中性蛋白酶npr表达和纯化的方法

专利名称：中性蛋白酶npr表达和纯化的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明涉及蛋白质的表达和纯化领域。
背景技术：
HbAlc监测是糖尿病疗判定和调整治疗方案的“金标准”，而目前市场上常见的广泛应用于生化分析仪的酶法测定HbAlc的试剂盒得到了大量客户的认可。中性蛋白酶 (NPR)作为测定HbAlc试剂盒中最重要的酶之一，其来源困难，价格昂贵，利用基因工程的手段将其进行表达，有着广泛的应用前景和良好的市场价值。嗜热芽孢杆菌的NPR主要的表达方式有两种，一是利用枯草芽孢杆菌将其进行表达，二是利用NPR自身的启动子使得其在大肠杆菌进行表达。目前有的关于中性蛋白酶NPR(Therm0Iysin)的表达，几乎都是利用杆菌自身发酵表达后再进行纯化，或者是利用枯草芽孢杆菌表达系统来进行表达，纯度可以达到很高的纯度，至少95%以上。大肠杆菌表达系统由于其研究背景成熟、操作简单而且成本低，是表达外源基因的首选表达系统。但是，目前的研究表明杆菌的蛋白酶基因却无法在大肠杆菌中进行表达。究其原因，目前说法最多是中性蛋白酶基因对大肠杆菌有致死作用或是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。目前，已有利用利用PUC19载体、JM109菌株在大肠杆菌表达NPR蛋白的报道。根据已有的文献报道，两种方式表达NPR蛋白表达量低，最主要的是其纯化方面要先后用到疏水层析和亲和层析，工艺复杂而且会降低收率， 限制了它的实用性。Kuniyo Inouye 等人(Extracellular production of recombinant thermolysin expressed in Escherichia coli， and its purification and enzymatic characterization, Protein Expression and Purification 46 (2006) 248-255)描述了一种利用中性蛋白酶自身的启动子在大肠杆菌表达其基因序列的方法。然而，上述方法较难获得理想表达，并且获得的蛋白纯度较低(90%左右)。因此，需要对中性蛋白酶WR在大肠杆菌表达系统中表达的方法进行研究以找到能提高NPR表达量和简化其纯化工艺的方法。

发明内容
发明人发现对pET系列的载体进行修饰(去除pET系列的T7启动子)并表达中性蛋白酶的全长基因(而非开放阅读框)可获得良好的表达效果。发明人发现1、在选择基因片段时，首选WR基因的全长基因，而非开放阅读框 (ORF)，从而在以后的表达中用到该基因自身的启动子；2、将NPR的全长基因克隆到常见的 pET28b表达载体上，但除去pET28b载体上的T7启动子基因；3、将构建的重组表达载体转化Rosetta(DEIB)表达菌株，增强含有稀有密码子基因的表达；4、保留pET28b多克隆位点 3’端His标签，以利于表达的蛋白通过亲和镍柱实现纯化。因此，本发明一方面提供一种中性蛋白酶的表达方法，该方法包括
a)通过中性蛋白酶的全长基因与去除T7启动子活性的PET载体构建重组表达质粒，以及b)通过步骤a)构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，从而表达中性蛋白酶。在本发明的方法中，优选的全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本发明的方法中，优选的中性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。优选地，本发明中使用的pET载体为pET28b。优选地，构建重组表达质粒时保留pET载体3’端的His标签，去掉NPR基因的终止密码子。优选地，本发明中使用的大肠杆菌为Rosetta(DE3)菌株。在本发明的方法中，优选通过BglII和B10I酶切位点构建重组表达质粒。优选地，本发明的方法还包括对表达的中性蛋白酶进行纯化的步骤。优选地，通过亲和镍柱对表达的中性蛋白酶进行纯化。优选地，本发明的方法获得的中性蛋白酶纯度在95%以上。本发明的方法可以广泛用于各个分子实验室进行表达，大大提高了蛋白的表达量及大大减少了 NPR的纯化工艺，达到表达量高、纯化简单的效果。


图1 :pUC19-NPR 转 JM109 后的表达情况，1 :pUC19_NPR 转 JM109 后上清；2 PUC19-NPR 转 JM109 后沉淀；3 :pUC19 转 JM109 后上清；4 :pUC19 转 JM109 后沉淀；M 蛋白标记。图2 :pET28b-NPR 转 JM109 后的表达情况，1、2 :pET28b_NPR转 JM109 后的上清；M
蛋白标记。图3 :pET28b-NPR转Rosetta(DEIB)后的表达情况及其纯化情况，M 蛋白标记；1 TCA浓缩后LB上清；2 =Ni柱纯化后穿透液；3 =Ni柱纯化后El ；4、Ni柱纯化后E2。图 4 :pET28b-NPR 分别转 JM109 和 Rosetta(DE3)的比较，Μ:蛋白标记；1、2、3、4 分别为pET28b-NPR分别转JM109后LB上清、过Ni柱后的穿透液、过Ni柱后的E1组分、过Ni 柱后的E2组分；5、6、7、8分别为pET28b-NPR分别转Rosetta(DE3)后的LB上清、过Ni柱后的穿透液、过Ni柱后的El组分、过Ni柱后的E2组分。图5 =NPR的Wfestern Blot鉴定，M 蛋白标记；1 =NPR经Ni柱纯化之后，浓缩前的 E2，组分；2 =NPR经Ni柱纯化之后，浓缩前的E2组分；3 =NPR经Ni柱纯化之后，浓缩后的 E2组分；4 =TCA浓缩后含NPR的LB上清；5 =NPR经Ni柱纯化之后，Ni柱纯化后浓缩后E2， 组分；6 =NPR经Ni柱纯化之后，浓缩后的E2组分。图6 :pET22b-npr/BL21重组蛋白表达，1 空白对照；2 蛋白表达产物；M 蛋白质标记；引用自张敏，赵丛，路福平，赵洪坤，杜连祥.中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究.食品与发酵工业2007年第33卷第10期(总第238期):31 34。图7 =NprT纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，M 分子量标记；1 纯化NprT ；引用自张敏，赵丛，杜连祥，路福平，高晨.嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究.中国科学C辑生命科学2008年第38卷第2期 166 172。
图8 嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(嗜热菌蛋白酶)的全基因序列，黑色框内编码成熟肽。图9 :中性蛋白酶的成熟肽序列。
具体实施例方式发明人对利用大肠杆菌表达中性蛋白酶进行了系统研究，发现利用多种pET系列的载体(如pET28a)表达中性蛋白酶的开放阅读框部分，较难得到目的蛋白的表达。发明人进一步发现对PET系列的载体进行修饰(去除pET系列的T7启动子)并表达中性蛋白酶的全长基因可获得良好的表达效果。在表达时，还可利用pET28b载体上的C端的His标签表达中性蛋白酶基因的全长序列。在本发明中，可以在Rosetta(DEIB)中表达中性蛋白酶基因的全长序列。因此，在设计本发明时需要考虑1)合适地将含NPR自身的启动子的全长基因克隆到pET28b上，并且除去pET28b 自身带有的T7启动子；2)重新构建的表达载体转化Rosetta (DE3)后实现分泌表达；3)在LB中分泌着的NI3R蛋白，一般至少都要有500_1000ml的上清，由于上样量太大，在用AKTA进行纯化时，会造成后续各收集峰样品的浓度太低而不容易通过SDS-PAGE检测。在此基础上，对本发明的设计如下首先同时参考NPR基因和载体pET28b的酶切位点图谱，选取BglII和BioI酶切位点，通过克隆手段构建重组质粒pET2m3-NPR ；然后将pET2m3-NPR转化Rosetta (DE3)表达菌株，挑选单克隆在LB培养基、37°C培养M小时；最后经过离心，收集上清、膜包超滤浓缩后用于蛋白的纯化及后续的监测工作。实施例1 构建重组质粒pET28b_NPR1)设计特异性引物，PCR扩增全长基因综合分析NPR的酶切图谱和pET28b载体(Novagen)的多克隆位点(MCS)的序列特征，再设计引物时，上下游分别引入BglII和BioI酶切位点，在如下反应条件进行WR的 PCR扩增，得到了约2000bp的片段，符合理论上片段的大小，可以用于基因的克隆。上游引物GAGATCTAAGCTTTTATTAGGAAT下游引物GCTCGAG TTTCACCCCTAC在做PCR反应时，用的酶为高保真性的DNA聚合酶；引物终浓度都为0. 5uM ；模板为化学合成的NPR全基因序列。94°C、5min，1 个循环；94°C、20s，54°C、20S，72°C、lmin，35 循环；72°C、10min，1 个循环。2) NPR片段和pET28b的双酶切及连接选取合适BglII和BioI的共用的缓冲液，在37°C下，各自充分酶切Iug的pET28b 和至少3ug纯化的NPR片段，通过胶回收试剂盒回收后，在T4DNA连接酶的作用下实现连接。3)转化克隆菌株和阳性克隆的筛选及测序
连接后的产物转化DH5 α细胞，提取质粒，用BglII和B10I进行双酶切鉴定，筛选阳性克隆后用于测序，上游测序引物自带，对测序结果进行分析，确保没有基因的突变和移码等。实施例2 融合蛋白的表达1)转化Rosetta (DE3)表达菌株(Novagen)并进行表达将经过测序结果分析正确的重组质粒pET28b_NPR转化Rosetta (DE3)表达菌株， 挑去单菌落，经过小量培养后，按1 %的接种量转接到500mL的LB培养基中进行培养、表达， 24小时后取出，离心机离心后收集保存上清。2)表达蛋白的SDS-PAGE检测上清用SDS-PAGE检测，可看到微弱的条带，这是由于LB上清体积太大，导致样品中蛋白浓度太低；用TCA沉淀的方法浓缩样品中的蛋白，再用SDS-PAGE检测，可看到明显的有蛋白条带。实施例3 =NPR蛋白的纯化及鉴定1)NPR的亲和镍柱纯化由于当初在构建重组质粒时，发明人保留了 pET28b载体MCS的3’端的His标签并直接接在NPR的后面进行表达，所以表达的WR可以直接利用其3’端的His标签通过亲和镍柱来对其进行纯化。纯化时，用低浓度OOmM)咪唑平衡镍柱及系统、用一定百分比的高浓度(500mM)咪唑来进行洗脱，收集穿透液以及各个洗脱峰。2)纯化后个收集峰的SDS-PAGE检测收集的各峰，部分经过TCA沉淀后，用SDS-PAGE检测，在洗脱峰可以看到明显的、 单一的表达条带，约40KDa，比理论上(37KDa)的稍大。3)表达蛋白的Wfestern Blot鉴定用Wfestern Blot对纯化的NPR蛋白进行鉴定。由于NPR蛋白在理论上3，端是带有His标签的，所以选取的一抗为鼠抗His tag的单克隆抗体，二抗为HPR偶联的羊抗鼠抗体，选取DAB为底物进行显色，显色后结果表明得到了 1条特异的、40KDa大小的条带(图 5)，这充分证明表达的蛋白应为WR蛋白。图5第4泳道在LB上清中可以通过印迹得到很单一的条带，也充分证明了 LB中的确已经含有NI3R蛋白。实施例4 与其他几种表达方式的对比1.完全按照文献 艮道(Kuniyo Inouye,Masashi Minoda,Teisuke Takita,Haruko Sakurama, Yasuhiko Hashida, Masayuki Kusano, Kiyoshi Yasukawa. Extracellular production of recombinant thermolysin expressed in Escherichia coli, and its purification and enzymatic characterization.Protein Expression and Purification 46 (2006) 248-255)，构建了重组质粒 pUC19_NPR，将其转化 JM109 细胞，并在 37°C经过M小时的培养，SDS-PAGE检测表达LB上清中的NPR蛋白。2.模仿上述文献做法，将发明人自己构建的重组质粒pET28b_Nra也转化JM109细胞，在37°C经过M小时的培养，SDS-PAGE检测表达LB上清中的NPR蛋白。3.按照本发明提出方法，用重组质粒pET2 -Nra转化ROSetta(DE；3)，在37°C经过 24小时的培养，SDS-PAGE检测表达LB上清中的NPR蛋白。SDS-PAGE检测结果表明，pUC19_NPR转JM109后LB上清几乎检测不到蛋白，而
6且即使是沉淀，与PUC19空载体转化JM109后的阴性对照相比，也没有特异的表达条带 (图1) ；pET28b-NPR转JM109 (图2)后上清中都可以看到微弱的蛋白条带，pET28b_NPR 转R0Setta(DE3)后的LB上清浓缩后可以看到很明显的条带，纯度在95%以上(图3)； pET28b-NPR分别转JM109和Rosetta(DEIB)后纯化后得产物经过相同倍数的浓缩后，会发现pET28b-NPR转Rosetta(DEIB)的表达产物的条带明显强于pET28b_NPR转JM109后的表达产物的条带(图4)。目前，关于嗜热菌中性蛋白酶的表达主要有4种，依据其应用的广泛程度，结合本发明专利的表达蛋白质的方法共5种表达方式的主要的优缺点分别总结在下表中。
现有技术的表达方式本发明表1.利用嗜热2.利用 pHP133.利用pET4.利用中性5.利用中性蛋白达芽孢杆菌进经过改造后系列的T7启蛋白酶自身酶自身的启动方行自身发酵的载体来表动子在大肠的启动子和子、去除利用pET式表达达在枯草芽杆菌 BL21PUC19载体系列的T7启动子的孢杆菌菌株(DE3)中表达在大肠杆菌而利用pET28b简DB104中表枯草芽孢杆JM109中表载体上的C端的单达嗜热脂肪菌中性蛋白达嗜热菌中His标签，并且是说芽孢杆菌的酶的的全长性蛋白酶全在 Rosetta (DE3)明中性蛋白酶编码序列的长基因中进行表达的CDSCDS说pHB13PSNpET22b-NPRpUC19-NPRpET28b-NPR(全明(CDS)(全长基因)长基因)优直接选取嗜能够非常容细胞破碎后在LB上清在LB上清中得占热芽孢杆菌易地得到外可利用Ni柱中得到NPR到NPR的表达，进行发酵，源表达的中进行纯化的表达而且可以直接利取材方便性蛋白酶用Ni柱进行纯化缺发酵表达后细菌培养周超声破碎时纯化目的蛋唯一繁琐的就是占的蛋白成分期长，纯化相容易产生热白需要经过LB上清培养液的非常复杂，对较为繁琐，量，造成目的多步纯化，浓缩纯化中性蛋多步纯化，势蛋白的碳化，势必造成目白酶比较繁必造成目的渗透破碎过的蛋白的损琐，而且得蛋白的损失程稍微繁琐失率很低结图7图6图3果参考文献1参考文献2
参考文献1 张敏，赵丛，杜连祥，路福平，高晨.嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究.中国科学C辑生命科学2008年第38卷第2期166 172。参考文献2 张敏，赵丛，路福平，赵洪坤，杜连祥.中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究.食品与发酵工业2007年第33卷第10期(总第238期):31 34。因此，本发明利用去除T7启动子的pET系列载体在大肠杆菌中表达WR蛋白，其表达量明显高于传统方法表达的WR蛋白；所获得蛋白的纯度可达到95%以上。以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种中性蛋白酶的表达方法，该方法包括a)通过中性蛋白酶的全长基因与去除T7启动子活性的pET载体构建重组表达质粒，以及b)通过步骤a)构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，从而表达中性蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的中性蛋白酶的表达方法，其中所述的全长基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
3.根据权利要求1所述的中性蛋白酶的表达方法，其中所述的中性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.根据权利要求1所述的中性蛋白酶的表达方法，其中所述的pET载体为pET28b。
5.根据权利要求1所述的中性蛋白酶的表达方法，其中构建重组表达质粒时保留PET 载体3’端的His标签，去掉NPR基因的终止密码子。
6.根据权利要求1所述的中性蛋白酶的表达方法，其中所述的大肠杆菌为 Rosetta(DE3)菌株。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的中性蛋白酶的表达方法，其中在步骤a)中通过 BglII和BioI酶切位点构建重组表达质粒。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的中性蛋白酶的表达方法，还包括对表达的中性蛋白酶进行纯化的步骤。
9.根据权利要求8所述的中性蛋白酶的表达方法，其中通过亲和镍柱对表达的中性蛋白酶进行纯化。
10.根据权利要求9所述的中性蛋白酶的表达方法，其中所述的中性蛋白酶纯度在 95%以上。
全文摘要
本发明涉及中性蛋白酶NPR表达和纯化的方法。研究发现对pET系列的载体进行修饰并表达中性蛋白酶的全长基因可获得良好的表达效果。因此，本发明提供一种中性蛋白酶的表达方法，包括a)通过中性蛋白酶的全长基因与去除T7启动子活性的pET载体构建重组表达质粒，以及b)通过步骤a)构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，从而表达中性蛋白酶。本发明的方法可以方便、简单地得到纯的NPR蛋白，简化了NPR的纯化过程。
文档编号C12N15/09GK102168078SQ20101060997
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者刘希, 贾如, 龚俊 申请人:北京九强生物技术股份有限公司