靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料及制备和应用的制作方法

专利名称：靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料及制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料及制备和应用，具体说是基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗肿瘤药物和基因等负电性治疗用生物分子共载载体 材料及其制备方法和应用。
背景技术：
将基因和抗肿瘤药物组合后共同进行靶向输送，可模拟临床肿瘤治疗的联合用药模式，分别通过不同途径协同作用，可以使二者达到微观水平上的序贯联合作用，提高了各自的抗肿瘤疗效，同时降低药物对人体正常器官、组织的毒副作用。例如多药耐药是多种癌症化疗无效或渐失效的主要原因，如果将抗肿瘤药物和逆转肿瘤细胞多药耐药的小干扰RNA (MDR siRNA)进行共载输送，可以用来逆转肿瘤多药耐药，增加耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性，提高化疗药物的抗肿瘤疗效。或者将抗肿瘤药物与抑制肿瘤细胞生长的端粒酶逆转小干扰RNA (TERT siRNA)、诱导肿瘤细胞调亡的小干扰RNA (Bcl — 2靶向的siRNA)或者抗肿瘤的蛋白药物等进行共载输送，可以使化疗药与这些基因或大分子蛋白药物一起协同杀死肿瘤细胞，从而提高抗肿瘤疗效。另一方面常用的化疗药物由于其全身分布，要达到病灶部位的药物有效浓度，会对人体的其它部位产生较大的毒副作用，一些病人往往死于化疗药物对其他脏器的伤害。因而能够达到靶向输送对于提高药效和降低药物副作用更重要。导向治疗属于靶向给药系统，是指让治疗药物与靶向载体相结合，在载体的导向下把药物运送到靶器官或靶组织，使药物有选择的集中于人体的病变部位，以减少药物在非靶向组织的无效流失，从而提高药效，更重要的是避免对正常器官和组织的毒副作用。因而就需要寻找一种能实现靶向输送的多功能高效的药物和基因共载输送体系。要对抗肿瘤药物和基因进行共载靶向输送，就需要找到可以进行多种功能化的适合的载体，由于新型碳纳米材料氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)具有大比表面积、可同时进行多种功能化、极好的水溶液分散性、无生物毒性、可进入细胞并具有酸敏性等特点，可用来负载大量的各种分子，包括各种金属、生物分子、荧光分子和多种药物等，从而使其在药物及基因的靶向输送以及生物分子的检测、分离和纯化等方面具有许多潜在的应用。要实现用氧化石墨烯携带抗肿瘤药物和基因共同进入肿瘤细胞，首先需要氧化石墨烯先载着抗肿瘤药物和基因到达肿瘤细胞。一种常见的实现基因或药物靶向输送的方法是在转运载体上连接能够与肿瘤细胞表面的某些特定分子相互作用的特异性配体，例如作用于肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体、作用于细胞表面叶酸受体的叶酸或作用于细胞表面铁传递蛋白受体的铁传递蛋白等都可以增强载体材料的肿瘤细胞靶向传输效果。其中叶酸是一种常用且效果较好的肿瘤细胞靶向分子，与它特异性相互作用的叶酸受体在大部分恶性肿瘤中具有高度表达，有时可比正常组织高出100 300倍。细胞膜共振提示叶酸纳米粒子在肿瘤细胞中的浓度比游离叶酸高10倍，叶酸对于卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、头颈部肿瘤及粒细胞白血病等多种肿瘤细胞都有很好的靶向效果。而甘草次酸受体介导的和多糖介导的输送体系能够实现肝靶向药物和基因输送。
为了增加氧化石墨烯的生物相容性并降低毒性，通常采用聚乙二醇、普鲁兰多糖和壳聚糖等生物相容性大分子对其进行修饰。其中壳聚糖是自然界唯一的氨基多糖甲壳素的脱乙酰产物，具有优良的生物学性质(良好的生物相容性和可生物降解性、无毒性及被动的肿瘤靶向性等)和物理化学特性(高反应活性及PH敏感性等)，是一种理想的药物靶向和缓控释高分子载体。因此，用壳聚糖对氧化石墨烯进行修饰，能很好的增加其生物相容性。在壳聚糖的侧链有多个氨基，如对其部分氨基偶联乳糖酸、甘草次酸、叶酸，或具有肿瘤靶向性的小肽，则可以实现氧化石墨烯载体体系的靶向输送。而对壳聚糖侧链剩余的部分氨基进一步季铵化，则能增强其正电性，从而能够更高效的携载基因。此外，文献(Nano Lett. 2010, 10, 3318 - 3323.)报道，一定大小的功能化氧化石墨烯能够在肿瘤组织中高度富集，具有明显的肿瘤组织滞留性，即增强渗透滞留效应(Enhanced permeability and retention effect, EPR)效应。因而米用连接祀向分子的壳聚糖修饰氧化石墨烯，可以使其主动靶向到肿瘤部位，再利用特定尺寸氧化石墨烯对肿瘤组织的EPR效应，结合主动靶向与被动靶向协同作用，增强多功能化氧化石墨烯载体对肿瘤的靶向作用。同时，氧化石墨烯和壳聚糖本身都对某些抗肿瘤药具有酸敏性，因而壳聚糖修饰的氧化石墨烯可以实现抗肿瘤药物和基因在肿瘤细胞内的最大释放。 因此本发明制备一种基于氧化石墨烯的具有靶向性的抗肿瘤药物和基因的共载输送体系，在载体的导向下把抗肿瘤药物和基因共同输送到靶组织，使其有选择的集中于人体的特殊部位，从而提高其抗肿瘤疗效，此项研究为肿瘤的联合治疗提供理论基础和方法依据。

发明内容
本发明的目的是提供一种基于氧化石墨烯的靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料及制备和应用，它是针对解决化疗药物对人体正常组织具有极大副作用及容易产生多药耐药等问题，将抗肿瘤药物和基因分子组合后共同进行靶向输送，使二者达到微观水平上的序贯联合作用，提高了各自的抗肿瘤疗效，同时降低药物对人体正常器官、组织的毒副作用。本发明采用功能化氧化石墨烯做载体，以具有良好生物相容性的天然多糖一壳聚糖为修饰材料，制备抗肿瘤药物和基因分子的共载体系，利用各种靶向分子的靶向性以及特定尺寸氧化石墨烯在肿瘤组织的增强渗透滞留效应，同时结合氧化石墨烯对所载药物的PH响应控制释放性能，达到在肿瘤细胞内释放药物，从协同用药的层面出发，合成出一种具有肿瘤靶向或肝靶向的抗肿瘤药物和基因共载智能输送体系，为肿瘤的联合治疗提供理论基础和方法依据。本发明提供的一种基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料是将叶酸、乳糖酸等肿瘤细胞靶向或肝靶向的分子与可溶性壳聚糖的部分氨基通过酰胺键连接，制备二者偶联物，然后再将其与氧化石墨烯连接，最后利用一个带季铵基团的环氧化合物对其进一步季铵化而制成，利用壳聚糖的季铵化部分通过静电引力负载基因分子；再采用非共价键方法，通过31 — JI共轭、氢键、疏水效应等作用负载抗肿瘤药物。其中叶酸等靶向分子、壳聚糖、氧化石墨烯与带季铵基团的环氧化合物的质量比1 :1-50
O.2-20 0.1-100。
制备方法是在脱水剂存在下，将叶酸、乳糖酸等肿瘤细胞靶向或肝靶向的分子与可溶性壳聚糖在水溶液中搅拌反应，旋蒸，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，产物叶酸或乳糖酸等靶向分子和壳聚糖偶联物浓缩冻干后在脱水剂的存在下与氧化石墨烯超声搅拌反应，分离，洗涤产物，再与带季铵基团的环氧化合物在80°c下超声搅拌反应，反应结束后固体产品经反复离心洗涤，得到带正电荷的功能化氧化石墨烯，分散在水或培养基RPMI 1640中与抗肿瘤药物和基因分子混合，孵育即可。所述的靶向分子是指具有肿瘤靶向或肝靶向的各种分子，优选的有叶酸、乳糖酸、半乳糖苷、甘草次酸、肿瘤细胞靶向的各种抗体和小肽等。所述的含有季铵基团的环氧化合物指2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(2, 3-Epoxypropylttrimethylam monium Chloride)等带有环氧基和季铵基的所有化合物。所述的抗肿瘤药物的负载量为O. 05 2. O mg/mg ο·
所述的药物是指具有水溶性的各种药物，优选的有具有共轭体系的药物，如(盐酸)阿霉素及其衍生物类药物、(盐酸)道诺霉素、(盐酸)米托蒽醌、甲氨喋呤、(硫酸)长春碱及其衍生物类药物、(盐酸)羟基喜树碱、(盐酸)阿糖胞苷、5 —氟尿嘧啶等中的一种或两种
坐寸ο所述的基因分子的负载量为O. 01 50 Mmol/g。所述的基因分子是指具有RNA干扰作用的各种小干扰RNA、各种抑制肿瘤生长的抑癌基因以及抗肿瘤的蛋白药物等。优选的有抑制肿瘤生长的端粒酶反转录酶siRNA、抑制肿瘤细胞多药耐药性的多药耐药siRNA、抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞凋亡的siRNA和具有免疫调节作用的各种siRNA等中的一种或两种等，抑癌基因Pdcd4(programmed celldeath 4)、RECK、转录调节因子，如Rb、p53，负调控转录因子，如WT，周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI )，如pl5、pl6、p21，信号通路的抑制因子，如ras GTP酶活化蛋白(NF-1 )，磷脂酶(PTEN)，DNA修复因子，如BRCA1、BRCA2，与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分，如APC> Axin 等。所述的氧化石墨烯是指分子骨架由六边形晶格排列的单层石墨原子组成，且经过功能化而得到的含有含氧基团(羧基、羟基、环氧基和羰基)的二维平面材料，其厚度分布在
O.3nm到2nm之间，大小分布在IOnm2到400Mm2之间。该功能化氧化石墨烯材料可采用机械剥离法、晶体外延生长法及化学氧化等方法制备。该氧化石墨烯材料能很好的分散到水溶液中。本发明提供的一种基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料的制备方法包括如下的步骤
O靶向分子和可溶性壳聚糖偶联物的制备在脱水剂的存在下，将叶酸等靶向分子和可溶性壳聚糖混溶于水溶液中，室温搅拌一天，体系旋蒸脱溶，浓缩物过葡聚糖凝胶柱以除去小分子杂质，将产物浓缩冻干，获得二者偶联产物。2)将步骤I)制备的偶联产物修饰在氧化石墨烯上，在脱水剂的存在下，将靶向分子和可溶性壳聚糖偶联物与氧化石墨烯混合超声溶于水中(水浴超声60W，I小时)，室温搅拌四天，产物通过反复离心、超声分散(水浴超声60W，2分钟)循环，进行洗涤，除去未反应的偶联物。
3)将步骤2)制备的功能化氧化石墨烯与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵混溶于水溶液中，加氢氧化钠调pH值至7-8，80°C搅拌反应24小时，产物通过反复离心、超声分散(水浴超声60W，2分钟)循环，进行洗涤，除去未反应的2，3-环氧丙基三甲基氯化铵。其中，氧化石墨烯的制备过程可参考(ACSNano, 2008, 2，463-470)。所述的靶向分子和可溶性壳聚糖偶联物和脱水剂的质量比为I :1-1000 :0. 1-10。所述的氧化石墨烯和步骤I)制备的偶联产物和脱水剂的质量比为I :5-50 0.5-5。所述的可溶性壳聚糖分子量在1000-10000。所述的脱水剂为l-ethyl-3(3-dimethy amino-propyl) carbodiimide(EDC)及其盐酸盐，1，3-dicyclohexylcarbodi-imide (DCC)及其盐酸盐，
1,3-diisopropylcarbodi-imide (DIC)及其盐酸盐，1，3-dihexylcarbodi_imide (DHC)及其盐酸盐，N-hydroxy succinimide (NHS)及其钠盐，N-hydroxysulfosuccinimide(sulfo-NHS)及其钠盐，l-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)中的一种或多种。本发明基于功能化氧化石墨烯的靶向性的抗肿瘤药物和基因共载载体材料作为一种低毒高效的药物载体材料，用于制备肿瘤治疗的药物。本发明基于功能化氧化石墨烯的靶向性的抗肿瘤药物和基因共载载体材料的显著优点是
I、该载体材料充分利用新型碳纳米材料氧化石墨烯具有大比表面积、可多重修饰、高稳定性、无免疫原性的特点，制备基于多功能化氧化石墨烯的靶向性抗肿瘤药物和基因共载智能载体材料。该功能化高效氧化石墨烯纳米基因载体采用天然多糖可溶性壳聚糖修饰，具有很好的生物相容性和水溶性，高效负载抗肿瘤药物和基因分子，实现高度靶向、可控释放及联合用药的高效药物输送途径。2、利用抗肿瘤药物和基因共载智能输送，利用其协同作用达到肿瘤联合治疗的效
果O3、基于氧化石墨烯对药物的pH敏感控制释放性能，实现药物胞内释药，避免化疗药在输送过程中大量释放，降低其对正常组织的毒副作用。总之，本发明针对针对解决化疗药物对人体正常组织具有极大副作用及容易产生多药耐药等问题，将抗肿瘤药物和基因分子组合后共同进行靶向输送，使二者达到微观水平上的序贯联合作用，提高了各自的抗肿瘤疗效，同时降低药物对人体正常器官、组织的毒副作用，同时也为基因的体内靶向输送提供了新方法。


图I、实施例I中合成的具有肝靶向性的功能化氧化石墨烯的原子力显微镜照片。图2、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯的热重分析。图3、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯的红外光谱图。图4、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯负载抗肿瘤药物盐酸阿霉素后在不同pH值下的药物释放性能。图5、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯负载荧光标记的DNA后被人肝癌细胞QGY-7703吸收的共聚焦荧光显微镜照片。图6、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯负载盐酸阿霉素前后对人肝癌细胞QGY-7703的毒性作用。图7、实施例2中制备的功能化氧化石墨烯载多药耐药MDRl siRNA后对耐药人乳腺癌细胞的靶基因表达的影响。图8、实施例2中合成的功能化氧化石墨烯负载盐酸阿霉素及多药耐药MDRlsiRNA后对耐药人乳腺癌细胞MCF-7/MDR的毒性作用。
具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。除特别标明外，所用试剂和测试设备均为市售。实施例I :
第一步合成氧化石墨烯材料，制备过程可参考(ACSNano，2008，2，463-470);这一步的核心是获得氧化石墨烯材料。类似地，利用其它方法获得氧化石墨烯材料也可采用。第二步乳糖酰化壳聚糖的制备
乳糖酸 O. 2671 g, l-ethyl-3 (3-dimethy amino-propyl) carbodiimide (EDC)O. 1715g, N-hydroxy succinimide (NHS) 0. 1030 g溶解在5 mL蒸懼水中，超声溶解后，电磁搅拌I小时活化。称取I g纯化的壳聚糖，溶在3 mL蒸馏水中，超声溶解后，与活化的乳糖酸混合在一起，加入三乙胺调PH值至8-9，电磁搅拌反应48小时。体系旋蒸脱溶，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，收集流出的黄色溶液，将产物浓缩冻干，获得二者偶联产物。第三步氧化石墨烯与上述第二步产物连接
称取3 mg氧化石墨烯，分散在10 mL蒸馏水中，加氢氧化钠调pH值至6-7 JpAEDC
95.85mg, NHS 57.5 mg，超声溶解后，温水浴搅拌40分钟活化。在氧化石墨烯溶液中加入80 mg上述第二步产物乳糖酰化壳聚糖。超声溶解后，用三乙胺调pH值至8-9，35 °C油浴反应120小时。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次(3-5次)。偶联产物修饰氧化石墨烯的结构通过热重分析和红外光谱证明，见附图2和3。第四步第三步产物进行季铵化反应
将第三步产物超声分散在50 mL蒸馏水中，加入400 mg 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，加氢氧化钠调PH值至7-8，80°C油浴回流，电磁搅拌反应24小时。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次。产物通过激光粒度仪表征Zeta电位。第五步抗肿瘤药物盐酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的负载和在不同pH条件下的释放性能
将6 mL浓度为0. 33 mg/ml的功能化氧化石墨烯与12 mL浓度0. 45 mg/ml的盐酸阿霉素溶液混合并超声30分钟，室温避光搅拌12小时。然后样品在14000转/分钟下离心，用紫外光谱测定上清液中盐酸阿霉素的浓度。计算药物在多功能单层氧化石墨上的负载量为0. 477mg/mg。将该载药体系置于透析袋中分别在pH = 5和7. 4的溶液中进行体外释放实验。检测结果见附图4。
第六步用荧光素FAM标记的DNA负载在上述功能化氧化石墨烯上，进行体外靶向性检测
将 4 μ L 的 20 μ mol/L 荧光素 FAM 标记的 DNA (5，-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’ -FAM，上海生工生物工程技术服务有限公司)与25 μ L的I mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育2小时。用该负载荧光素标记的DNA的功能化氧化石墨烯与人肝癌细胞QGY-7703共同孵育30分钟后进行荧光显微镜检测。作为对照，未连接乳糖酸的功能化氧化石墨烯进行同样操作。体外靶向检测结果见附图5。第七步不同浓度的功能化氧化石墨烯载药前后对肿瘤细胞的毒性作用。采用WST-I试剂进行不同浓度的功能化氧化石墨烯载药前后对人肝癌细胞QGY-7703的毒性作用表征。取对数生长期细胞以4X IO3个/孔接种于96孔板，每组设3个复孔。将不同浓度的负载盐酸爱霉素前后的氧化石墨烯分别与Hela细胞孵育48小时后， 加入10 μ L WST-I试剂进行孵育2小时后，用酶标仪(Promega，GloMaxe-Multi )进行吸光检测。毒性检测结果见附图6。测试结果如图I 6所示。其中，图I、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯的原子力显微镜照片。(A :为功能化的氧化石墨烯；B :功能化后的氧化石墨烯)
图2、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯的热重分析图。(A :氧化石墨烯；B :乳糖酰化壳聚糖；C :乳糖酰化壳聚糖修饰的氧化石墨烯)。图3、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯的红外光谱图。(a :氧化石墨烯；b 功能化的氧化石墨烯；c :壳聚糖；d :乳糖酰化壳聚糖)。图4、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯负载抗肿瘤药物盐酸阿霉素后分别在pH为5. O和7. 4下的药物释放性能。图5、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯负载荧光标记的DNA后被人肝癌细胞QGY-7703吸收的共聚焦荧光显微镜照片(A :有乳糖酸酸连接的功能化氧化石墨烯负载荧光标记的DNA后；B :无乳糖酸连接的功能化氧化石墨烯负载荧光标记的DNA后；C :游离荧光标记的DNA)。左侧为荧光显微镜照片，右侧为光镜下照片。图6、实施例I中合成的功能化氧化石墨烯负载盐酸阿霉素前后对人肝癌细胞QGY-7703的毒性作用。(A :不同功能化氧化石墨烯负载盐酸阿霉素前对人肝癌细胞QGY-7703的毒性作用；B :不同功能化氧化石墨烯负载盐酸阿霉素后和游离盐酸阿霉素对人肝癌细胞QGY-7703的毒性作用。)
实施例2
第一步合成氧化石墨烯材料，制备过程可参考(ACSNano，2008，2，463-470);这一步的核心是获得氧化石墨烯材料。类似地，利用其它方法获得氧化石墨烯材料也可采用。第二步叶酸与壳聚糖偶联物的制备
叶酸 109. 4 mg, l-ethyl-3 (3-dimethy amino-propyl) carbodiimide(EDC)95. 85 mg,N-hydroxy succinimide (NHS)57. 5 mg溶解在10 mL DMSO中，超声溶解后，电磁揽拌I小时活化。称取500 mg纯化的壳聚糖，超声溶解后，加入三乙胺200 uL, 30^40 °C电磁搅拌反应72小时。体系旋蒸脱溶，加入80 mL丙酮沉淀，沉淀物用丙酮洗两次。沉淀溶于水中，离心5分钟(1000转/分钟)，将上清液冻干，获得二者偶联产物。第三步氧化石墨烯与上述第二步产物连接称取5 mg氧化石墨烯,分散在10 mL蒸懼水中，加入EDC 95.85 mg, NHS 57.5 mg,超声溶解后，温水浴搅拌I小时活化。在氧化石墨烯溶液中加入120 mg上述第二步产物叶酸与壳聚糖偶联物。超声溶解后，用三乙胺调PH值至8-9，35 1油浴反应4天。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次。偶联产物修饰氧化石墨烯的结构通过热重分析和红外光谱证明。第四步第三步产物进行季铵化反应
将第三步产物超声分散在20 mL蒸馏水中，加入I g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，80°C油浴反应，电磁搅拌反应24小时。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤,反复数次。产物通过激光粒度仪表征Zeta电位为+34. 98 eV。 第五步抗肿瘤药物盐酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的负载和在不同pH条件下的释放性能
将12 mL浓度为O. 5 mg/ml的功能化氧化石墨烯与12 mL浓度O. 84 mg/ml的盐酸阿霉素溶液混合并超声I小时，室温避光揽祥12小时。然后样品在14000转/分钟下尚心，用紫外光谱测定上清液中盐酸阿霉素的浓度。计算药物在多功能单层氧化石墨上的负载量为O. 79 mg/mg。将该载药体系置于透析袋中分别在pH = 5和7. 4的溶液中进行体外释放实验。第六步用荧光素FAM标记的DNA负载在上述功能化氧化石墨烯上，进行体外靶向性检测
将 10 μ L 的 20 μ mo I/L 荧光素 FAM 标记的 DNA (5，-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’ -FAM，上海生工生物工程技术服务有限公司)与25 μ L的O. 5 mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育I小时。用该负载荧光素标记的DNA的功能化氧化石墨烯与人耐药乳腺癌细胞MCF-7/MDR共同孵育30分钟后进行荧光显微镜检测。作为对照，未连接叶酸的功能化氧化石墨烯进行同样操作。第七步功能化氧化石墨烯负载多药耐药小干扰RNA (MDR1 siRNA)后对人耐药乳腺癌细胞的靶基因表达的影响。将浓度为O. 5 mg/ml的功能化氧化石墨烯200 μ L与50 nmol MDRl siRNA( SantaCruz生物技术有限公司)在RPMI 1640基本培养基中室温混合2 h，与人耐药乳腺癌细胞共同孵育转染6小时后换RPMI 1640完全培养基。24小时后消化离心，收集并提取细胞总RNA，通过RT-PCT实验检测多药耐药MDRl mRNA的表达。48小时后消化离心，收集并提取细胞总蛋白，通过Western Blot实验检测P — gp糖蛋白的表达。作为对照,未连接叶酸的功能化氧化石墨烯和转染剂Liposome进行同样操作。(功能化氧化石墨烯负载多药耐药MDRlsiRNA后对人耐药乳腺癌细胞的靶基因表达的影响检测结果见附图7)
第八步不同浓度的功能化氧化石墨烯载药及对抗肿瘤药物和MDRl siRNA共载后对肿瘤细胞的毒性作用。采用WST-I试剂进行不同浓度的功能化氧化石墨烯载药及对抗肿瘤药物和MDRlsiRNA共载后对人耐药乳腺癌细胞MCF-7/MDR的毒性作用表征。取对数生长期细胞以4X IO3个/孔接种于96孔板，每组设3个复孔。将不同浓度的负载盐酸爱霉素前后的氧化石墨烯分别与MCF-7/MDR细胞孵育48小时后，加入10 μ L WST-I试剂进行孵育2小时后，用酶标仪(Promega, GloMaxe-Multi)进行吸光检测。(毒性检测结果见附图8)其中，图7、实施例2中制备的功能化氧化石墨烯载多药耐药MDRl siRNA后对耐药人乳腺癌细胞的靶基因表达的影响。(a :有叶酸连接的功能化氧化石墨烯转染的细胞，终浓度为O. 006 mg/ml ；b :有叶酸连接的功能化氧化石墨烯转染的细胞,终浓度为O. 018 mg/ml ；c :有叶酸连接的功能化氧化石墨烯转染的细胞，终浓度为O. 036 mg/ml ；d :有叶酸连接的功能化氧化石墨烯转染的细胞，终浓度为O. 06 mg/ml ；e liposome转染的细胞；f :功能化氧化石墨烯负载对照siRNA处理的细胞；g :游离MDRl siRNA ；h :未处理的对照细胞。siRNA的终浓度均为100 nM。)上转染24小时后耐药人乳腺癌细胞的MDRl mRNA的表达。下转染48小时后耐药人乳腺癌细胞P — gp糖蛋白的表达。图8、实施例2中合成的功能化氧化石墨烯负载盐酸阿霉素及多药耐药MDRlsiRNA后不同浓度下对耐药人乳腺癌细胞MCF-7/MDR的毒性作用。(Dox :游离的盐酸阿霉素；G0-FAC0+-DOX :有叶酸连接的功能化氧化石墨烯负载盐酸阿霉素后对耐药人乳腺癌细胞MCF-7/MDR的毒性作用；GO-FACO+-Dox-SiRNA :有叶酸连接的功能化氧化石墨烯负载盐酸阿霉素和MDRl siRNA后对耐药人乳腺癌细胞MCF-7/MDR的毒性作用。) 结果表明，功能化的氧化石墨烯负载MDRl siRNA后降低了耐药人乳腺癌细胞MCF-7/MDR相应的MDRl mRNA和P — gp糖蛋白的表达水平。功能化的氧化石墨烯负载盐酸阿霉素及其共载盐酸阿霉素和多药耐药MDRl siRNA后都比单纯使用盐酸阿霉素对耐药人乳腺癌细胞MCF-7/MDR具有更高的毒性作用，说明盐酸阿霉素的pH敏感释放也对逆转肿瘤多药耐药具有一定作用。而在较低浓度下，共载盐酸阿霉素和多药耐药MDRl siRNA的功能化氧化石墨烯比单纯负载盐酸阿霉素的功能化氧化石墨烯具有更好的杀死肿瘤细胞的作用，其IC5tl值比单纯载药的要低；在较高浓度下，二者均能杀死90%以上的肿瘤细胞，因而共载抗肿瘤药物和MDRl siRNA在一定程度上起到了逆转肿瘤多药耐药的作用，能够更好的杀死耐药肿瘤细胞。实施例3
第一步合成氧化石墨烯材料，制备过程可参考(ACSNano，2008，2，463-470);这一步的核心是获得氧化石墨烯材料。类似地，利用其它方法获得氧化石墨烯材料也可采用。第二步叶酸与壳聚糖偶联物的制备
叶酸 109. 4 mg, l-ethyl-3 (3-dimethy amino-propyl) carbodiimide(EDC)95. 85 mg,N-hydroxy succinimide (NHS)57. 5 mg溶解在10 mL DMSO中，超声溶解后，电磁揽拌I小时活化。称取400 mg纯化的壳聚糖，超声溶解后，加入三乙胺200 uL, 30^40 °C电磁搅拌反应72小时。体系旋蒸脱溶，加入80 mL丙酮沉淀，沉淀物用丙酮洗两次。沉淀溶于水中，离心5分钟(1000转/分钟)，将上清液冻干，获得二者偶联产物。第三步氧化石墨烯与上述第二步产物连接
称取6 mg氧化石墨烯,分散在10 mL蒸懼水中，加入EDC 95.85 mg, NHS 57.5 mg,超声溶解后，温水浴搅拌I小时活化。在氧化石墨烯溶液中加入240 mg上述第二步产物叶酸与壳聚糖偶联物。超声溶解后，用三乙胺调PH值至8-9，35 1油浴反应4天。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次。偶联产物修饰氧化石墨烯的结构通过热重分析和红外光谱证明。第四步第三步产物进行季铵化反应
将第三步产物超声分散在20 mL蒸馏水中，加入I g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，80°C油浴反应，电磁搅拌反应24小时。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤,反复数次。产物通过激光粒度仪表征Zeta电位为+31. 25 eV。第五步抗肿瘤药物盐酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的负载和在不同pH条件下的释放性能
将12 mL浓度为O. 5 mg/ml的功能化氧化石墨烯与12 mL浓度O. 84 mg/ml的盐酸阿霉素溶液混合并超声I小时，室温避光揽祥12小时。然后样品在14000转/分钟下尚心，用紫外光谱测定上清液中盐酸阿霉素的浓度。计算药物在多功能单层氧化石墨上的负载量为O. 79 mg/mg。将该载药体系置于透析袋中分别在pH = 5和7. 4的溶液中进行体外释放实验。第六步用荧光素Cy3标记的RNA寡核苷酸(广州市锐博生物科技有限公司)负载在上述功能化氧化石墨烯上，进行体外靶向性检测·
将3 μ L的20 μ mol/LCy3标记的DNA与500 μ L的O. 06 mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育I小时，用该负载Cy3标记的DNA功能化氧化石墨烯与人宫颈癌细胞共同孵育O. 5小时后进行共聚焦荧光显微镜检测，作为对照未连接叶酸的功能化氧化石墨烯进行同样操作。同时用连接叶酸的功能化氧化石墨烯分别对叶酸受体表达较高的Hela细胞和叶酸受体表达较低的A549细胞进行对照。第七步功能化氧化石墨烯负载Bcl-2祀向的siRNA (Bcl-2 targeted siRNA)后对人宫颈癌细胞的靶基因表达的影响。将浓度为O. 5 mg/ml的功能化氧化石墨烯200 μ L与50 nmol Bcl_2 targetedsiRNA (Santa Cruz生物技术有限公司)在RPMI 1640培养基中室温混合2 h，与人宫颈癌细胞共同孵育转染6小时后换RPMI 1640完全培养基。48小时后消化离心，收集并提取细胞总蛋白，通过Western Blot实验检测Bcl_2蛋白的表达。作为对照,未连接叶酸的功能化氧化石墨烯和转染剂Liposome进行同样操作。第八步不同浓度的功能化氧化石墨烯载药前后对肿瘤细胞的毒性作用。采用WST-I试剂进行不同浓度的功能化氧化石墨烯载药前后对人宫颈癌细胞Hela的毒性作用表征。取对数生长期细胞以4X IO3个/孔接种于96孔板，每组设3个复孔。将不同浓度的负载盐酸爱霉素前后的氧化石墨烯分别与Hela细胞孵育48小时后，力口入10 μ L WST-I试剂进行孵育2小时后，用酶标仪(Promega，GloMaxe-Multi )进行吸光检测。实施例4
第一步合成氧化石墨烯材料，制备过程可参考(ACSNano，2008，2，463-470);这一步的核心是获得氧化石墨烯材料。类似地，利用其它方法获得氧化石墨烯材料也可采用。第二步甘草次酸与壳聚糖偶联物的制备
甘草次酸 0. 14g, l-ethyl-3 (3-dimethy amino-propyl) carbodiimide (DCC)O. 12 g,I g纯化的壳聚糖，溶解在10 mL乙醇中超声溶解后，电磁搅拌反应48小时。体系旋蒸脱溶，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，产物浓缩冻干，获得二者偶联产物。第三步氧化石墨烯与上述第二步产物连接
称取5 mg氧化石墨烯，分散在10 mL蒸馏水中，加氢氧化钠调pH值至6-7 JpAEDC
95.85mg, NHS 57.5 mg，超声溶解后，温水浴搅拌40分钟活化。在氧化石墨烯溶液中加入60 mg上述第二步产物。超声溶解后，用三乙胺调pH值至8-9，35 1油浴反应120小时。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次。偶联产物修饰氧化石墨烯的结构通过热重分析和红外光谱证明。第四步第三步产物进行季铵化反应
将第三步产物超声分散在50 mL蒸馏水中，加入400 mg 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，加氢氧化钠调PH值至7-8，80°C油浴回流，电磁搅拌反应24小时。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次。产物通过激光粒度仪表征Zeta电位。第五步抗肿瘤药物盐酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的负载和在不同pH条件下的释放性能 将6 mL浓度为O. 33 mg/ml的功能化氧化石墨烯与12 mL浓度O. 45 mg/ml的盐酸阿霉素溶液混合并超声30分钟，室温避光搅拌12小时。然后样品在14000转/分钟下离心，用紫外光谱测定上清液中盐酸阿霉素的浓度。计算药物在多功能单层氧化石墨上的负载量为O. 477mg/mg。将该载药体系置于透析袋中分别在pH = 5和7. 4的溶液中进行体外释放实验。第六步用绿色荧光蛋白基因(EGFP)负载在上述功能化氧化石墨烯上，进行体外靶向性检测
将I μ L的O. 5 μ g/mL EGFP基因与5 μ L的O. I mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育2小时。用该负载EGFP的功能化氧化石墨烯与人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌Hela细胞分别孵育48小时后进行荧光显微镜检测，观察转染效率。第七步不同浓度的功能化氧化石墨烯载药前后对肿瘤细胞的毒性作用。采用WST-I试剂进行不同浓度的功能化氧化石墨烯载药前后对人肝癌细胞IfepG2的毒性作用表征。取对数生长期细胞以4X IO3个/孔接种于96孔板，每组设3个复孔。将不同浓度的负载盐酸爱霉素前后的氧化石墨烯分别与HepG2细胞孵育48小时后，加入10μ L WST-I试剂进行孵育2小时后，用酶标仪(Promega，GloMax -Multi)进行吸光检测。毒性检测结果见附图6。
权利要求
1.一种基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料，其特征在于它是将靶向分子与可溶性壳聚糖的部分氨基通过酰胺键连接，制备二者偶联物，然后再将其与氧化石墨烯连接，最后利用一个带季铵基团的环氧化合物对其进一步季铵化而制成，利用壳聚糖的季铵化部分通过静电引力负载基因分子；再采用非共价键方法，通过n共轭、氢键、疏水效应作用负载抗肿瘤药物，其中，靶向分子、壳聚糖、氧化石墨烯与带季铵基团的环氧化合物的质量比1 =1-50 0. 2-20 0. 1-100 ;制备方法是在脱水剂存在下，将靶向分子与可溶性壳聚糖在水溶液中搅拌反应，旋蒸，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，产物靶向分子和壳聚糖偶联物浓缩冻干后在脱水剂的存在下与氧化石墨烯超声搅拌反应，分离，洗涤产物，再与带季铵基团的环氧化合物在80°C下超声搅拌反应，反应结束后固体产品经反复离心洗涤，得到带正电荷的功能化氧化石墨烯，分散在水或培养基RPMI 1640中与抗肿瘤药物和基因分子混合，孵育即可；所述的抗肿瘤药物的负载量为0. 05^2. 0 mg/mg ;所述的基因分子的负载量为0. 01 50 Mfliol/g ;所述的靶向分子是指具有肿瘤靶向或肝靶向的各种分子叶酸、乳糖酸、半乳糖苷、甘草次酸或肿瘤细胞靶向的各种抗体和小肽。
2.根据权利要求I所述的载体材料，其特征在于所述的含有季铵基团的环氧化合物指2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(2，3-Epoxypropylttrimethylam monium Chloride)等带有环氧基或季铵基的所有化合物。
3.根据权利要求I所述的载体材料，其特征在于所述的药物是指具有水溶性的各种药物(盐酸)阿霉素及其衍生物类药物、(盐酸)道诺霉素、(盐酸)米托蒽醌、甲氨喋呤、(硫酸)长春碱及其衍生物类药物、(盐酸)羟基喜树碱、(盐酸)阿糖胞苷、5 —氟尿嘧啶等中的一种或两种。
4.根据权利要求I所述的载体材料，其特征在于所述的基因分子是指抑制肿瘤生长的端粒酶反转录酶siRNA、抑制肿瘤细胞多药耐药性的多药耐药siRNA、抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞凋亡的siRNA和具有免疫调节作用的各种siRNA等中的一种或两种，或抑癌基因Pdcd4 (programmed cell death 4)、RECK、转录调节因子Rb、转录调节因子p53、负调控转录因子WT ;或周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI) :pl5、pl6、p21、信号通路的抑制因子ras GTP酶活化蛋白(NF-I)、磷脂酶(PTEN)、DNA修复因子BRCAl、DNA修复因子BRCA2 ；或与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分APC、Axin。
5.根据权利要求I所述的载体材料，其特征在于所述的氧化石墨烯是指分子骨架由六边形晶格排列的单层石墨原子组成，且经过功能化而得到的含有含氧基团的二维平面材料，其厚度分布在0. 3nm到2nm之间，大小分布在IOnm2到400Mm2之间；该功能化氧化石墨烯材料可采用机械剥离法、晶体外延生长法及化学氧化等方法制备；该氧化石墨烯材料能很好的分散到水溶液中。
6.一种权利要求I所述的基于氧化石墨烯的靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料的制备方法，其特征在于包括如下的步骤 1)靶向分子和可溶性壳聚糖偶联物的制备在脱水剂的存在下，将靶向分子和可溶性壳聚糖混溶于水溶液中，室温搅拌一天，体系旋蒸脱溶，浓缩物过葡聚糖凝胶柱以除去小分子杂质，将产物浓缩冻干，获得二者偶联产物； 2)将步骤I)制备的偶联产物修饰在氧化石墨烯上，在脱水剂的存在下，将靶向分子和可溶性壳聚糖偶联物与氧化石墨烯混合超声溶于水中，水浴超声60W，1小时，室温搅拌四天，产物通过反复离心、超声分散，水浴超声60W，2分钟，循环，进行洗涤，除去未反应的偶联物； 3)将步骤2)制备的功能化氧化石墨烯与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵混溶于水溶液中，加氢氧化钠调PH值至7-8，80°C搅拌反应24小时，产物通过反复离心、超声分散，水浴超声60W，2分钟，循环，进行洗涤，除去未反应的2，3-环氧丙基三甲基氯化铵； 所述的靶向分子和可溶性壳聚糖偶联物和脱水剂的质量比为I :1-1000 :0. 1-10。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的氧化石墨烯和步骤I)制备的偶联产物和脱水剂的质量比为I :5-50 :0. 5-5。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的可溶性壳聚糖分子量在1000-10000。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于所述的脱水剂为l-ethyl-3(3_dimethyamino-propyl) carbodiimide (EDC)及其盐酸盐，I, 3-dieyeIohexyIcarbodi-imide(DCC)及其盐酸盐，1，3-diisopropylcarbodi-imide (DIC)及其盐酸盐，I, 3-dihexylcarbodi-imide (DHC)及其盐酸盐,N-hydroxy succinimide (NHS)及其钠盐，N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS)及其钠盐，1-hydroxybenzotriazole hydrate(HOBt)中的一种或多种。
10.权利要求I所述的载体材料用于制备治疗肿瘤的药物。
全文摘要
本发明涉及一种基于氧化石墨烯的靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料及制备和应用。将叶酸、乳糖酸等肿瘤细胞靶向或肝靶向的分子与可溶性壳聚糖的部分氨基通过酰胺键连接制备偶联物，再与氧化石墨烯连接，用带季铵基团的环氧化合物对其季铵化。用壳聚糖的季铵化部分通过静电引力负载基因分子；再用非共价键方法通过π－π共轭、氢键、疏水效应作用负载抗肿瘤药物。利用靶向分子的靶向性以及特定尺寸氧化石墨烯在肿瘤组织的增强渗透滞留效应，同时结合氧化石墨烯对所载药物的pH响应控制释放性能，达到在肿瘤细胞内释放药物，从协同用药出发合成具有肿瘤靶向或肝靶向的抗肿瘤药物和基因共载智能输送体系，为肿瘤的联合治疗提供理论基础和方法依据。
文档编号A61K48/00GK102949727SQ20121053183
公开日2013年3月6日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者杨晓英, 曹秀芬, 王银松, 段宏泉, 陈永胜 申请人:天津医科大学