来自脐带血的表达znf281的万能干细胞的分离方法

专利名称：来自脐带血的表达znf281的万能干细胞的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种分离来自脐带血的万能(pluripotent)/多能(multipotent)干细胞的方法，其特征在于在含有纤维粘连蛋白的培养皿中培养从脐带血中分离得到的单核细胞，然后从培养物中收获干细胞，从而分离出来自脐带血的万能/多能干细胞；以及涉及含有来自脐带血的万能/多能干细胞或由其分化的细胞的细胞治疗剂。本发明还涉及一种干细胞的新型培养基，一种干细胞的培养方法，其特征在于，在培养基中培养和增殖干细胞，以及一种以干细胞的悬浮球(sphere)培养或三维培养为特征的提高干细胞的干细胞特性(sternness)的方法。
背景技术：
干细胞的特征在于自我更新、发生分化和处于永生状态，干细胞已被用来解决再生医学和组织替代的问题，它们可被用于治疗各种退化性疾病，以及对细胞生物学提供了深入的洞察。从各种组织中获得的成体干细胞，其吸引力远远超过胚胎干细胞，因为其可源自无限数量的来源的能力，使伦理反对使用人类胚胎细胞作为细胞的来源变得无关紧要。 此外，分离自脐带血的干细胞较其它的成体干细胞有优势之处在于，脐血的供体没有受伤， 不像骨髓或脂肪组织的供体。来自脐带血的间充质干细胞已在体外被成功地引入各种细胞，包括神经细胞、肝细胞、骨细胞等(Sun, W.等人，干细胞，23 :931,2005 ;Hong SH.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. ,30 :1153,2005 ；Hutson EL.等人，组织工程(Tissue Engineering), 11 1407,2005)。还成功报道了来自脐带血的间充质干细胞的体内移植，用于治疗受伤、 糖尿病和心肌梗塞(Nonome，K.等人，Am，生理学杂志-胃肠和肝生理学(J. Wiysiol. Gastrointest. Liver Physiol.), 289 :1091,2005 ；Yoshida, S.等人，干细胞，23:1409， 2005 ；Kim Bo.等人，循环(Circulation)，112 :96，2005)。由于传播传染病的可能性较低以及导致移植物抗宿主病的可能性较低，移植来自脐带血的间充质干细胞已被越来越多地应用到儿童和成人患者(Claudio G. B.等人，医学年评(Annual Review of Medicine), 57 :403,2006)。虽然脐血移植已被接受用于某些疾病的治疗，特别是造血功能缺陷相关疾病(Grewal, SS.等人，血液，103 :1147，2004 ;Knutsen，ΑΡ.等人，儿科杂志(Journal pediatrics), 142 :519, 2003 ；0oi, J.等人，血液，103 :489，2004 ;Sanz GF.等人，Blood， 103 :489,2004)，对于来自脐带血的间充质干细胞的临床应用研究仍然有限。例如，有报道干细胞被成功地用于治愈，不完全地而是部分地治愈脊髓受伤的妇女和患有血栓闭塞性脉管炎疾病(Buerger，s disease)的病人(Kim，SW.等人，干细胞，2006 ；Kang, KS.等人，细胞疗法(Cytotherapy)，7 :368，200 。然而，细胞的发育机制或者它们如何生长和增殖的机制仍然不明。很难从脐带血中分离间充质干细胞。例如，当将用于分离来自骨髓的间充质干细胞的方法应用于脐带血时，分离率保持在20%左右。从分离前5小时采集的肉血(flesh blood)中可分离出多达50%的间充质干细胞。然而，当使用进行分离前超过5小时采集的血液时，分离率降至20%或更低，且尽管分离到细胞，细胞增殖不佳。

发明内容
技术问题为完成本发明，本发明人对来自脐带血的干细胞的分离和大量增殖进行了深入而充分的研究，结果发现，当在纤维粘连蛋白存在下进行培养时，分离自人类脐带血的单核细胞高度增殖，并形成细胞集落，显示出梭形形态，甚至经多次传代后还保持了干细胞的特性。因此，基于这一发现，提供了一种有效分离来自脐带血的非造血万能/多能干细胞和间充质干细胞的方法以及大规模增殖这些干细胞的方法。因此本发明的一个目的是提供一种分离来自脐带血的万能/多能干细胞的方法， 其包括在纤维粘连蛋白存在下培养分离自脐带血的单核细胞并从培养物中收获干细胞。本发明的另一个目的是提供通过该分离方法分离得到的来自脐带血的万能/多能干细胞。本发明的又一个目的是提供一种含有来自脐带血的万能或多能干细胞或由其分化的细胞的细胞治疗剂。本发明的又一个目的是提供一种新型的干细胞培养基。本发明的又一目的是提供一种使用所述培养基培养干细胞的方法。这是一种使用干细胞悬浮球培养或三维培养来提高干细胞的干细胞特性的方法。技术方案按照一个方面，本发明涉及分离来自脐带血的干细胞的方法，其特征在于在含有纤维粘连蛋白的培养皿中培养从脐带血中分离得到的单核细胞，然后从培养物中收获干细胞。在一个实施方案中，从培养物中收获干细胞的步骤包括利用干细胞的免疫特性分离所述干细胞。从脐带血中分离单核细胞，可使用典型的方法来实现。在将脐带血和Hetas印(细胞分离液)混合以去除红细胞后，使用Ficoll-paque (细胞分离液)分离单核细胞。此处， Hetasep优选的用量是每5mL使用0. 5 2mL Hetas印。为了提高从其中分离单核细胞的产量，本发明中使用的脐带血优选是分娩后立即采集的血液、采集后在室温储存12 48小时的血液或采集后在3 5°C储存6 72小时的血液。从来自脐带血的单核细胞中分离干细胞，其特征在于使用纤维粘连蛋白。本文中使用的术语“含有纤维粘连蛋白的培养皿”是指单核细胞可以与纤维粘连蛋白接触到的条件。例如，纤维粘连蛋白可层铺于培养皿上或以悬浮球或三维结构形式包含于培养基中。在本发明的一个实施方案中，当用纤维粘连蛋白涂布培养皿时，纤维粘连蛋白的密度为 0. 1 lmg/mL0本发明中使用的纤维粘连蛋白可源自不受限的动物，优选源自人类。此外，纤维粘连蛋白可由人工合成而制备(例如，化学合成，利用肽合成器合成等)或生物合成(例如， DNA重组技术，成纤维细胞培养等)，或可从动物包括人类的血浆中从细胞外基质中分离得到。纤维粘连蛋白可以是纤维粘连蛋白的片段或肽序列，或可含有所述片段或肽。
当所述单核细胞培养于含有纤维粘连蛋白的培养皿中时，对所采用的培养基没有特别的限制，优选使用SNU-I或EGM-2作为培养单核细胞的基础培养SNU-I培养基包含以下组成(表1)。表 1
SNU-l(mg/l)SNU-l(mg/l)SNU-l(mg/l)CaCl2(无水)200L-异亮氨酸78内消旋肌醇3KCl400L-亮氨酸78核黄素0.15MgS04(无水)97.67L-赖氨酸盐酸盐108.75盐酸噻胺1.5NaCl7635L-蛋氨酸22.5L-丙氨酸17.8NaH2PO4 H2O140L-苯丙氨酸48L-天冬酰胺一水合物30D-葡萄糖1000L-丝氨酸21L-天门冬氨酸26.6酚红10L-苏氨酸72L-谷氨酸29.4丙酮酸钠110L-色氨酸15L-脯氨酸23L-盐酸精氨酸189L-酪氨酸二54尼克酰胺1.5钠盐二水合物L-胱氨酸二盐酸36L-缬氨酸69盐酸吡哆辛1.5L-谷氨酰胺292D-泛酸钙1.5NaHCO31000甘氨酸15氯化胆碱1.5L-组氨酸盐酸盐63叶酸1.5一水合物在本发明中，所述基础培养基优选补加有FGF-B(成纤维细胞生长因子)、抗坏血酸、EGF (表皮生长因子)、氢化可的松、IGF-I (胰岛素样生长因子-1)或VEGF (血管内皮生长因子)和肝素，以及如果需要可选GA-1000 (硫酸庆大霉素、两性霉素B)。更优选地，所述基础培养基补加有20%胎牛血清(FBS)、1 40ng/ml bFGF (成纤维细胞生长因子)、0. 1 5. 0 μ g/ml抗坏血酸、1 40ng/ml EGF (表皮生长因子)、0. 1 1 μ g/ml氢化可的松、1 40ng/ml的IGF-I (胰岛素样生长因子_1)或1 5ng/ml VEGF (血管内皮生长因子)和20 25 μ g/ml肝素，以及如果需要任选地补加GA-1000 (硫酸庆大霉素、两性霉素B)。培养三天后，去除保持悬浮的单核细胞，而仅培养贴壁细胞。在粘附于培养皿的单核细胞中，只有干细胞增殖。分离后12 20天，可观察到干细胞的快速增殖。在本文中，
6优选每两三天更换新鲜的培养基。为了从培养物中获得来自脐带血的万能/多能干细胞，可使用具有分类功能的流式细胞仪的FACS法ant. Immunol.，10 (3) :275，1998)、磁珠法或基于间充质干细胞特异性抗体的淘选法(J. Immunol.，141⑶2797，1998)。为了从大量培养物中获得万能/多能干细胞，可使用特异识别细胞表面表达的分子(以下称“表面抗原”)的抗体单独或结合地固定于其上的柱。流式细胞分选可通过液滴电荷法(electrostatic droplet charging)或细胞捕获法来进行。在任何一种方法中，特异识别表面抗原的抗体被荧光标记，之后测定标记的抗体-抗原结合物的荧光强度并转化为电信号，以测定细胞的抗原表达量。进一步地，可组合使用不同的荧光基团以区分表达不同表面抗原的细胞。荧光基团是FITC(异硫氰酸荧光素)，PE(藻红蛋白)、APC(别藻蓝蛋白)、TR(德克萨斯红)、Cy3、CyChr0me、Red613、 Red670、三色荧光(TRI-Color)和 QuantumRecL在使用流式细胞仪的FACS法中，通过例如离心从培养物中收获的干细胞，可直接用抗体免疫染色，或可在用抗体免疫染色之前在合适的培养基中增值。为了进行免疫染色， 将靶细胞样品与特异识别表面抗原的一抗混合，并在冰上孵育0. 5 1小时。如果所述一抗被荧光基团标记，清洗细胞样品，并用流式细胞仪进行分离。如果所述一抗没有被荧光基团标记，清洗用一抗处理的细胞样品，并与荧光标记的能够结合所述一抗的二抗混合。然后， 将免疫染色的细胞在冰上再孵育0. 5 1小时，并在流式细胞仪分离前进行清洗。根据本发明分离的来自脐带血万能/多能干细胞具有至少一种以下特征(a)对转录因子c-myc和ZNF281显示出阳性免疫特性；(b)粘附于涂覆有胞外基质的表面，并在粘附5 30天后形成梭形或球形的细胞
集落；(c)CPDL(累积群体倍增级)(cumulative population doubling level)为 30 45 ；(d)对⑶14、⑶31、⑶；34、⑶45和HLA-DR显示出阴性免疫特性；(e)具有分化成中胚层、内胚层和外胚层细胞的能力；以及(f)分泌至少一种选自下组的细胞因子或趋化因子TIMP-2、TGF-β、RANTES CINC-3、EOTAXIN (嗜酸粒细胞趋化因子)、GM_CSF、IFN-γ、IL-lb、IL-3、IL-6、IL-8、IL-10、 IL12p40、IL13、IL-16、IP-10、瘦素、MCP-2、MIG、MIP_3a、b-NGFm、sTNFRI 和 PFGF-bb。从干细胞中表达Oct-4、S0X-2、REX-U c-myc和ZNM81的情况来看，本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞仍保持未分化的事实是显而易见的。此外，CPDL(累积群体倍增级)为30 45，本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞是高度增殖的。染色体核型分析表明，本发明的细胞快速增殖，但具有正常的染色体结构。本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞对⑶14、⑶31、⑶34、⑶45和HLA-DR、所有已知为造血干细胞标志(marker)或免疫排斥相关标志，呈免疫阴性。由于缺乏造血或免疫排斥相关标志，本发明的来自脐带血的干细胞可以最小的血管化作用和免疫排斥移植， 从而可以有效地用于异体移植。本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞还可从中胚层分化成肝细胞，从外胚层分化成神经元和视网膜相关细胞，以及从中胚层分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。因此，本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞可以用于治疗多种疾病。此外，本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞可分泌多种细胞因子或趋化因子，包括 TIMP-2、TGF-β、RANTES CINC-3、Ε0ΤΑΧΙΝ、GM-CSF, IFN-γ、IL_lb、IL-3、IL-6、 IL-8、IL-10、IL12p40、IL13、IL-16、IP-10、瘦素、MCP-2、MIG、MIP_3a、b-NGFm、sTNFRI 和 PFGF-bb。具有分泌这些细胞因子或趋化因子能力的本发明来自脐带血的万能/多能干细胞可用于治疗各种疾病。本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞的新性质来自于它们具有这些特点。如上所述，本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞可以分化成各种类型的细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞和神经元，从而其发现在各种相应疾病疗法中的应用。因此，本发明提供了一种含有本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞或由其分化的细胞的细胞治疗剂。本发明的细胞治疗剂可用于治疗各种疾病，例如，包括神经系统疾病(如神经退行性疾病)、骨性关节炎(如退化性关节炎、类风湿关节炎)、骨质流失(如骨质疏松症)、肝脏疾病(如肝硬化)和心血管疾病。优选地，本发明的细胞治疗剂包含至少一种可保护和维持细胞的稀释剂。缓冲液如生理盐水、PBS (磷酸盐缓冲液)、HBSS (汉克斯平衡盐溶液)(Hank' s balanced salt solution)以及血浆或血清成分可以用来作为稀释剂。按照其另一个方面，本发明涉及培养新型干细胞的培养基。所述培养基是基于 EGM-2或SNU-I培养基，并补加有20%胎牛血清(FBS)、1 40ng/ml bTOF (成纤维细胞生长因子)、0. 1 5. 0μ g/ml抗坏血酸、1 40ng/ml EGF (表皮生长因子)，0. 1 1 μ g/ml 氢化可的松、1 40ng/ml的IGF-I (胰岛素样生长因子-1)或1 5ng/ml VEGF(血管内皮生长因子)和20 25 μ g/ml肝素，以及如果需要可选GA-1000 (硫酸庆大霉素、两性霉素 B)。所述培养干细胞的培养基是新型培养基，被应用于分离本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞的方法中。此外，本发明的培养基适用于增殖所有包括来自脐带血的干细胞的成体干细胞，并适用于成体干细胞的培养。按照其又一个方面，本发明涉及一种培养干细胞的方法，包括在本发明的培养基中培养和增殖干细胞。优选地，所述干细胞可以是成体干细胞。在一个实施方案中，本发明的培养干细胞的培养基可用于培养本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞。在本发明的培养基中培养时，本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞可优选在形成梭形细胞集落3 5天后进行传代。优选培养在5% CO2条件下，且可进行5 30天，但本发明不限于这些。按照其又一个方面，本发明涉及一种提高干细胞的干细胞特性的方法，其特征在于使用干细胞的悬浮球培养或三维培养对干细胞进行培养。对于三维培养，优选使用 MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)。此外，干细胞可优选为成体干细胞。本文中所使用的术语“提高干细胞特性”是指形成胚胎干细胞样细胞集落或以较高水平表达转录因子如0ct4、Sox2等。有益效果如上面详述的，当在纤维粘连蛋白存在的条件下进行培养时，本发明的来自人类脐带血的万能/多能干细胞，与传统的成体干细胞相比，可长时间活跃地增殖而不分化。此外，具有分化为各种细胞，如软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞的能力的本发明来自脐带血的万能/多能干细胞可以有效地用于常规疑难杂症，以及神经系统疾病、心血管疾病、骨骼系统疾病的治疗。


图1的照片显示了从人脐带血中分离出单核细胞培养14、15、16、17和18天(分别为A、B、C、D和E)以及细胞经3次传代(F)后形成的细胞集落；图2是累积细胞生长对时间绘制的图；图3显示了来自脐带血的万能/多能干细胞培养了很长一段时期后的核型分析结^ ο图4的流式细胞图显示了本发明来自脐带血的万能/多能干细胞上的各种标志的表达模式。图5显示了采用流式细胞仪测定的本发明来自脐带血的万能/多能干细胞上的各种未分化标志的表达模式及免疫染色(A 表达0ct4细胞的流式细胞图，B 免疫染色的 0ct4图像，C 表达0ct4细胞的核染色图像，D :0ct4表达和核染色的重叠图像)。图6显示了采用FACS分析的经3 9次传代后terra-l、hUCB_MSC、AD_MSC和AM 中ZNM81的表达(上图)，以及hUCB-MSC中ZNM81的表达(下图)。图7显示了通过RT-PCR测定的，所有对于维持未分化必要的ZNM81、0ct4、SOX2、 c-myc和Rex-I在本发明的来自人类脐带血的万能/多能干细胞中的表达。图8的照片显示了来自人类脐带血的万能/多能干细胞分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经元(A 经茜素红S染色后非成骨诱导分化的控制，B 经茜素红S染色后诱导分化的成骨细胞，C 经油红0染色后非成脂诱导分化的控制，D 经油红0染色后诱导分化的脂肪细胞，E 经甲苯胺蓝染色后诱导分化的软骨细胞，F 诱导分化的软骨细胞的颗粒，G 神经细胞分化后具有神经标志Tuj-I和MAP2的免疫染色的细胞。图9显示了通过RT-PCR测定的，经诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞后的来自脐带血的万能/多能干细胞的RNA水平(PPAR-Y和FABP-4是成脂分化的标志，1型胶原蛋白是成骨分化的标志。PPAR-Y 过氧化物酶体增殖物活化的受体Y，FABP-4:脂肪酸结合蛋白 4，GAPDH 3-磷酸甘油醛脱氢酶)。图10显示了在本发明的来自脐带血的万能/多能干细胞中视网膜相关蛋白的表达模。图11显示了通过抗体芯片分析的，来自脐带血的万能/多能干细胞向培养基中分泌的各种细胞因子(A hUCB-MSC 1, B :hUCB-MSC2, C :hUCB_MSC3，D 抗体排布，POS 阳性对照，NEG 阴性对照，GCSF 粒细胞集落刺激因子，GM-CSF 粒细胞单核细胞集落刺激因子，ICAM-I 胞内黏附分子，IFN-y :干扰素-Y，IL:白细胞介素，MCP:单核细胞趋化蛋白， M-CSF 单核细胞集落刺激因子，MIG 干扰素γ诱导的单核因子，MIP 巨噬细胞炎性蛋白， RANTES 调节正常T细胞表达和分泌的因子，TGF-β 转化生长因子- β，TNF 肿瘤坏死因子，sTNFR 可溶性肿瘤坏死因子受体，PDGF-BB 血小板衍生生长因子_BB，TIMP2 金属蛋白酶2组织抑制剂)。
图12和13的照片显示了采用悬浮球培养法的来自脐带血的万能/多能干细胞和 STO细胞的三维培养物，以及通过RT-PCR测定的转录因子0ct4和Sox2的表达模式(12 采用悬浮球培养法的来自脐带血的万能/多能干细胞的三维培养物，图13 基于STO细胞的来自脐带血的万能/多能干细胞的三维培养物)
具体实施例方式可通过下面的实施例来更好地了解本发明，其用于说明目的，但不用来限制本发明。^mm ι : 自■带血白句力育ρ匕 / ^ tp^M ^ mmm,mm μ mm经母亲知情同意，于分娩后立即采集足月脐带血(UCB)样本(n = 20)。将足月脐带血与HetaS印混合(干细胞技术公司，温哥华，BC)以去除红细胞。然后，采用典型的 Ficoll密度梯度离心获得单核细胞。将单核细胞以IX IO5 8个细胞/孔的密度接种于包被有0. lmg/ml lmg/ml纤维粘连蛋白的6孔板中，并保持于补加有含20%胎牛血清的 EGM-2 SingleQuots 的 SNU-1 或 EGM-2 (Lonza)中。所述 SingleQuots 的 EGM-2 包含肝素、 抗坏血酸、重组人表皮生长因子、氢化可的松、血管内皮生长因子、重组人成纤维生长因子、 人胰岛素样生长因子和GA-1000。去除培养3天后仍未贴壁的单核细胞，同时每两三天更换新鲜的培养基。观察到贴壁细胞形成细胞集落，在5% (X)2的条件下培养5 30天后，显示出梭形形态(图1A)。一旦形成集落，细胞集落快速增殖。形成集落后3 7天用0. 125%胰蛋白酶-EDTA悬浮细胞，并转移到新鲜的平皿中继续保持细胞(图1B、1C、1D、1E和1F)。图1的照片显示了细胞的培养进展。如图1所示，随时间的推移，细胞集落逐渐变大。此外，即使传代后，细胞的形态仍保持一致(图1，来自脐带血的万能/多能干细胞的分离和增殖。单核细胞培养14天㈧、15天⑶、16天⑶、17天⑶和18天㈤后，以及经3次传代(F) 后形成的细胞集落。在继续培养细胞的同时，通过测定CPDL (累积群体倍增级)(cumulative population doubling level)来分析分离得到的来自脐带血的万能/多能干细胞增殖的能力(Cristofalo 等人，Proc. Natl. AcacUci.，USA 95，1998)。细胞进行二元分裂繁殖。因此，细胞的生长速度可根据一个细胞分裂成两个细胞所需要的时间，称为倍增时间来确定。 CPDL为10表示一个细胞分裂10次，结果导致一个细胞增殖为约1000个细胞。传统的来自脐带血的干细胞的最大问题之一是，与来自脂肪组织或骨髓的间充质干细胞相比，它们具有显著低的增殖能力。由于临床应用需要大量的干细胞，干细胞的增殖能力是很重要的。 测定如下。首先，从不同的脐带血样本中分离出三种来自脐带血的万能/多能干细胞，并以 2X IO5个细胞的密度接种于100个平皿中，在三到四天定期传代，同时使用细胞计数器对细胞计数。直到细胞停止生长时对细胞进行计数。基于细胞计数，按照下面的数学公式1获得CPDL值。[数学公式1]VN1 = 2X 或[log (Nh) -log (N1) ]/log (2) = X其中，N1表示初始培养基中细胞的数量，Nh表示细胞经传代后饱和状态下的数量。继续保持细胞的同时，计算出CPDL值。hUCB-EPC(来自人脐带血的内皮祖细胞)
10作为对照用于进行比较。结果如图2所示。由图2的表中可见，两个月后hUCB-EPC具有 CPDL约20，而观测到全部三个不同样本的来自脐带血的万能/多能干细胞的CPDL为40 45。这些数值表明，理论上讲细胞可在一个集落中生长达到IO12个细胞的数量。整体来说，具有较强增殖能力的细胞可能发生癌变，出现爆发式增长。一旦发生癌变，细胞可能无视体内的各种调控信号而增殖，因而不能用作细胞治疗剂且与研究目的不一致。因此，必须确定本发明分离得到的来自脐带血的万能/多能干细胞的染色体是否是正常的。在本文中，进行染色体核型分析来检测细胞的染色体。从图3可以看出，甚至经过 10次传代后，发现细胞具有正常的染色体结构。棚列2 : 自·血■育ρ匕/雜〒__耐·析采用流式细胞术来分析悬浮于培养基中的细胞特性。为了确定细胞表面抗原的表型，经3 4次传代后用结合异硫氰酸荧光素(FITC)-或结合藻红蛋白(PE)-的抗体对收获细胞进行染色，并采用FACSAria (Becton Dickinson, NY)进行分析。用来分析本发明分离得到的来自脐带血的万能/多能干细胞(部分万能/多能干细胞)特性的表面抗原包括CDlO (T细胞标志)、CD14 (单核细胞标志)、CD24 (上皮细胞标志)、⑶四(单核细胞标志)、⑶31 (内皮细胞标志)、⑶34 (造血干细胞标志)、⑶44 (间充质干细胞标志)、⑶45 (非造血干细胞标志)、⑶51/61 (破骨细胞标志)、⑶73 (间充质干细胞标志)、⑶90 (间充质干细胞标志)、⑶105 (间充质干细胞标志)、⑶133 (造血干细胞标志)和HLA-DR(免疫排斥相关标志)，并采用流式细胞仪进行分析。结果概括于表2并图示于图4中。表权利要求
1.一种分离来自脐带血的万能或多能干细胞的方法，其包括在含有纤维粘连蛋白的培养皿中培养从脐带血中分离得到的单核细胞，然后从培养物中收获干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中单核细胞的分离是通过将脐带血和Hetasep混合以去除红细胞，然后使用Ficoll-paque。
3.根据权利要求2所述的方法，其中Hetas印与脐带血的混合比例为0.5 2ml 5ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脐带血是分娩后立即采集的脐带血、分娩后在室温储存12 48小时的脐带血或分娩后在3 5°C储存6 72小时的脐带血。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维粘连蛋白层铺于培养皿上或以悬浮球或三维结构形式包含于培养基中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中当培养皿用纤维粘连蛋白涂布时，所含纤维粘连蛋白的密度为0. 1 lmg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维粘连蛋白源自动物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述动物是人类。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维粘连蛋白是人工合成的或生物合成的。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维粘连蛋白是纤维粘连蛋白的片段或肽序列。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述单核细胞培养于补加有20%胎牛血清 (FBS)、1 40ng/ml bFGF、0. 1 5. 0 μ g/ml 抗坏血酸、1 40ng/ml EGF,0. 1 1 μ g/ml 氢化可的松、1 40ng/ml的IGF-I或1 5ng/ml VEGF以及20 25 μ g/ml肝素的EGM-2 或SNU-I培养基中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中从培养物中收获干细胞的步骤包括利用干细胞的免疫特性分离所述干细胞。
13.采用权利要求1所述的方法分离得到的来自脐带血的万能或多能干细胞，其具有至少一种下述特性(a)对转录因子c-myc和ZNM81显示出阳性免疫特性；(b)粘附于涂覆有胞外基质的表面并在粘附5 30天后形成梭形或球形的细胞集落；(c)CPDL (累积群体倍增级)为30 45 ；(d)对⑶14、⑶31、⑶；34、⑶45和HLA-DR显示出阴性免疫特性；(e)具有分化成中胚层、内胚层和外胚层细胞的能力；以及(f)分泌至少一种选自下组的细胞因子或趋化因子TIMP-2、TGF-β、RANTESCINC-3、 EOTAXIN、GM-CSF、IFN- γ、IL_lb、IL-3、IL-6、IL-8、IL-10、IL12p40、IL13、IL-16、IP-10、 瘦素、MCP-2、MIG、MIP-3a、b-NGFm、sTNFRI 和 PFGF-bb。
14.细胞治疗剂，包括权利要求13所述的来自脐带血的万能或多能干细胞或由其分化的细胞。
15.干细胞培养基，包括补加有20%胎牛血清(FBS)、1 40ng/ml bFGF、0. 1 5. 0 μ g/ml 抗坏血酸、1 40ng/ml EGF, 0. 1 1 μ g/ml 氢化可的松、1 40ng/ml 的 IGF-I 或1 5ng/ml VEGF以及20 25 μ g/ml肝素的EGM-2或SNU-1培养基。
16.根据权利要求15所述的培养基，其中所述干细胞是成体干细胞。
17.培养干细胞的方法，其包括使用权利要求15或16所述的培养基。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述干细胞是成体干细胞。
19.提高干细胞的干细胞特性(sternness)的方法，其使用干细胞的悬浮球培养或三维培养。
20.根据权利要求19所述的方法，其中MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)用于所述的三维培养。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述干细胞是成体干细胞。
全文摘要
本发明涉及一种来自脐带血的万能干细胞的分离方法，其特征在于，在含有纤维粘连蛋白的培养皿中培养从脐带血中分离得到的单核细胞，然后从培养物中收获干细胞，从而分离出来自脐带血的万能干细胞，以及涉及一种含有来自脐带血的万能干细胞或由其分化的细胞的细胞治疗剂。此外，本发明涉及干细胞的新型培养基，一种干细胞的培养方法，其特征在于，在培养基中培养和增殖干细胞，以及一种以悬浮球培养或三维培养干细胞为特征的提高干细胞的干细胞特性的方法。
文档编号C12N5/07GK102395673SQ201080016872
公开日2012年3月28日 申请日期2010年3月3日 优先权日2009年3月20日
发明者庐暻焕, 康景宣 申请人:首尔大学校产学协力团