筛选连锁分子标记对目标性状判 断的准确性大大提高。(3)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需 彡5cM，本发明中与QTL位点连锁的标记距离为OcM，与目标位点表现为紧密连锁，这对于提 高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。因此，以上标记具有良好的应用价值， 可加快对梨果实可溶性糖性状改良的进度。四
图1为‘八月红’可溶性糖含量QTL位点Psg-I在BYH4上的位置。BYH代表的是‘八月红’连锁群，BYH后的数字代表连锁群数。连锁群上左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为cM，右侧则表示的是分子标 记的名称。共有4种分子标记，“E-M-”为AFLP标记，E和M分别指限制性内切酶I和 Mse I酶切，其后的数字是该标记多态性条带的编号；其它为SRAP、SSR标记和一个自交不 亲和S位点。连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间Psg-Ι。右边的曲线图为QTL的LOD 分布图，虚线为2. 5阈值。图2为SRAP引物组合me6pml9在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。箭头所指 的条带即 me6pml9-1300, M 为 pBR322 DNA/ Msp I ladder。五具体实施方式
实施例1
a)利用我国的两个梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交组合，获得其97株&群体。b)用 SSR (Simple sequence repeat)、 SRAP (Sequence related amplifiedpolymorphism)禾口 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)三禾中分子标记方法 分析两个亲本及其F1群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类 型。最终获得了 23个SSRs、S基因位点、226个SRAPs和482个AFLPs等共732个多态性 标记位点，然后利用Jionmap3. 0作图软件对其进行连锁分析，构建了一张共包含240个多 态性标记的‘八月红’梨的遗传连锁图谱。利用SSR、SRAP、AFLP分子标记方法，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及后代进行分析， 并统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。SSR标记的实验操作程序参考 Yomamoto T.等(Euphytica，2002，124 129-137)的 方法；SRAP标记的实验操作程序参考Li等(Theor Appl Genet, 2001,103 :455_461)的方 法；AFLP标记分别使用I和ifes I两种内切酶，具体实验操作程序参考Vos等(Nucleic Acids Res, 1995，23 :4407_4414)的方法。SSR和SRAP标记用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶强 碱银染法检测，AFLP标记用6%变性聚丙烯酰胺凝胶银染检测。将SSR、SRAP、AFLP电泳图谱上清晰出现的多态性条带记为“ 1 ”，无带记为“0”，不 清楚的带或缺失记为“_”，根据已知分子量的Marker (IOObp DNA Ladder)计算各多态性条 带的分子量。将分离条带按亲本来源归类，确定其来源及遗传类型。利用χ 2测验分析各 标记分离是否符合3:1或1:1的孟德尔分离比例，偏分离的在标记末尾用“*”标注。c)用Joinmap3. O分析软件构建‘八月红’梨的分子遗传连锁图谱。将第b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap3. O分析软件中适于cp群体构 图的格式导入J0inmap3. 0，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，以L0D=4. O 7.0，重组率=0.4，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图(Van Ooi jen，2001 )。d)对该F1群体单株的果实可溶性糖含量进行了测定，测定方法采用改良DNS法 测定(冯吉等，1989)。将可溶性糖含量的表型值和‘八月红’连锁图谱的相关文件导入 MapQTL5. O作图软件，选择区间作图法，以LOD值> 2. 5为标准，对梨的可溶性糖含量在‘八 月红’的连锁图谱上进行QTL分析和定位。结果表明，在‘八月红’的第7连锁群上检测到可溶性糖含量的QTL位点Psg-I (图 1)，LOD值为2. 56，与最近的SRAP分子标记me6pml9-1300的连锁距离为lcM，对该性状的 贡献率为12.4%。该QTL位点与其最近标记的距离远小于可应用于分子辅助选择的连锁标 记与目标性状的所要求的最大距离。其中SRAP分子标记方法为，以梨DNA为模板，采用SRAP引物 me6 5’-TGAGTCCAAACCGGTAG-3’
pml9 5'- CTTCAAGCGGTGCATTCC-3'
扩增条件=SRAP分析的PCR扩增体系为总体积20ul 其中包含0. 2mmol · L-I dNTP， 0. 3ymol ‘ L-I 上下游引物，2. Ommol · L-I MgC12，1 个单位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng， IXBuffer。PCR 反应程序为94 °C 3min ;35 个循环94 °C 40s，55 °C 50s , 72 °C Imin ； 72 °C IOmin, 10 °C IOmin ；
扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，能扩增出14条多态性条带，其 中1300bp大小的一条就是目标条带me6pml9-1300，则表明QTL位点Psg-I (图1)存在，与 SRAP分子标记me6pml9-1300的连锁距离为OcM，对该性状的贡献率为12. 4%。实施例2利用筛选到的与‘八月红’果实可溶性糖含量主效QTL相连锁的分子标记对‘八月红’ 与‘砀山酥梨’的97株F1杂交后代进行初步检测，以检测该方法在梨果实可溶性糖含量分 子标记辅助选择中的实用价值。用该97株后代的基因组DNA及SRAP引物me6和pml9进 行PCR反应，电泳后根据me6pml9-1300条带的有无来确定是否存在相应的标记，如果存在 标记，说明该植株的果实可溶性糖含量高，不存在则说明低，同时用实际测得的果实可溶性 糖含量结果与分子标记检测结果进行验证。 结果显示，在‘八月红，和‘砀山酥梨，的97株Fl杂交后代中，共有51株的DNA 扩增结果出现me6pml9-1300条带，这51株当中有37株的果实可溶性糖含量小于9. 0%， 所有这51株的果实可溶性糖含量平均值为8. 3 % ；共有38株后代的DNA扩增结果不出现 me6pml9-1300条带，其中16株的可溶性糖含量大于9. 0%，所有这38株的果实可溶性糖含 量的平均值为9. 2% ；8个单株条带缺失。用me6pml9-1300预测可溶性糖含量有较好的预测 效果。
权利要求
1.一种‘八月红’梨果实可溶性糖含量的分子标记，是通过下列步骤获得a)利用梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交获得F1后代单株；b)采用SRAP 弓I 物 me6 :5'-TGAGTCCAAACCGGTAG-3'禾口 pml9:5'-CTTCAAGCGGTGCATTCC-3'以梨基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙 烯酰胺凝胶上电泳分离，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其杂交后代基因组DNA进行分析，统 计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，将得到的多态性标记位点导 入Joinmap3. 0作图软件，构建‘八月红’梨的遗传连锁图谱；c)对‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交后代的F1群体单株的果实可溶性糖含量进行测定， 利用MapQTL5. 0作图软件的区间作图法，将F1群体每个单株的果实可溶性糖含量与‘八月 红’梨遗传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以11 值> 2. 5为标准，大于2. 5说 明存在一个QTL位点，检测到在母本‘八月红’的第7连锁群上检测到可溶性糖含量的QTL 位点I3Sg-I,其LOD值为2. 56，距离最近的一个分子标记为me6pml9-1300，大小为1300bp， 距Psg-I的距离为OcM，该标记可以作为梨果实可溶性糖含量的标记。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于所述QTL位点Psg-I位于‘八月红’ 梨第7连锁群上，其解释12. 4%的可溶性糖含量特征。
3.权利要求1或2所述分子标记在梨分子育种中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于用梨基因组DNA，采用SRAP引物me6 5，-TGAGTCCAAACCGGTAG-3，和 pml9 :5，- CTTCAAGCGGTGCATTCC-3’ 扩增，扩增产物在 8% 非 变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得一个分子标记大小为1300bp，则表明梨果实 可溶性糖含量的主效QTL位点存在，该QTL位点Psg-I位于‘八月红’梨第7连锁群上，其 解释12. 4%的可溶性糖含量特征。
全文摘要
本发明涉及‘八月红’梨果实可溶性糖含量的分子标记，属于遗传育种领域。利用SRAP、SSR、AFLP构建‘八月红’的遗传连锁图谱，结合对果实可溶性糖含量的表型鉴定，采用区间作图法对此群体进行分析，在‘八月红’的第7连锁群上检测到主效QTL的存在，可解释12.4%的可溶性糖含量特征。距离主效QTL位点Psg-1距离最近的标记为me6pm19-1300，其距离为0cm。所获得的可溶性糖主效QTL分子标记对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
文档编号C12Q1/68GK102115791SQ201010596658
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者吴俊 , 吴华清, 张瑞萍, 张绍铃, 李秀根, 杨健, 王苏珂, 王龙, 陶书田, 齐开杰 申请人:南京农业大学