专利名称：索拉非尼药物靶向基因位点检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属生物技术领域，具体涉及检测索拉非尼药物靶向基因位点是否发生突变的试剂盒。
背景技术：
索拉非尼是一种新型多靶向性的治疗肿瘤的口服药物。其首要开发目标为用于治疗对标准疗法没有响应或不能耐受之胃肠道基质肿瘤和转移性肾细胞癌。能选择性地靶向某些蛋白的受体，后者被认为在肿瘤生长过程中起着一种分子开关样的作用。索拉非尼是一种多激酶抑制剂。临床前研究显示，索拉非尼能同时抑制多种存在于细胞内和细胞表面的激酶，包括RAF激酶、血管内皮生长因子受体-2 (VEGFR-幻、血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)、血小板衍生生长因子受体-β (PDGFR_0)、KIT和FLT-3。由此可见，索拉非尼具有双重抗肿瘤效应，一方面，它可以通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长；另一方面，它又可通过抑制VEGFR和PDGFR而阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长。索拉非尼在临床前动物试验中显示了广泛的抗肿瘤活性。 在美国和欧洲进行的治疗晚期肾癌的III期随机临床研究中，903例接受过一次系统治疗 (生物免疫或化疗)失败的晚期肾癌病人随机分为两组，一组接受Sorafenib，另一组接受安慰剂治疗。中期分析时已发生222例死亡事件，结果表明两组的客观有效率分别为10% 和2%，另分别有74%和53%的病人肿瘤保持稳定。Sorafenib组的无进展生存期较安慰剂组延长一倍(5. 8vs2. 8个月，风险比为0. 51)，且Sorafenib较安慰剂治疗显著改善了病人的生活质量。索拉非尼是目前世界上第一个被批准应用于临床的一个多靶点的靶向治疗药物。目前正在由中国医学科学院肿瘤医院的孙燕院士作为主要研究者在亚洲开展临床试验，试验的主要对象是有病理证实的无法手术切除和/或转移的晚期肾透明细胞癌，这些患者既往最多可以接受过一次系统的治疗。国内外大量的关联研究表明，索拉非尼的药物疗效靶向基因包括RAF激酶(RAF)、 血管内皮生长因子受体_2(VEGFRD、血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-;3)和血小板衍生生长因子受体-β (PDGFR- β )。荧光定量PCR是近几年来兴起的生物学技术，具有准确性高、重现性好等特点， 已广泛用于基因表达研究、SNP位点分析等诸多领域，该方法采用完全闭管检测，省去了对 PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判断有计算机完成，简化了操作步骤，并增加了结果的可靠性。是一种简便快速检测SNP位点基因型的方法。
发明内容本实用新型针的目的是提供一种采用荧光定量PCR技术同时检测四个索拉非尼药物靶向基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测四个SNP位点的荧光定量PCR反应液的四个试管、装有阳性对照品的一个试管、装有阴性对照品的一个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置四管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。[0007]其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型一荧光探针、SNP位点基因型二荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，RAF激酶(RAF)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-GTGTTAAGTGAGAAGGTGAT-3，下游引物序列5，-AGGATAGCCAGGAAGAGAAA-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-GACCgTTGCCC-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-AGACCaTTGCCC-TAMRA-3‘血管内皮生长因子受体-2 (VEGFR-2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-CCTGGTGGACATGGTGAATGAC-3，下游引物序列5，-CCGCCTCATAGTTGGTGTAGATG-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-TGCAAATACaTCTCCC-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-TGCAAATACgTCTCCC-TAMRA-3‘血管内皮生长因子受体-3 (VEGFR-3)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-GAACTCCCTGAAAAGCTAAGC-3，下游引物序列5，-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-ATCCAaAAAGTCCA-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-TCCAgAAAGTCCA-TAMRA-3‘血小板衍生生长因子受体-β (PDGFR- β )上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3，下游引物序列5，-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-GACcCAGAAAG-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-GACgCAGAAAG-TAMRA-3‘对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为口腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于20°C，尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为12个反应管，每一个SNP位点检测使用3 个反应管，其中1个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用1个反应管，每管中总体积 ομ ，其中8μ1 PCR反应液，2 μ 1检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。 反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95 V、30秒，60°C、1分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取，根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测索拉非尼药物靶向基因SNP位点，从而指导医师正确用药，选择正确的临床治疗方案，有利于患者进行个体化治疗。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测四个索拉非尼药物靶向基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个
4SNP位点，本实用新型试剂盒将同一药物靶向的所有SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对索拉非尼药物的疗效分析也更便捷。
图1为本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。实施例1参见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体1、衬垫2、装有检测四个SNP位点的荧光定量PCR反应液的四个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管 5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型一荧光探针、SNP位点基因型二荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于20°C，尽量减少反复冻融。实施例21.材料血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNIPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针RAF激酶(RAF)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-GTGTTAAGTGAGAAGGTGAT-3，下游引物序列5，-AGGATAGCCAGGAAGAGAAA-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-GACCgTTGCCC-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-AGACCaTTGCCC-TAMRA-3‘血管内皮生长因子受体-2 (VEGFR-2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-CCTGGTGGACATGGTGAATGAC-3，下游引物序列5，-CCGCCTCATAGTTGGTGTAGATG-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-TGCAAATACaTCTCCC-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-TGCAAATACgTCTCCC-TAMRA-3‘血管内皮生长因子受体-3 (VEGFR-3)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-GAACTCCCTGAAAAGCTAAGC-3，下游引物序列5，-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-ATCCAaAAAGTCCA-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-TCCAgAAAGTCCA-TAMRA-3‘血小板衍生生长因子受体-β (PDGFR- β )上的SNP位点检测引物和探针为[0062]上游引物序列5，-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3，下游引物序列5，-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3，基因型一荧光探针序列5，-FAM-GACcCAGAAAG-TAMRA-3‘基因型二荧光探针序列5，-VIC-GACgCAGAAAG-TAMRA-3‘3.样本检测选取30例血液样本，其中已确定索拉非尼药物疗效低的为18例。样本用血样总 DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为12个反应管，每管中总体积10μ 1，其中8μ 1 PCR反应液，每一个SNP位点检测使用3个反应管，1个反应管中加入2 μ 1被检测DNA，另外 2个反应管中加入2μ1阳性对照和阴性对照，在ΑΒΙ7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。4.结果被检测样本的RAF激酶(RAF)上的SNP位点被检测样品的二维荧光图参见图2，血管内皮生长因子受体_2(VEGFRD上的SNP位点被检测样品的二维荧光图参见图3，血管内皮生长因子受体-3 (VEGFR-3)上的SNP位点被检测样品的二维荧光图参见图4，血小板衍生生长因子受体-β (PDGFR-β)上的SNP位点被检测样品的二维荧光图参见图5，所有位点实时扩增曲线参见图6。30例被测样本的四个SNP位点基因型统计结果参见表1，表权利要求1. 一种索拉非尼药物靶向基因位点检测试剂盒，其特征是由包装盒体(1)、衬垫O)、 装有检测四个SNP位点的荧光定量PCR反应液的四个试管(3)、装有阳性对照品的一个试管 G)、装有阴性对照品的一个试管( 组成，衬垫( 上设有容器孔，分别放置四管荧光定量 PCR反应液(3)、阳性对照品(4)和阴性对照品(5)。
专利摘要本实用新型提供了一种检测索拉非尼药物靶向基因位点是否发生突变的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测四个SNP位点的荧光定量PCR反应液的四个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置四管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测四个索拉非尼药物靶向基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一药物靶向的四个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对索拉非尼药物的疗效分析也更便捷。
文档编号C12Q1/68GK202039068SQ20102064250
公开日2011年11月16日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者任峻, 秦胜营, 陈培华 申请人:上海佰真生物科技有限公司