专利名称：提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体及用途。
背景技术：
肿瘤是当今最常见的发病和死亡原因之一，全世界每年有1000多万新发病例和 620万患者死亡。最新统计资料显示，近二十年来，中国癌症死亡率上升了近百分之三十，每四、五个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。但目前癌症化疗药物由于缺乏靶向性，在杀死癌细胞的同时也导致正常细胞死亡，致使患者全身毒副作用较大。因此发展高效靶向的基因/药物载体在肿瘤治疗中起着至关重要的作用。细胞穿透肽(Cell penetrating ρ印tides)是一类可快速直接穿过细胞膜进入细胞内的多肽，且可以携带多种不同大小和性质的生物活性物质进入细胞，包括小分子物质、 多肽、多肽核酸(ρ印tidenucleo acid, PNA)、蛋白质、DNA、siRNA、纳米颗粒和胶束等，这一性质使其可能成为良好的药物载体。其中，TAT多肽是目前研究较多的一个细胞穿透肽，来
(Transcriptional activator of transcription, TAT)，序列为YGRKKRRQRRR，主要是由碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸组成，带有大量正电荷，并具有良好的亲水性。已有实验证实TATp修饰脂质体可明显提高其体内外转染效率，体外的转染效率可达30% _50%，并且明显减少了单纯脂质体介导转染时的毒性。但是由于TATp 直接穿膜进入细胞而非依赖受体，缺乏组织细胞靶向性。提高肿瘤靶向性治疗的主要策略是针对肿瘤细胞相关抗原(tumor-associated antigens, TAAs)对载体材料进行修饰，使其对肿瘤细胞具有更高的选择性并借此提高肿瘤细胞对基因的摄入。研究发现，黄体生成素释放激素受体(luteinizing hormone-releasing hormone receptor, LHRHR)在肝癌及多数性激素依赖肿瘤如乳腺癌、 卵巢癌和前列腺癌等细胞膜上过量表达，明显高于在相应组织正常细胞膜上的表达，且在正常的肝、肾、脾、心、肺、脑、胸腺和骨骼肌组织的细胞膜上未有可检测到的表达。黄体生成素释放激素(LHRH)是由10个氨基酸组成的短肽(序列EHWSYGLRPG)。已有体外细胞实验证明，LHRH修饰可明显提高所载药物对乳腺癌、卵巢癌细胞的靶向性。鉴于以上讨论的问题，期望提供一种针对肿瘤的强靶向性且高效的载体。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的基因/药物载体靶向性差及转染效率低的难题，提供一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体。本发明的第二个目的是提供一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体的用途。本发明的第三个目的是提供一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体修饰壳聚糖形成的共聚物。
本发明的第四个目的是提供一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体修饰壳聚糖形成的共聚物的用途。本发明的技术方案概述如下一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体，所述多肽载体具有式(I) 的结构TATp-Cys-LHRHp (I)其中TATp为HIV的TAT片段；Cys为半胱氨酸；LHRHp为促黄体生成激素释放激素LHRH的类似物。所述TATp 的氨基酸序列为N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg ；或其反向序列为N 端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg ；所述LHRHp 的氨基酸序列为N 端-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-TyrIer-Trp-His-Glu ；或其反向序列N端-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp(D 型)-Leu-Arg-Gly。所述TATp-Cys-LHRHp 序列为 SEQ ID NO. 1 所示N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-Tyr-Ser-Trp-Hi s-Glu ；或SEQ ID NO. 2 所示=N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp(D 型)-Leu-Arg-Gly ；或SEQ ID NO. 3 所示=N 端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；或SEQ ID NO. 4 所示 N 端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp(D 型)-Leu-Arg-Gly。上述多肽载体的用途。多肽载体修饰壳聚糖形成的共聚物。上述共聚物的用途。与现有技术相比，本发明的优点如下本发明涉及的一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体带有大量的正电荷，具有良好的水溶性另外还具有很强的针对性激素依赖性肿瘤及肝癌的靶向性，可直接携带带负电荷的核酸或药物并介导其进入细胞，也可修饰其它基因或药物载体提高其肿瘤靶向性和转染效率。为基因/药物输送提供了一种新型载体。本发明涉及的两个多肽TATp和LHRHp通过半胱氨酸连接，可将两个多肽分子以Y 状形式定向交联到其它载体，可充分发挥两个多肽分子的功能，并可减少TATp的非特异性副作用，为基因/药物载体的高效靶向修饰提供了一种新颖方法。本发明涉及的一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体对其它载体修饰时，对其它载体表面化学基团没有特殊的要求，因此使用较广。
本发明涉及的多肽TATp-Cys-LHRHp与壳聚糖形成的共聚物可应用于转基因载体和药物制剂(例如载药纳米粒，凝胶)等。
图1多肽载体质谱图谱。图2多肽载体高效液相图谱。图3.多肽修饰壳聚糖共聚物合成路线图。图4.多肽修饰壳聚糖共聚物红外光谱图。其中，实线为壳聚糖，虚线为多肽修饰壳聚糖共聚物。图5.多肽修饰壳聚糖共聚物等电点测定结果。图6.多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子凝胶阻滞结果。图7.多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子原子力显微镜。图8.多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子稳定性结果。其中图8-1多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子kta电位变化情况。图8-2多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子粒径变化情况。图9.多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子载荧光素酶基因pGL3-C0ntr0l纳米粒子对人正常肝细胞L02和肝癌细胞H印G2的转染结果。图10.细胞转染M后倒置荧光显微镜观察结果A多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子载基因纳米粒子转染人正常肝细胞L02 24小时；B多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子转染人肝癌细胞H印G2 24小时；C为Lipofectamine2000转染人正常肝细胞L02 24小时；D 为 Lipofectamine2000 转染人肝癌细胞 HepG2 24 小时。图11细胞转染M小时后流式细胞分析结果。A:多肽修饰壳聚糖共聚物载pEGFP基因纳米粒子转染人正常肝细胞L02 M小时后，流式结果显示0. 06%细胞表达荧光蛋白；B 多肽修饰壳聚糖共聚物载pEGFP基因纳米粒子转染人肝癌细胞H印G2 24小时后，流式结果显示7. 77%细胞表达荧光蛋白；C =Lipofectamine 2000载pEGFP基因纳米粒子转染人正常肝细胞L02 M小时后，流式结果显示2. 7%细胞表达荧光蛋白；D =Lipofectamine 2000载pEGFP基因纳米粒子转染人肝癌细胞H印G2 M小时
后，流式结果显示9.细胞表达荧光蛋白。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明本发明的多肽TATp-Cys-LHRHp由于是通过半胱氨酸将长短相当的两种多肽分子 (TATp和LHRHp)连接形成的双功能肽，通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸n_羟基琥珀酰亚胺酯 (SPDP)等巯基交联剂可将该双功能肽(TATp-Cys-LHRHp)以Y状形式定向交联到其他基因 /药物载体，如壳聚糖，以充分发挥两个多肽(TATp和LHRHp)各自的功能，如LHRHp的肿瘤特异靶向识别作用和TATp携带其它物质进入细胞的功能，并减少TATp引起的非特异性细胞摄入。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1多肽TATp-Cys-LHRHp合成及表征应用多肽合成仪，采用固相多肽合成技术进行多肽合成，所得多肽经质谱分析结果显示其分子离子峰为沈57 (见图1)，与预期的多肽分子量一致，经HPLC分析，其纯度大于 99% (见图2)实施例2TATp-Cys-LHRHp载基因纳米粒子的制备将多肽载体(TATp-Cys-LHRHp)和质粒DNA分别溶于水中制得水溶液，然后分别将两水溶液于37°C水浴10分钟；按N/P(是摩尔比吗？)比为10 1将两溶液快速混勻并漩涡震荡50秒，即得TATp-Cys-LHRHp载基因纳米粒子。纳米粒子的平均粒径约为82nm， zeta电位为26mV。Ν/Ρ可以在2 1 20 1中选择，震荡时间在40 60秒中选择，得到的 TATp-Cys-LHRHp载基因纳米粒子，其平均粒径约为70 90nm，zeta电位在20_40mY。实施例3TATp-Cys-LHRHp载基因纳米粒子的细胞转染实验按照实施例2TATp-Cys-LHRHp载基因纳米粒子的制备方法，制备N/P比10 1的 TATp-Cys-LHRHp载基因纳米粒子，然后将该纳米粒子分别转染人肝癌细胞BEL-7402和人正常肝细胞L02，转染纳米粒子的量以DNA计算为5 μ g DNA/ml，转染M小时后，高内涵活细胞成像结果显示该纳米粒子对肝癌细胞BEL-7402具有较强的靶向性，对其转染效率较高， 而对正常肝细胞L02转染效率则很低。实施例4TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物的制备具体方法包括如下步骤(1)称取分子量为5000-8000的壳聚糖(⑶)溶于水中，制成质量浓度为的水溶液；⑵将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶于二甲基亚砜(DMSO) 中，制成浓度为20mM溶液；(3)按SPDP分子与CS分子上的游离氨基的摩尔比为1 3的比例将所述步骤(1) 获得的溶液和步骤( 获得的溶液混合，室温反应60分钟；(4)用pH = 7. 5含ImM乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液平衡截留分子量5000的脱盐柱，然后以4000xg的离心力离心步骤(3)获得的反应液25分钟，并离心3次以去除游离的SPDP分子；(5)将TATp-Cys-LHRHp多肽溶于去氧双蒸水中，制成质量浓度为1 %的水溶液；所述TATp-Cys-LHRHp多肽的氨基酸序列为N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp(D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；(6)按一定比例(TATp-Cys-LHRHp多肽分子与CS分子上的游离氨基的摩尔比为1 3)将步骤(4)获得的产物与步骤(5)获得的溶液混合，在室温搅拌反应12小时；(7)用pH = 7. 5含ImM乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液平衡第二个截留分子量5000 的脱盐柱，然后以离心力为4000xg离心步骤(6)所得反应液25分钟，并离心3次以纯化产物即获得TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物；将所述TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物冷冻干燥后密封置于-20°C备用。图3所示为TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物的合成示意图。注TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物的合成过程中，反应中分别加入相应量的 SPDP和TATp-Cys-LHRHp分子，以制备不同取代度的TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物。
图4为TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物的红外光谱图，CS的氨基峰在 1658. 07cm"1处，而在TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物中氨基峰明显减小，同时亚氨基峰 1555. 56cm-1峰处明显增强。由图3所示TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物即是通过多肽上的巯基与壳聚糖分子上氨基反应，使得TATp-Cys-LHRHp多肽通过取代氨基上的氢将多肽交联到壳聚糖分子上。因此根据该红外光谱分析结果说明TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物合成成功。实施例5TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物等电点的滴定将TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物配成浓度为0. 5mg/ml的水溶液，用 0. 5N NaOH水溶液和0.05N NaOH水溶液作为滴定剂，采用激光粒度仪通过酸碱自动滴定方法，从初始PH开始滴定至pH值=12，每间隔pH 0.5测定一次zeta电位，最终测得TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物的等电点为11. 3 (如图5所示)，由此推测， TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物在pH值为7左右的水中应带正电荷，理论该共聚物可与带负电荷的DNA或药物通过正负电荷相互作用形成纳米复合体。实施例6TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物载基因纳米复合体的制备将TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物与EGFP-C1质粒DNA按照不同N/P比制备不同纳米粒子。首先将TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物与DNA分别溶于水中，DNA水溶液的浓度为0. 2mg/ml, TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物溶液浓度根据不同N/P比而不同。将两溶液分别置于37°C水浴10分钟，然后将两溶液等体积混合，立即漩涡震荡45-55 秒，即得所需纳米粒子。将所得纳米粒子进行凝胶阻滞实验，由图6显示N/P比为1 1时 TATp-Cys-LHRHp修饰壳聚糖共聚物即可将DNA完全包裹。将所得纳米粒子采用激光粒度仪进行粒径及^ta电位测定，结果如下表和图7所示，多数纳米粒子的粒径在70-85nm之间， 电位在30mV左右，原子力显微镜成像结果显示各纳米粒子呈较规则的圆形。将各纳米粒子置于室温，分别于第1、2、3、7、14天对纳米粒子进行粒径和kta电位测定，以观测纳米粒子的稳定性。图8-1和图8-2所示除N/P比1 4的纳米粒子的粒径和kta电位变化较大， 即稳定性较差外，其它所选配比纳米粒子都相对稳定。表.不同N/P的多肽修饰壳聚糖共聚物载基因纳米粒子的粒径及kta电位
权利要求
1.一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体，其特征是所述多肽载体具有式⑴的结构TATp-Cys-LHRHp(I)其中TATp为HIV的TAT片段；Cys为半胱氨酸；LHRHp为促黄体生成激素释放激素LHRH的类似物。
2.根据权利要求1所述的多肽载体，其特征是所述TATp的氨基酸序列为N端-Arg-Ly s-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg ；或其反向序列为N端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg ；
3.根据权利要求1所述的多肽载体，其特征是所述LHRHp的氨基酸序列为N 端-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；或其反向序列N 端-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp (D 型)-Leu-Arg-Gly0
4.根据权利要求1所述的多肽载体，其特征是所述TATp-Cys-LHRHp序列为SEQID NO. 1所示N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-GIn-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；或SEQ ID NO. 2所示N端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp (D 型)-Leu-Arg-Gly ；或SEQ ID NO. 3所示N端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp(D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；或SEQ ID NO. 4所示N端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-Trp (D 型)-Leu-Arg-Gly。
5.权利要求1-4之一的多肽载体的用途。
6.权利要求1-4之一的多肽载体修饰壳聚糖形成的共聚物。
7.权利要求6的共聚物的用途。
全文摘要
本发明公开了一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体及用途，多肽载体具有式(I)的结构TATp-Cys-LHRHp(I)其中TATp为HIV的TAT片段；Cys为半胱氨酸；LHRHp为促黄体生成激素释放激素LHRH的类似物。本发明的多肽载体带有大量的正电荷，具有良好的水溶性另外还具有很强的针对性激素依赖性肿瘤及肝癌的靶向性，可直接携带带负电荷的核酸或药物并介导其进入细胞，也可修饰其它基因或药物载体提高其肿瘤靶向性和转染效率。为基因/药物输送提供了一种新型载体。
文档编号A61P35/00GK102516395SQ201110435698
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者冷希岗, 刘兰霞, 宋丽萍, 朱敦皖, 董霞 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所