专利名称：易瑞沙药物靶向基因位点检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属生物技术领域，具体涉及检测易瑞沙药物靶向基因位点是否发生突变的试剂盒。
背景技术：
易瑞沙(Iressa)，又称吉非替尼片(Gefitinib)，是近年来开发的一种特异性较高的治疗非小细胞肺癌的肿瘤靶向治疗药物，属于表面生长因子受体(EGFR)-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类药物，该类药物通过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶活性而阻断肿瘤细胞的信号传导，达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。临床实践显示这种药物疗效存在很大的个体差异，仅有 10% -20%的个体会有很好效果。研究发现，EGFR基因酪氨酸激酶区域存在多种突变，这些突变主要集中在外显子 18-21上，其中以19号外显子内缺失突变以及21号外显子的L858R最为常见，这些突变能够很好预测易瑞沙的治疗效果，为医生合理指导用药提供依据。国内外大量的关联研究表明，易瑞沙的药物疗效靶向基因包括表面生长因子受体基因(EGFR)和致息基因(K-RAS)。荧光定量PCR是近几年来兴起的生物学技术，具有准确性高、重现性好等特点， 已广泛用于基因表达研究、SNP位点分析等诸多领域，该方法采用完全闭管检测，省去了对 PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判断有计算机完成，简化了操作步骤，并增加了结果的可靠性。是一种简便快速检测SNP位点基因型的方法。
发明内容本实用新型针的目的是提供一种采用荧光定量PCR技术同时检测两个易瑞沙药物靶向基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管、装有阳性对照品的一个试管、装有阴性对照品的一个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型一荧光探针、SNP位点基因型二荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，表面生长因子受体基因(EGFR)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-AAAGCTGCGTGA-3，下游引物序列5，-TGAAGGAGAAGGTG-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-ATCGgCTCCC-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-TCGaCTCCCGC-TAMRA-3‘致息基因(K-RAS)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-AAGAACGAAGACTTCA-3，[0015]下游引物序列5，-GGGAGGAGCTGAC-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-ACACTTcCTTC-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-CACTTtCTTCA-TAMRA-3‘对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为口腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为6个反应管，每一个SNP位点检测使用3 个反应管，其中1个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用1个反应管，每管中总体积 ομ ，其中8μ1 PCR反应液，2 μ 1检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。 反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取，根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测易瑞沙药物靶向基因SNP位点，从而指导医师正确用药，选择正确的临床治疗方案，有利于患者进行个体化治疗。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个易瑞沙药物靶向基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP 位点，本实用新型试剂盒将同一药物靶向的所有SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对易瑞沙药物的疗效分析也更便捷。
图1为本实用新型的结构示意图。图2为表面生长因子受体基因(EGFR)上的SNP位点被检测样品的二维荧光图。图3为二氢叶酸还原酶(DHFR)上的SNP位点被检测样品的二维荧光图。图4为所有位点被检测样品的实时扩增曲线。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。实施例1参见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管 5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照
口 G 口口 ο其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型一荧光探针、SNP位点基因型二荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。[0034]实施例21.材料血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNIPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针表面生长因子受体基因(EGFR)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-AAAGCTGCGTGA-3，下游引物序列5，-TGAAGGAGAAGGTG-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-ATCGgCTCCC-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-TCGaCTCCCGC-TAMRA-3‘致息基因(K-RAS)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-AAGAACGAAGACTTCA-3，下游引物序列5，-GGGAGGAGCTGAC-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-ACACTTcCTTC-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-CACTTtCTTCA-TAMRA-3‘3.样本检测选取30例男性血液样本，其中已确定易瑞沙药物疗效低的为M例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为6个反应管，每管中总体积10 μ 1，其中8 μ 1 PCR反应液，每一个SNP位点检测使用3个反应管，1个反应管中加入2 μ 1被检测DNA，另外 2个反应管中加入2μ1阳性对照和阴性对照，在ΑΒΙ7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95 V、30秒，60°C、1分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。4.结果被检测样本的表面生长因子受体基因(EGFR)上的SNP位点的二维荧光图参见图 2，致息基因(K-RAS)上的SNP位点的二维荧光图参见图3，所有位点实时扩增曲线参见图4。30例被测样本的两个SNP位点基因型统计结果参见表1，表权利要求1. 一种易瑞沙药物靶向基因位点检测试剂盒，其特征是由包装盒体(1)、衬垫O)、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管C3)、装有阳性对照品的一个试管 G)、装有阴性对照品的一个试管( 组成，衬垫( 上设有容器孔，分别放置两管荧光定量 PCR反应液(3)、一管阳性对照品(4)和一管阴性对照品(5)。
专利摘要本实用新型提供了一种检测易瑞沙药物靶向基因位点是否发生突变的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个易瑞沙药物靶向基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一药物靶向的两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对易瑞沙药物的疗效分析也更便捷。
文档编号C12Q1/68GK201952437SQ20102064249
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者任峻, 秦胜营, 陈培华 申请人:上海佰真生物科技有限公司