专利名称：产生抗甲基化dna抗体的杂交瘤及其利用的制作方法
产生抗甲基化DNA抗体的杂交瘤及其利用
技术领域：
本发明涉及产生抗甲基化DNA抗体的杂交瘤、由该杂交瘤产生的单克隆抗体、及使用该抗体将甲基化DNA免疫沉降的方法。
背景技术：
在高等真核生物的染色体DNA中，构成DNA的碱基之中胞嘧啶(C)的5位有被甲基化修饰的情况。此高等真核生物中的DNA的甲基化作为遗传信息的表达抑制结构发挥功能。例如，包括多个某基因的启动子区域中常见的CpG序列的区域(也称为“CpG岛”或“CG 岛”)被甲基化时，其基因的转录被抑制。对此，CpG岛不被甲基化时，启动子区域可结合转录因子，因此该基因成可转录的状态。如此，DNA的甲基化是基因表达的控制结构之一。因此，DNA的甲基化在初期胚发生、组织特异性的基因的表达、作为哺乳动物中特征性的现象的基因印迹或X染色体的失活、染色体的稳定化、DNA复制的时机等的各种各样的生理的、病理性的现象中发挥重要的作用。再者近年越来越明了在癌或其他疾病中涉及DNA的甲基化。因此，进行对于基于各种各样的基因的甲基化的解析的癌的确定诊断或预后预测等。作为用于DNA的甲基化解析而回收甲基化DNA的方法之一，知甲基化DNA免疫沉降法(methylation DNA Immunoprecipitaion =MeDIP 法)。在 MeDIP 法中，使用特异性地识别甲基化DNA的抗体或甲基化DNA结合蛋白质将甲基化DNA免疫沉降，可浓缩样品中包括的甲基化DNA。另外知，通过使用将此MeDIP法和微阵列解析技术组合的MeDIP-芯片法， 可一并解析DNA的甲基化状态。可在这样的MeDIP法中使用的抗甲基化DNA抗体，至今有各种的抗体市售，例如， 常使用识别5-甲基胞嘧啶或5-甲基胞苷的抗体。另外，在特开2003-125766号公报(专利文献1)中记载，将5-甲基-2’ -脱氧胞苷作为抗原使用而制备杂交瘤，从此杂交瘤得单克隆抗体，通过使用该抗体的酶联免疫吸附法(ELISA法)可定量5-甲基_2’ -脱氧胞苷。现有技术文献专利文献专利文献1 特开2003-125766号公报
发明内容发明要解决的技术课题
对通过MeDIP法得到的DNA进行甲基化DNA解析时，优选在该MeDIP法中由抗甲基化DNA抗体的甲基化DNA的回收量及浓缩率高。 但是，使用结合能差的抗甲基化DNA抗体对DNA含有量少的样品实施MeDIP法时， 由于无法回收甲基化DNA解析中必要并且充分的量的甲基化DNA，有该解析的灵敏度降低的担忧。另外，使用特异性劣的抗甲基化DNA抗体实施MeDIP法时，由于得到的DNA中的非甲基化DNA含有量变多，有甲基化DNA解析的信赖性降低的担忧。从而，为了通过MeDIP法更提高甲基化DNA的回收量及浓缩率，期望对甲基化DNA 有优良的结合能及特异性的抗甲基化DNA抗体的开发。本发明鉴于如上述一样的事实，旨在提供对甲基化DNA有优良的结合能及特异性的产生抗甲基化DNA抗体的杂交瘤。另外，本发明旨在提供使甲基化DNA的回收量及浓缩率中优良的MeDIP法可能的抗甲基化DNA抗体。再者，本发明旨在提供使用上述的抗甲基化DNA抗体的，甲基化DNA的回收量及浓缩率优良的MeDIP法。解决课题的技术方案本发明人关注于将以下的式(I)化1所示的，5’ -(5-甲基-2’ -脱氧胞苷_3’ -磷酸)-2’ -脱氧鸟苷3’ -磷酸(以下， 也称为“5-甲基-dCpdGp”)作为抗原使用。然后，用包含5-甲基-dCpdGp的抗原免疫动物， 将从该动物得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而制备杂交瘤，发现从此杂交瘤得到有对甲基化DNA优良的结合能及特异性的抗甲基化DNA抗体，从而完成本发明。S卩，根据本发明，提供将从用包含5-甲基-dCpdGp的抗原免疫的动物得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的杂交瘤(以下，也称为“本发明的杂交瘤”)。另外，根据本发明，提供由上述的杂交瘤产生的单克隆抗体、及使用该抗体将甲基化DNA免疫沉降的方法。发明效果由本发明的杂交瘤可得有对甲基化DNA、特别是甲基化CpG序列优良的结合能及特异性的抗甲基化DNA抗体。另外，通过使用得到的抗体进行MeDIP法，相比使用以往的抗甲基化DNA抗体时更可显著地升高甲基化DNA的回收量及浓缩率。
图1是示利用使用本发明的杂交瘤的培养上清及各种市售抗体的MeDIP法回收的甲基化DNA及非甲基化DNA的量的柱状图。图2是示利用使用本发明的杂交瘤的培养上清及各种市售抗体的MeDIP法回收的甲基化DNA的浓缩率的柱状图。图3是示在各反应条件中，利用使用本发明的单克隆抗体及市售抗体的MeDIP 法回收的甲基化DNA及非甲基化DNA的量的柱状图。图4是示在各反应条件中，利用使用本发明的单克隆抗体及市售抗体的MeDIP 法回收的甲基化DNA的浓缩率的柱状图。图5是示利用使用本发明的单克隆抗体及市售抗体的MeDIP法回收的3MeCG及 3MeCT的回收率的柱状图。实施方式“CpG序列”是指碱基序列中的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)从5’向3’的方向以此顺序邻接的序列。同样地，“CpT序列”是指碱基序列中的C和胸腺嘧啶(T)从5’向3’的方向以此顺序邻接的序列。再有，CpG及CpT的“ρ”的文字表示C和G(或者T)之间的磷酸
二酯键。“甲基化CpG序列”表示胞嘧啶的5位被甲基化修饰的CpG序列。知在哺乳类的基因组DNA中，在有CpG序列的部位中胞嘧啶的5位被甲基化修饰。“杂交瘤”是指将淋巴细胞等的抗体产生细胞和骨髓瘤(骨髓肿)细胞人工地融合而得到的杂种细胞，是有抗体产生能的培养可能的细胞。在本说明书中，甲基化DNA的“浓缩率”以通过MeDIP法回收的甲基化DNA的相对于非甲基化DNA的重量比([甲基化DNA的重量值]/[非甲基化DNA的重量值])表示。本发明的杂交瘤是将从用包含5-甲基-dCpdGp的抗原免疫的动物得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的杂交瘤。接下来，对本发明的杂交瘤的制备、由该杂交瘤产生的单克隆抗体的制备及使用该抗体将甲基化DNA免疫沉降的方法进行说明。再有，这些的方法自体均为本领域技术人员周知惯用的技术，制备杂交瘤的方法在例如Hybridoma "Techniques (冷泉港实验室，1980年版)及细胞组织化学(山下修二等， 日本组织细胞化学会编；学际企画、1986年)中记载，将甲基化DNA免疫沉降的方法在例如外因遗传学实验流程(牛岛俊和、真贝洋一等编、羊土公司、2008年)中记载。1.本发明的杂交瘤的制备本发明的杂交瘤可如以下一样制备。再有，一般而言杂交瘤的制备方法包括以下的步骤(1)制备免疫用抗原的步骤、(2)将动物用抗原免疫的步骤、(3)从动物单离抗体产生细胞的步骤、(4)制备与抗体产生细胞的细胞融合中使用的骨髓瘤细胞的步骤、(5)将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而作为杂交瘤的步骤、(6)选择性培养杂交瘤的步骤、(7)筛选产生目的抗体的杂交瘤的步骤、及(8)克隆通过筛选选择的杂交瘤的步骤。接下来，对上述的各步骤进行更详细地说明。(1)抗原的制备在本发明的杂交瘤的制备中，作为免疫用抗原使用包含5-甲基-dCpdGp的抗原。包含5-甲基-dCpdGp的抗原只要是包括作为半抗原至少包含5-甲基-dCpdGp的化合物与在免疫学方法中与该化合物结合而发生免疫原性的适宜的载体分子的缀合物的抗原即可。该抗原再包括佐剂等的辅助剂也可。另外，上述的包含5-甲基-dCpdGp的化合物优选是包含5-甲基-dCpdGp的核酸、 更优选是包含5-甲基-dCpdGp的DNA。为了制备本发明的杂交瘤，优选使用将5-甲基-dCpdGp和载体分子的缀合物溶解或悬浮到适当的缓冲液(例如，磷酸缓冲液等)中，向其中混合弗氏完全佐剂或不完全佐剂、或者明矾等的辅助剂而制备的免疫用抗原。作为上述的载体分子，只要是在免疫学方法中通常使用，结合到半抗原而发生免疫原性的分子即可，可举出例如牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin :BSA)、卵清蛋白 (Ovalbumin :0VA)、匙孔青贝血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin :KLH)。它们之中也优选 KLH。半抗原和载体分子的缀合物而言，一般而言，可举出有使羧基和α -氨基反应的酰胺键的缀合物、使用交联剂而将两者交联结合的缀合物等。得到那样的缀合物的方法而言，可使用碳二亚胺法、戊二醛法、偶氮缩合法、马来酰亚胺苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(MBS) 法等，它们之中也优选MBS法。在使用MBS法时，通过向5-甲基-dCpdGp的鸟苷的磷酸基预先结合具有巯基的接头(例如，碳原子数1 5的烷基巯基)，可将该接头的巯基和KLH的氨基通过MBS交联而
纟口口。(2)由抗原的动物的免疫化由上述的抗原，可免疫选自哺乳类或鸟类的动物。那样的动物只要是可在免疫学方法中通常使用的动物即可，哺乳类而言，可举出例如小鼠、大鼠、猪鼠、兔、牛、马、山羊、 羊、猪、狗、猫等，鸟类而言，可举出例如鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等。它们之中也优选小鼠。将上述的抗原施用到动物的方法是皮下注射、腹腔内注射、静脉注射、皮内注射或肌肉内注射之任何也可，它们之中也优选皮下注射或腹腔内注射。免疫可以1次或适当的间隔、例如1 5周的间隔多次进行。另外，1次的免疫中使用的抗原量根据使用的动物而不同，优选每1只使用1 1000 μ g。再有，为了确认在免疫的动物的体内是否产生针对抗原的抗体，从该动物采集血液，对从该血液分离的血清，通过ELISA法等可评价与抗原的反应性。该反应性不充分时， 也可追加进行上述的免疫。(3)抗体产生细胞的单离从如上述一样免疫的动物的细胞，单离有产生目的抗体的可能性的抗体产生细胞。抗体产生细胞而言，可举出从脾脏、胸腺、淋巴节、末梢血或这些的组合得到的有抗体产生能的细胞，它们之中也优选脾脏细胞或淋巴节B细胞。例如，可在向上述的动物的最终免疫之后，从确认抗体产生的动物摘出脾脏，单离脾脏细胞。
(4)骨髓瘤细胞的制备本发明的杂交瘤的制备中使用的骨髓瘤细胞可从杂交瘤的制备中一般地使用的细胞中适宜选择。那样的骨髓瘤细胞而言，可举出例如小鼠来源的P3U1、X63. 653、Sp2/0、 X63-Ag8,NS-UMPC-Il等，大鼠来源的AG1、AG2、AG3、RCY3、210等。再有，优选抗体产生细胞和骨髓瘤细胞是同种的动物来源。培养上述的骨髓瘤细胞的培养基而言，可选自细胞培养中通常使用的培养基，可举出例如Dulbecco改变Eagle培养基(DMEM)、Iscove改变Dulbecco培养基(IMDM)、向 RPMI-1640等适量添加胎牛血清(FCS)的培养基。(5)抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合细胞融合可通过使用仙台病毒的方法、使用聚乙二醇的方法(PEG法)、通过电处理的方法(电融合法)等而进行。PEG法可根据例如Kohler及Milstein的方法(Nature， 256 =495-497,1975)进行，例如通过使用30 50%聚乙二醇(平均分子量1000 4000) 在30 40°C的温度，将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞混合1 10分钟来进行。另外，电融合法是，例如，向抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的混合液首先通电10 80V的交流电压1 20秒钟而使细胞们接触，接下来通过以10 100 μ秒的脉宽实施1 5kV/cm的高电压直流脉冲来进行。(6)杂交瘤的选择的培养通过细胞融合得到的杂交瘤的选择可通过使用仅杂交瘤可培育的选择培养基进行培养。那样的选择培养基而言，优选使用包括HAT (次黄嘌呤、氨基喋呤及胸腺嘧啶)或 Haz (次黄嘌呤-氮杂丝氨酸)的培养基。例如，使用含有HAT的培养基的杂交瘤的选择培养是在作为骨髓瘤细胞使用 HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)缺损株时有效。即，由于不与抗体产生细胞融合的HGPRT缺损骨髓瘤细胞的增殖被HAT抑制，通过将细胞融合步骤后的细胞群在含有HAT 的培养基中培养，可选择性培养杂交瘤。(7)杂交瘤的筛选为了在如上述一样培养的杂交瘤之中，选择可产生目的抗体的杂交瘤，进行筛选。由于杂交瘤将产生的抗体向细胞外分泌，采集在选择培养基中确认增殖的杂交瘤的培养上清，通过由MeDIP法及ELISA法评价此上清中的本发明的单克隆抗体的有无及抗体存在时的其效价，可筛选杂交瘤。(8)杂交瘤的克隆通过上述的筛选得到产生目的单克隆抗体的杂交瘤之后，进行该杂交瘤的克隆。 克隆的方法而言，可举出例如，稀释至每孔接种1个的细胞的方法(有限稀释法)、在软琼脂糖培养基上接种细胞之后，取得集落的方法、通过显微操作仪取得1个的细胞的方法、通过细胞分选仪分离1个细胞的FACS法等，优选简便的有限稀释法。另外，对于克隆的杂交瘤，再重复进行筛选及克隆，选择抗体的效价更优良的杂交瘤也可。本发明人，根据上述的步骤，在将从用包含5-甲基-dCpdGp的抗原免疫的小鼠得到的脾脏细胞和骨髓瘤细胞P3U1通过电融合法进行细胞融合而得到的杂交瘤克隆之中， 取得产生在MeDIP法及竞争结合抑制试验(ELISA法)中示良好的效价的单克隆抗体的克隆SCRl 7。再有，以下的表1中示在独立行政法人制品评价技术基盘机构(千叶县木更津市上总镰足2-5-8、〒292-0818,日本)中保藏的各克隆的保藏号及保藏年月日。表1
权利要求
1.将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的杂交瘤，所述抗体产生细胞从用包含5’ -(5-甲基_2’ -脱氧胞苷-3’ -磷酸)_2’ -脱氧鸟苷3’ -磷酸的抗原免疫的动物得到。
2.权利要求1所述的杂交瘤，其中所述抗原是含有包含5’-(5-甲基_2’ -脱氧胞苷-3’ -磷酸)_2’ -脱氧鸟苷3’ -磷酸的核酸的抗原。
3.权利要求2所述的杂交瘤，其中所述核酸是DNA。
4.权利要求1所述的杂交瘤，其中所述杂交瘤是以保藏号NITEBP-810号(SCRl)、保藏号 NITE BP-805 号(SCR2)、保藏号 NITEBP-811 号(SCR3)或保藏号 NITE BP-812 号(SCR6) 在独立行政法人制品评价技术基盘机构保藏的杂交瘤。
5.单克隆抗体，其由权利要求1 4之任一项所述的杂交瘤得到。
6.权利要求5所述的单克隆抗体，其中表位是甲基化CpG序列。
7.将甲基化DNA免疫沉降的方法，其包括 使从活体样品提取的DNA成为单链DNA片段的步骤；从单链DNA片段使用权利要求5或6所述的单克隆抗体将甲基化DNA免疫沉降的步骤；以及回收免疫沉降的甲基化DNA的步骤。
全文摘要
本发明涉及将从用包含5′-(5-甲基-2′-脱氧胞苷-3′-磷酸)-2′-脱氧鸟苷3′-磷酸的抗原免疫的动物得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的，产生抗甲基化DNA抗体的杂交瘤。另外，本发明涉及由该杂交瘤产生的单克隆抗体及使用该抗体将甲基化DNA免疫沉降的方法。
文档编号C12N5/0781GK102574927SQ20108004241
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者梶田昌裕, 酒井绫子 申请人:希森美康株式会社