专利名称：生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法
生产1, 4- 丁ニ醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-COA、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法本申请要求2009年10月13日提交的申请号为61/251，287的美国临时申请的优先权，所述美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
背景技术：
本发明一般地涉及生物的硅内(in silico)设计和生物工程，更具体地涉及具有1，4- 丁ニ醇、4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁醛或腐胺生物合成能力的生物。化合物4-羟基丁酸(4-羟基丁酸酷、4-羟基丁酸盐、4-HB)是ー种具有作为各种商品和专用化学品的构成材料的エ业潜力的4碳羧酸。特别是，4-HB有可能成为通向1，4_ 丁ニ醇家族化学品(其包括溶剂、树脂、聚合物前体以及专用化学品)的新入ロ点。1，4_ 丁ニ醇(BDO)是ー种聚合物中间体和エ业溶剂，全球销量约为30亿Ib/年。目前，BDO产自石化 前体，主要是こ炔、马来酸酐以及氧化丙烯。例如，在Reppe合成反应中，こ炔与甲醒的2个分子反应(Kroschwitz和Grant, Encyclopedia of Chem. Tech. , John Wiley 以及Sons, Inc. , New York(1999)),接着是催化氢化作用以形成1，4-丁ニ醇。已做过估算，美国生产的90%こ炔消耗用于丁ニ醇生产。可替换地，丁ニ醇可以通过衍生自丁烷的马来酸酐的酯化作用以及催化氢化作用形成。在下游环节，丁ニ醇可以被进ー步地转换；例如，通过氧化作用转换为Y-丁内酷，其可以被进一步地转化为吡咯烷酮以及N-甲基-吡咯烷酮，或者通过氢解作用转换为四氢呋喃。这些化合物具有多种用途用作聚合物中间体、溶剂和添加剤，其合起来的销售量接近20亿Ib/年。需要开发ー种通过替代手段生产这些化学品的方法，所述替代手段不仅用再生性能源取代以石油为基础的原料，而且采用更少的能源和资本密集型エ艺。能源部已经提出将1，4-ニ酸，尤其是琥珀酸，作为用于制造丁ニ醇家族产品的关键的以生物手段生产的中间体(DOE Report, “Top Value-Added Chemicals from Biomass”，2004)。然而，玻拍酸的分离和纯化成本较高并且催化还原为丁ニ醇需要高温和高压。因此，需要用于有效地生产エ业规模的1，4- 丁ニ醇及其化学前体的替代性手段。本发明满足了这种需要并且还具有相关的优势。发明概述本发明提供包含I，4- 丁ニ醇(BDO)、4-羟基丁醛(4-HBal)、4_羟基丁酰-CoA(4-HBCoA)和/或腐胺途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码以足以生产BD0、4-HBal,4-HBCoA和/或腐胺的量表达的BD0、4_HBal和/或腐胺途径酶的至少ー种外源性核酸。该微生物可以被进一步地优化用于表达BD0、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺。此外，本发明提供利用这类微生物生产BD0、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺的方法。
图I 是显示至 4-轻基丁酸(4-hydroxybutyurate) (4-HB)以及至 1，4_ 丁ニ醇生产的生化途径的示意图。前5个步骤对大肠杆菌来说是内源性，而剩下的步骤可以异源性地表达。催化生物合成反应的酶是(I)琥珀酰-CoA合成酶；(2)非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶；(3) α -酮戊二酸脱氢酶；(4)谷氨酸琥珀酸半醛转氨酶；(5)谷氨酸脱羧酶；(6)依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶；(7) 4-羟基丁酸酯脱氢酶；(8) α -酮戊二酸脱羧酶；(9) 4_羟基丁酰CoA :乙酰基-CoA转移酶；(10) 丁酸激酶；(11)磷酸丁酰转移酶；(12)醛脱氢酶；(13)醇脱氢酶。图2是显示大肠杆菌中高丝氨酸生物合成的示意图。图3显示利用包含表达4-ΗΒ途径基因各种组合的质粒的大肠杆菌菌株在葡萄糖基本培养基中生产4-HB。(a)培养肉汤中的4 -HB浓度；(b)培养肉汤中的琥珀酸浓度；(c)在600nm波长处测得的培养物光密度。簇状条形表示24小时、48小时以及72小时(若有测量)时间点。沿X轴的编码表示所用的菌株/质粒组合。第一个数符指宿主菌株1，MG1655 lacIQ;2,MG1655 AgabD IacI0; 3, MG1655 AgabD AaldA IacI0o 第二个数符指所用的质粒组合1，pZE13-0004-0035 和 pZA33_0036; 2，pZE13-0004-0035 和pZA33-0010n;3，pZE13-0004-0008 和 pZA33-0036;4, pZE13-0004_0008 和 pZA33-0010n;5,对照载体PZE13和pZA33。图4显示在表达来自结核分枝杆菌的α-酮戊二酸脱羧酶的大肠杆菌菌株中从葡萄糖生产4-ΗΒ。菌株1-3包含ρΖΕ13-0032和ρΖΑ33-0036。菌株4仅表达空载体ρΖΕ13和 ρΖΑ33。宿主菌株如下1 和 4，MG1655 IacI0; 2, MG1655 AgabD IacI0; 3, MG1655 AgabDΔ aldA IacI0o条形指24和48小时时的浓度。图5显示重组大肠杆菌菌株中从IOmM 4-HB生产BD0。编号的位置对应采用如下的实验包含表达来自牙龈卟啉单胞菌的cat2的pZA33-0024的MG1655 lacIQ以及在pZE13上表达的如下基因1,无(对照);2, 0002; 3, 0003; 4, 0003η; 5, 0011; 6, 0013; 7, 0023; 8, 0025;9，0008η; 10，0035。基因编码在表6中予以限定。对于每个位置，条形分别指好氧的、微好氧的以及厌氧的条件。微好氧的条件通过密封而非抽空培养管来创造。图6显示通过在补充有4g/L未标记的葡萄糖(a、c、e以及g)、均勻标记的13C-葡萄糖(b、d、f 以及 h)的 M9 基本培养基中培养的 MG16551acIQ pZE13-0004-0035-0002pZA3
3-0034-0036生产的4-HB和BDO的质谱。(a)和(b)，衍生得到的BDO的包含2个碳原子的质量116特征片段；(c)和(d)，衍生得到的BDO的包含I个碳原子的质量177特征片段；(e)和(f)，衍生得到的4-HB的包含2个碳原子的质量117特征片段；(g)和(h)，衍生得到的4-HB的包含4个碳原子的质量233特征片段。图7是用于生产Y-丁内酯的生物工艺的工艺流程示意图。小图(a)显示采用分批分离的补料分批发酵以及小图(b)显示采用连续分离的补料分批发酵。图8A和8B显示多条示例性的1,4-丁二醇(BDO)途径。图8A显示多条从琥珀酰-CoA到BDO的途径。图8B显示多条从α -酮戊二酸到BDO的途径。图9A-9C显示多条示例性的BDO途径。图9Α和9Β显示多条始于4_氨基丁酸的途径。图9C显示一条从乙酰乙酰基-Cok至4-氨基丁酸的途径。图10显示多条示例性的从α -酮戊二酸到BDO的途径。图11显示多条示例性的从谷氨酸到BDO的途径。图12显示多条示例性的从乙酰乙酰基-CoA到BDO的途径。图13显示多条示例性的从高丝氨酸到BDO的途径。
图14显示大肠杆菌琥珀酰-CoA合成酶的核苷酸和氨基酸序列。图14A显示大肠杆菌sucCD操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO:)。图14B (SEQ ID NO:)和14C (SEQ IDNO:)显示由该sue⑶操纵子编码的琥珀酰-Cok合成酶亚基的氨基酸序列。图15显示牛型分支杆菌α -酮戊ニ酸脱羧酶的核苷酸和氨基酸序列。图15Α显示牛型分支杆菌sucA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:)。图15Β显示牛型分支杆菌α-酮戊ニ酸脱羧酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图16显示在大肠杆菌中于厌氧(微好氧的)条件下经由α-酮戊ニ酸在基本培养基中从葡萄糖生物合成4-轻基丁酸盐(4-hydroxybutyrate)。宿主菌株是ECKh_401。基于质粒pZA33上存在的上游途径基因标记实验如下l)4hbd_sucA ；2) sucCD-sucD_4hbd ；3)sucCD-sucD-4hbd_sucA。图17显示在大肠杆菌中经由琥珀酸和α _酮戊ニ酸在基本培养基中从葡萄糖生物合成4-羟基丁酸盐。宿主菌株是野生型MG1655。基于质粒ρΖΕ13和ρΖΑ33上存在的基因标记实验如下1)空对照载体 2)空 pZE13、pZA33-4hbd ;3)pZE13-sucA、pZA33-4hbd。
图18A显示来自牙銀红棕色单胞菌(Porphymonas gingivalis)的依赖CoA的琥拍酸半醛脱氢酶(sucD)的核苷酸序列(SEQ ID NO:)，以及图18B显示编码的氨基酸序列(SEQID NO:)。图19A显示来自牙龈红棕色单胞菌的4-羟基丁酸脱氢酶(4hbd)的核苷酸序列(SEQ ID NO:)，以及图19B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图20A显示来自牙龈红棕色单胞菌的4-羟基丁酸CoA转移酶(cat2)的核苷酸序列(SEQ ID NO:)，以及图20B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图21A显示来自丙酮丁醇梭菌的磷酸丁酰转移酶(ptb)的核苷酸序列(SEQ IDNO:)，以及图21B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图22A显示来自丙酮丁醇梭菌的丁酸激酶(bukl)的核苷酸序列(SEQ ID NO:),以及图22B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图23显示相对于丙酮丁醇梭菌的原生序列，丙酮丁醇梭菌020 (磷酸反丁酰转移酶(phosphtransbutyrylase))的具有改变为更普遍的大肠杆菌密码子的密码子的可选核苷酸序列。图23A-23D (分别是020A-020D的SEQ ID NO:)包含的序列中稀有大肠杆菌密码子被更普遍的密码子替换的数量在増加(A<B<C<D)。图24显示相对于丙酮丁醇梭菌原生序列，丙酮丁醇梭菌021 (丁酸激酶)的具有改变为更普遍的大肠杆菌密码子的密码子的可选核苷酸序列。图24A-24D(分别是021A-021B的SEQ ID NO:)包含的序列中稀有大肠杆菌密码子被更普遍的密码子替换的数量在増加(A<B<C<D)。图25显示具有用于在大肠杆菌中表达的优化密码子的丁酸激酶(BK)和磷酸丁酰转移酶(PTB)的改善表达。图25A显示十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用考马斯蓝染色蛋白质；泳道1，无插入物的对照载体；泳道2，大肠杆菌中丙酮丁醇梭菌原生序列的表达；泳道3，020B-021B密码子优化的PTB-BK的表达；泳道4，020C_021C密码子优化的PTB-BK的表达。BK和PTB的位置被示出。图25B显示与密码子优化的020B-021B(2021B)和020C-021C (2021C)相比，原生丙酮丁醇梭菌序列(2021η)的BK和PTB活性。图26显示在各种表达产BDO的酶的菌株中BDO和Y - 丁酰内酯(GBL)的生产Cat2(034) ；2021n ；2021B ;2021C。图27A 显不原生拜氏梭菌(Clostridium biejerinckii) aid 基因(025η)的核苷酸序列(SEQ ID NO:)，以及图27B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图28A-28D显示拜氏梭菌aid基因(分别是025A-025D的SEQ ID N0S:)的可选基因序列，其中稀有密码子被更普遍密码子替换的数量在增加(A<B<C<D)。图29显示原生拜氏梭菌aid基因和密码子优化的变体的表达；无插入物(无插入物的对照)、025n、025A、025B、025C、02 。图30显示各种菌株中BDO或者BDO和乙醇的生产。图30显示在包含原生拜氏梭菌aid基因(025η)或者包含具有用于在大肠杆菌中表达的优化密码子的变体(025A-02OT)的菌株中的BDO生产。图30Β显示相比于密码子优化的变体025Β，在表达丙酮丁醇梭菌AdhE2酶(002C)的菌株中乙醇和BDO的生产。第三组显示牙龈卟啉单胞菌sucD (035)的表达。在所有的情况下，还表达了牙龈卟啉单胞菌Cat2 (034)。 图31A显示来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌的adhl基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:),以及图31B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图32A显示大肠杆菌中热葡糖苷酶地芽孢杆菌adhl基因的表达。通过SDS-PAGE分析整个细胞裂解液或者上清液以及用考马斯蓝染色无插入物的质粒、具有083(头状地霉N-苄基-3-吡咯烷醇脱氢酶)的质粒和具有084 (热葡糖苷酶地芽孢杆菌adhl)插入物的质粒。图32B显示以丁醛(菱形)或者4-羟基丁醛(正方形)作为底物的084的活性。图33显示在各种菌株中BDO的生产无插入物的质粒；025B、025B_026n ；025B-026A ；025B-026B ；025B-026C ；025B-050 ；025B-052 ；025B-053 ；025B-055 ；025B-057 ；025B-058 ；025B-071 ；025B-083 ；025B-084 ；PTSlac0-025B ;PTSlac0-025B_026n。图34显示载体pRE118_V2的质粒图谱。图35显示包含aceF和IpdA基因的ECKh-138区域的序列。下划线的是肺炎克雷伯氏杆菌IpdA基因，以及划上阴影线的是Glu354Lys突变体中改变的密码子。图36显示原生大肠杆菌IpdA和突变体肺炎克雷伯氏杆菌IpdA的蛋白质序列对比。图37显示在菌株AB3、MG1655 Λ IdhA和ECKh-138中的4_羟基丁酸盐(左侧条形)和BDO (右侧条形)生产。所有的菌株表达了在中拷贝质粒PZA33上的大肠杆菌sue⑶、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd，以及在高拷贝质粒pZE13上的牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2。图38显示融合至pflB_p6启动子和核糖体结合位点(RBS)的aceE基因的5’端的核苷酸序列。5’斜体的序列显示aroP基因的起始，其以相反的方向转录自pdh操纵子。3’斜体的序列显示aceE基因的起始。上面的情况下pflB RBS0下划线部分FNR结合位点。粗体部分pflB-p6启动子序列。图39显示菌株ECKh-456中的aceF_lpdA区域内的核苷酸序列(SEQ ID NO:)。图40显示菌株ECKh-439、ECKh-455和ECKh-456的每个的4-羟基丁酸盐、BDO和丙酮酸的生产(分别是从左到右的条形)。图41A显示用于删除mdh基因的重组位点的简图。图41B显示两侧是来自质粒PKD3的mdh基因的FRT位点和同源区的抗氯霉素基因(CAT)扩增的PCR产品的序列。
图42显示菌株ECKh-401中删除arcA的区域的序列。图43显示菌株ECKh-422的包含突变gltA基因的区域的序列。图44显示野生型gltA基因产品和R163L突变体的柠檬酸合酶活性。在缺乏(菱形)或者存在(正方形)O. 4mM NADH的条件下进行检測。图45显示菌株ECKh-401和ECKh-422 (两者均表达质粒上用于完整的BDO途径的基因)中4-羟基丁酸盐(左侧条形)和BDO (右侧条形)的生产。图46显示来自代谢标记实验的中心代谢通量和关联的95%置信区间。数值是归ー化为lmmol/hr葡萄糖摄入率的摩尔通量。结果表明碳通量按照氧化方向的途径穿过柠檬酸合酶以及大部分碳进入BDO途径而非完成TCA循环。图47显示菌株ECKh-138和ECKh-422 (两者均表达质粒上的完整BDO途径)的细 胞外产品形成。测得的产品是こ酸(Ace)、丙酮酸(Pyr)、4_羟基丁酸盐(4HB)、I，4_ 丁ニ醇(BD0)、こ醇(EtOH)以及其他产品，其包括Y-丁内酯(GBL)、琥珀酸以及乳酸。图48显示由流感嗜血杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(pepck)替换PEP羧化酶(PPC)之后区域的序列。下划线是P印Ck编码区域。图49显示包含50mM NaHCO3的基本培养基中培养的进化的p印CK菌株的生长情况。图50显示表达质粒pZS*13上牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的株ECKh_453内的产品形成。测得的产品是1，4-丁ニ醇(BD0)、丙酮酸、4-羟基丁酸盐(4HB)、こ酸、Y-T内酷(GBL)和こ醇。图51显示两种菌株ECKh-453和ECKh_432的BDO生产。两者均包含表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的质粒pZS*13。在微好氧的条件下培养了培养物，用27或者18计量注射针对器皿穿孔,如所示。图52显示插入包含启动子、sue⑶基因、sucD基因、4hbd基因和终止子序列的多顺反子DNA片段的区域内菌株ECKh-426的基因组DNA的核苷酸序列。图53显示插入包含启动子、sucA基因、克鲁佛氏梭菌4hbd基因和终止子序列的多顺反子序列的区域内菌株ECKh-432的染色体区域的核苷酸序列。图54显示具有编码整合入染色体的基因的上游BDO途径以及包含含有下游BDO途径基因的质粒的ECKh-432菌株中基本培养基内从葡萄糖合成BDO。图55显示包含两侧是与rrnC区域同源的区域的利用非磷酸转移酶(非PTS)蔗糖的基因的PCR产品。图56显示rrnC操纵子中整合位点的示意图。图57显示葡萄糖上培养的菌株ECKh-432和蔗糖上培养的菌株ECKh_463的48小时生长后的平均产品浓度(归ー化为培养物光密度600)。两者均包含表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的质粒pZS*13。数据针对每种菌株的6个拷贝培养物。测得的产品是1，4_ 丁ニ醇(BD0)、4-羟基丁酸盐(4HB)、Y - 丁内酯(GBL)、丙酮酸(PYR)和こ酸(ACE)(分别是左侧到右侧的条形)。图58显示从琥珀酰-Cok和α -酮戊ニ酸到1，4_ 丁ニ醇的示例性途径。縮写Α)琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)，B) α-酮戊ニ酸脱羧酶，C)4-羟基丁酸脱氢酶，D)4_羟基丁酸还原酶，E) I, 4- 丁ニ醇脱氢酶。
图59A显示来自艾瓦诺卡氏菌(GNM 720)的羧酸还原酶的核苷酸序列(SEQ IDNO:)，以及图59B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图60A显示密码子优化的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:)，以及图60B显不编码的氨基酸序列。图61显示质粒pZS*-13S_720721opt的质粒图谱。图62A和62B显示从琥珀酸、琥珀酰-CoA以及α -酮戊二酸到1，4_ 丁二醇的途径。缩写Α)琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)，B) α-酮戊二酸脱羧酶，C)4-羟基丁酸脱氢酶，D) 4-羟基丁酸还原酶，Ε) I, 4- 丁二醇脱氢酶，F)琥珀酸还原酶，G)琥珀酰-Cok转移酶，H)琥珀酰-Cok水解酶，I)琥珀酰-Cok合成酶(或者琥珀酰-Cok连接酶)，J)谷氨酸脱氢酶，K)谷氨酸转氨酶，L)谷氨酸脱羧酶，Μ) 4-氨基丁酸脱氢酶，N) 4-氨基丁酸转氨酶，O) 4-羟基丁酸激酶，P)磷酸转-4-羟基丁酰酶，Q) 4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)，R) 4-羟基丁酰-磷酸还原酶，S)琥珀酰-CoA还原酶(醇形成)，Τ) 4-羟基丁酰-CoA转移酶，U) 4-羟基丁酰-CoA水解酶，V) 4-羟基丁酰-CoA合成酶(或者4-羟基丁酰-CoA连接酶)，W) 4-羟基丁 酰-CoA还原酶(醇形成)，X) α-酮戊二酸还原酶，Y) 5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶，Ζ) 5_羟基-2-氧代戊酸脱羧酶，AA) 5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。图63显示从琥珀酸、琥珀酰-Cok以及α -酮戊二酸到腐胺的途径。缩写Α)琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)，B) α-酮戊二酸脱羧酶，C)4-氨基丁酸还原酶，D)腐胺脱氢酶，Ε)腐胺转氨酶，F)琥珀酸还原酶，G)琥珀酰-CoA转移酶，H)琥珀酰-CoA水解酶，I)琥珀酰-CoA合成酶(或者琥珀酰-CoA连接酶)，J)谷氨酸脱氢酶，K)谷氨酸转氨酶，L)谷氨酸脱羧酶，Μ) 4-氨基丁酸脱氢酶，N) 4-氨基丁酸转氨酶，O) α-酮戊二酸还原酶，P) 5_氨基-2-氧代戊酸脱氢酶，Q) 5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶，R) 5-氨基-2-氧代戊酸脱羧酶，S)鸟氨酸脱氢酶，Τ)鸟氨酸转氨酶，U)鸟氨酸脱羧酶。图64Α显示来自包皮垢分支杆菌me (2) 155 (称为890)的羧酸还原酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:)，以及图64B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图65A显示来自鸟型分枝杆菌亚种类结核K-IO (称为891)的羧酸还原酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:)，以及图65B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。图66A显示来自海洋分支杆菌M (称为892)的羧酸还原酶的核苷酸序列(SEQ IDNO:)，以及图66B显示编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:)。发明详述本发明旨在设计和生产具有4-羟基丁酸(4-HB)、Y - 丁内酯、1，4_ 丁二醇(BDO)、4-羟基丁醛(4-HBal)、4-羟基丁酰-Cok (4-HBCoA)和/或腐胺生物合成生产能力的细胞和生物。本发明具体地涉及通过引入一种或者多种的编码BD0、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺途径酶的核酸设计能够生产BD0、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺的微生物。在一个实施方式中，本发明利用大肠杆菌新陈代谢的硅内化学计量模型确认用于生物合成生产4-羟基丁酸(4-ΗΒ)、1，4- 丁二醇(BDO)、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺的新陈代谢设计。本文所述的结果表明新陈代谢途径可以进行设计和重组工程以实现在大肠杆菌和其他细胞或者生物中4-HBal、4-HBCoA或者4-HB和下游产品(如1，4- 丁二醇或者腐胺)的生物合成。4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0和/或腐胺的，例如针对硅内设计的，生物合成生产可以通过构建具有设计的新陈代谢基因型的菌株来证实。这些经过新陈代谢工程的细胞或者生物还可以经受适应性进化，以进ー步增强4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺的生物合成，包括在接近理论最大增长量的条件下。在某些实施方式中，设计菌株的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺生物合成特征使得他们具有基因稳定性以及在连续的生物エ艺中极为有用。经确认，単独的菌株设计策略将不同的非原生或者异源性反应能力结合进入了大肠杆菌或者其他宿主生物，导致始自非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-Cok合成酶和依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶，或者始自谷氨酸琥珀半醛转氨酶的4-HB和1，4-丁ニ醇生产新陈代谢途径。经确认，硅内新陈代谢设计导致了经由这些新陈代谢途径中的每个在大肠杆菌和酵母菌种两者中4-HB的生物合成。可以通过在pH〈7. 5的条件下，尤其在酸性条件下(如pH 5. 5以下，例如pH〈7、pH<6. 5、pH<6以及尤其pH〈5. 5或者更低)的自发环化作用于培养中生成1，4- 丁ニ醇中间体Y-丁内酷。经由平台的计算组件确认的菌株可以通过导致4-HB、I, 4- 丁ニ醇或者其他中间体和/或下游产品的生物合成生产的任何预测的新陈代谢改变的基因工程来投入实际生产。在仍然进一步的实施方式中，展示这些化合物的生物合成生产的菌株可以进ー步经受 适应性进化以进ー步增强产品生物合成。适应性进化之后产品生物合成收率的水平也可以通过系统的计算组件来预测。在其他特定的实施方式中，微生物被构建为表达编码从琥珀酸至4-HB以及至4-HB-CoA的酶步骤的4-HB生物合成途径。相比于存在4-HB生物合成途径缺陷的宿主微生物，在宿主微生物中琥珀酸辅酶A转移酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、NAD-依赖的4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶的共表达导致了 4-HB的大量生产。在进ー步特定的实施方式中，生成的产4-HB的微生物通过引入编码α -酮戊ニ酸脱羧酶和NAD-依赖的4-羟基丁酸脱氢酶的核酸，利用α -酮戊ニ酸作为底物。在另ー特定的实施方式中，构建的包含1，4- 丁ニ醇(BDO)生物合成途径的微生物当在4-ΗΒ的存在下被培养时生物合成了 BDO。BDO生物合成途径由一种编码多官能醛/醇脱氢酶的核酸或者多种编码醛脱氢酶和醇脱氢酶的核酸組成。为支持4-ΗΒ底物上的生长，这些产BDO的微生物还表达了 4-羟基丁酸CoA转移酶或者4- 丁酸激酶连同磷酸转羟基丁酰酶。在仍然进一歩特定的实施方式中，生成的微生物通过编码官能4-ΗΒ生物合成途径和官能BDO生物合成途径的核酸的外源性表达合成BDO。4-ΗΒ生物合成途径由琥珀酸辅酶A转移酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、NAD-依赖的4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶组成。BDO途径由多官能醛/醇脱氢酶组成。本文进ー步所述的是用于生产BDO的其他途径(见图8-13)。在进ー步的实施方式中，本文所述的是在4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-CoA或者1，4- 丁ニ醇新陈代谢途径起作用的羧酸还原酶的克隆和表达。与酰基-CoA还原酶形成对照，采用羧酸还原酶形成4-羟基丁醛的优势是伴随BDO的生产こ醇和GBL副产品的形成较少。本文还披露了应用羧酸还原酶作为其他众多途径的部分以从三羧酸(TCA)循环代谢产物，例如琥珀酸、琥珀酰-CoA和/或α-酮戊ニ酸生产1，4-丁ニ醇和腐胺。如本文所用，术语“非天然存在的”当关于本发明的微生物使用时，意指该微生物具有至少ー种通常不会在相关物种的天然存在的菌株(包括相关物种的野生型菌株)中发现的基因改变(genetic alteration)。基因改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达的核酸的修饰(modification)、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能中断。这些修饰包括，例如，相关物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和功能片段。其他修饰包括，例如，其中该修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区域。示例性的代谢多肽包括在4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺家族化合物的生物合成途径内的酶或蛋白质。代谢修饰是指从其天然存在的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可以具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的基因修饰。本文披露了示例性的代谢修饰。如本文所用，术语“分离”当关于微生物使用时，意指当相关微生物在自然界中被发现时，基本上不含至少一种组分的生物。该术语包括当在其自然环境中被发现时从部分或全部组分脱离的微生物。该术语还包括当其在非天然存在的环境中被发现时从部分或全部组分脱离的微生物。因此，当分离的微生物在自然界中被发现或者当其在非天然存在的环境中培育、储存或生存时，它部分或全部地从其他物质分离。分离的微生物的具体例子包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。 如本文所用，术语“微生物”意在指任何作为包含在古菌域、细菌域或真核域的显微细胞(microscopic cell)存在的生物。因此,该术语意包括原核或真核细胞或具有显微尺寸的生物并包括所有种类的细菌、古菌和真细菌以及真核微生物(如酵母和真菌)。该术语还包括任何种类的可被培养用于生产生物化学品的细胞培养物。如本文所用，术语“4-羟基丁酸”意在指具有化学式C4H8O3和分子质量104. Hg/mo I (其钠盐126. 09g/mol)的丁酸的4-羟基衍生物。化合物4-羟基丁酸在本领域还作为4-HB、4-羟基丁酸盐、Y-羟基丁酸或者GHB已知。如本文所用，该术语意在包括该化合物的各种任何盐形式以及包括，例如4-羟基丁酸酯和4-羟基丁酸盐。4-HB盐形式的特定实施例包括4-羟基丁酸钠和4-羟基丁酸钾。因此，术语4-羟基丁酸、4-HB、4-羟基丁酸盐、4-羟基丁酸酯、Y-羟基丁酸和GHB以及本领域认可的其他名称在本文中按同义使用。如本文所用，术语“单体”当关于4-HB使用时意在指非聚合或者非衍生形式的4-HB。聚合4-HB的特定实施例包括聚-4-羟基丁酸以及例如，4-HB和3-HB的共聚物。衍生形式的4-HB的特定实施例是4-HB-CoA。其他聚合4-HB形式和其他衍生形式的4-HB也为本领域所知。如本文所用，术语“ Y - 丁内酯”意在指具有化学式C4H6O2和分子质量86. 089g/mol的内酯。化合物Y-丁内酯在本领域中也称为GBL、丁内酯、1,4-内酯、4-丁内酯、4-羟基丁酸内酯以及Y-羟基丁酸内酯。如本文所用，该术语意在包括化合物的各种任何盐形式。如本文所用，术语“1，4- 丁二醇”意在指具有化学式C4HltlO2和分子质量90. 12g/mol、带有两种羟基基团的烷属烃丁烷的乙醇衍生物。化合物1，4-丁二醇在本领域中也被称为BDO以及是本文称为BDO家族化合物的化合物家族的化学中间体或者前体。如本文所用，术语“4-羟基丁醛”意在指具有化学式C4H8O2和分子质量88. 10512g/mol的醒。化合物4-轻基丁醒(4-hydroxybutanal (4-HBal))在本领域中也被称为4_轻基丁醒(4-hydroxybutyraldehyde)。如本文所用，术语“腐胺”意在指具有化学式C4H12N2和分子质量88. 15148g/mol的二胺。化合物腐胺在本领域中也被称为1，4- 丁烷二胺、1，4- 二氨基丁烷、丁烯二胺、四亚甲基ニ胺、四甲基ニ胺以及1，4- 丁烯ニ胺。如本文所用，术语“四氢呋喃”意在指对应于芳香族化合物呋喃的完全氢化的类似物的杂环有机化合物，具有化学式C4H8O和分子质量72. llg/mol。化合物四氢呋喃在本领域中也被称为THF、四氢呋喃、1，4-环氧丁烷、氧化丁烯、氧化环四亚甲基、氧杂环戊烷、ニ氧化ニこ烯、氧戊环、呋喃烷、氢呋喃、氧化四亚甲基。如本文所用，该术语意在包括化合物的各种任何盐形式。如本文所用，术语“CoA”或者“辅酶A”意在指有机辅因子或者辅基(酶的非蛋白质部分)，它的存在为许多酶(脱辅基酶蛋白)的活性所需以形成活性酶系统。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在こ酰基或者其他酰基基团转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其他こ酰基化中起作用。如本文所用，术语“基本上厌氧”当关于培养或培育条件使用时意指氧量少于液体培养基内溶解的氧的饱和量的约10%。该术语还意在包括在小于约1%的氧的气氛中保持的液体或固体培养基的密封室。 本发明的该非天然存在的微生物可以包含稳定的基因改变，这指可以培养超过五代而无改变损失的微生物。一般地，稳定的基因改变包括持续超过10代的修饰，具体地，稳定的修饰将持续超过约25代，以及更具体地，稳定的基因修饰将超过50代，包括永久地。本领域的技术人员会理解所述基因改变(包括本文示例性的代谢修饰)是关于合适的来源或者宿主生物(如大肠杆菌、酵母或者本文披露的其他生物)及其相应的代谢反应或所需的代谢途径的所需的遗传物质(如为其相应的代谢反应编码酶的基因)的合适的来源生物描述的。然而，如果有各种各样的生物的完整的基因组测序和基因组学领域的高水平技能，本领域的技术人员将能够很容易地将本文提供的启示和指导应用于基本上所有的其他生物。例如，本文示例性的大肠杆菌代谢改变可以通过纳入来自非相关物种的物种的相同或类似的编码核酸很容易地应用到其他物种。一般地，这类基因改变包括例如，物种同系物的基因改变，以及具体地，直系同源、旁系同源或非直系同源基因置換。直系同源是通过垂直传递(vertical descent)相关且导致不同的生物内基本上相同或相似的功能的ー种或多种基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶因环氧化物水解的生物功能可以被认为是直系同源。例如，当基因共有足够量的序列相似性以表明它们是同源的或者通过进化自共同的祖先相关时，所述基因通过垂直传递相关。如果基因共有足够量的三维结构但不一定共有序列相似性以表明它们进化自共同的祖先达到基本序列相似性无法识别的程度，也认为它们是直系同源。直系同源的基因可以编码具有约25%到100%氨基酸序列一致性的序列相似性的蛋白质。如果编码共有的氨基酸相似性小于25%的蛋白质的基因其三维结构也显示出相似性，则所述基因也可以被认为通过垂直传递产生。酶类的丝氨酸蛋白酶家族的成员(包括组织型纤维蛋白溶酶原激活剂和弾性蛋白酶)被认为通过垂直传递产生自共同的祖先。直系同源包括通过例如，进化在结构或整体活性方面趋异的基因或其编码基因产物。例如，当一种物种编码显示两种功能的基因产物以及当这类功能在第二个物种内已经分为不同的基因吋，这三个基因及其相应的产物被认为是直系同源。对于生化产品的生产(包括生长偶联生产)，本领域的技术人员会理解含待引入或破坏的代谢活性的直系同源的基因将被选择用于所述非天然存在的微生物的构建。显示各自活性的直系同源的例子是当两个或两个以上物种之间或一个单一物种内部不同的活性已经分为不同的基因产物的情况。具体的例子是弹性蛋白酶蛋白质水解和纤维蛋白溶酶原蛋白质水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)分离为作为纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶的不同分子。第二个例子是支原体5’ -3’核酸外切酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的核酸外切酶和聚合酶其一或两者的直系同源，反之亦然。相反，旁系同源是通过例如，复制然后进化趋异相关的同系物并具有相似或共同的，但不完全相同的功能。旁系同源可以源自例如，相同物种或源自不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源，因为它们代表两种不同的酶类，协同进化自共同的祖先，催化不同的反应并在相同的物种内具有不同的功能。旁系同源是来自彼此具有显著的序列相似性的相同物种的蛋白质，这表明它们是同源的或通过协同进化自共同的祖先而相关。旁系同源蛋白质家族的群体包括HipA同系物、荧光素酶基因、肽酶以及其他。 非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因，可以替代一种不同的物种内有关基因功能。替代包括例如，能够在起源物种内执行与所述不同的物种内所述有关功能相比基本上相同或相似的功能。虽然一般地，非直系同源基因置换可看作是与编码有关功能的已知基因结构相关，不过结构相关性差但功能相似的基因及其相应的基因广物仍然会如本文所用，落入所述术语的含义之内。功能相似性要求例如，与编码试图被替代的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性位点或结合区域具有至少一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如，旁系同源或不相关的基因。因此，识别和构建本发明的具有4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺生物合成能力的非天然存在的微生物时，本领域的技术人员会将本文提供的启示和指导应用于特定的物种并会理解代谢修饰的识别可以包括直系同源的识别和包含或灭活。如果编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的旁系同源和/或非直系同源基因置换存在于参照微生物内，本领域的技术人员还可以利用这些进化上相关的基因。直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换可以通过本领域的技术人员熟知的方法确定。例如，对两种多肽的核酸或氨基酸序列的检验将揭示所比较的序列之间的序列一致性和相似性。基于这种相似性，本领域的技术人员可以确定相似性是否足够高以表明蛋白质是通过进化自共同的祖先而相关的。本领域的技术人员熟知的算法(如Align、BLAST、Clustal W以及其他)比较并确定原始序列相似性或一致性，以及还确定序列内空隙的存在或大小，其可以被赋予权数或得分。这类算法在本领域也已知并同样适用于确定核苷酸序列的相似性或一致性。足够的相似性以确定相关性的参数的计算基于熟知的用于计算统计相似性的方法或在随机多肽中发现相似匹配的几率以及确定的所述匹配的程度。如果需要，两个或两个以上序列的计算机对比还可以由本领域的技术人员进行可视优化。相关的基因产物或蛋白质应该具有高度的相似性，例如，25%到100%的序列一致性。不相关的蛋白质可以具有一致性，所述一致性基本上与预计将发生的几率相同，如果扫描一个具有相当规模的数据库(约5%)。5%到24%之间的序列可代表或不代表足以得出所比较的序列具有相关性的结论的同源性。在给定数据集的大小的情况下，可以进行额外的确定这种匹配的程度的统计分析，以确定这些序列的相关性。用于使用例如，所述BLAST算法确定两个或两个以上序列的相关性的示例性参数可以如下文描述。简言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP版本2. O. 8 (1999年I月5日)以及以下參数执行矩阵OBLOSUM 62 ;空位开放11 ;空位延伸1 ；x_dropoff :50 ;期望值10. O ;序列长度3 ;过滤器开。核酸序列比对可以使用BLASTN版本2. O. 6(1998年9月16日)以及以下參数执行匹配1 ;错配_2 ;空位开放5 ;空位延伸2 ；x_dropoff 50 ;期望值10. O ;序列长度11 ;过滤器关。本领域的技术人员会知道对以上參数作何修改会例如，增加或减少比较的严格性，以及确定两个或两个以上序列的相关性。本文披露了非天然存在的微生物催化剂或者微生物，该微生物催化剂或者微生物包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物，所述途径包括编码4-羟基丁酸酯脱氢酶、非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-Cok合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、谷氨酸琥珀半醛转氨酶、α -酮戊ニ酸脱羧酶或者谷氨酸脱羧酶的至少ー种外源性核酸，其中该外源性核酸以足够的量表达，以生产单体4-羟基丁酸(4-ΗΒ)。4-羟基丁酸酯脱氢酶也被称为4-羟基丁酸脱氢酶或者4-ΗΒ脱氢酶。琥珀酰-Cok合成酶也被称为琥珀酰-Cok合酶或者琥珀酰-CoA连接酶。本文还披露ー种非天然存在的微生物催化剂或者微生物，该微生物催化剂或者微 生物包括具有4-羟基丁酸(4-ΗΒ)生物合成途径的微生物，该途径具有编码4-羟基丁酸酯脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶或者α -酮戊ニ酸脱羧酶的至少一种外源性核酸，其中该外源性核酸以足够的量表达以生产单体4-羟基丁酸(4-ΗΒ)。该非天然存在的微生物催化剂或者微生物可以包括将新陈代谢反应的组合用于生物合成生产本发明的化合物的微生物。生物合成的化合物可以在细胞内产生和/或分泌到培养基内。由该非天然存在的微生物产生的示例性化合物包括例如，4-羟基丁酸、1,4-丁ニ醇和Y-丁内酷。在一个实施方式中，非天然存在的微生物被设计以生产4-ΗΒ。这种化合物是ー个通向1，4-丁ニ醇家族的化合物的有用的入口点。从琥珀酸、通过琥珀酰-CoA从琥珀酸或者从α -酮戊ニ酸形成4-ΗΒ的生物化学反应显示于图I的步骤1-8中。应理解，只要实现从起始组分至BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺产品的转化就可以使用BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺途径的适当酶的任何组合。因此，应理解，本文披露的任何新陈代谢途径可被利用以及本领域的技术人员根据本文的披露能很好地理解如何选择适当的酶以实现所需的途径。在另ー实施方式中，本文披露了ー种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少ー种外源性核酸的1，4- 丁ニ醇(BDO)途径，该BDO途径包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酰-CoA转氨酶或者4-羟基丁酰-CoA脱氢酶(见实施例VII表17)。该BDO途径进一步可以包括
4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1，4- 丁ニ醇脱氢酶。本领域的技术人员应理解，可以利用如本文所披露的途径的各种组合。例如，在非天然存在的微生物中，核酸可以编码4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-Cok水解酶或者
4-氨基丁酸-CoA连接酶；4_氨基丁酰-CoA氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基丁酰-CoA转氨酶；以及4-羟基丁酰-CoA脱氢酶。其他示例性的组合在下文具体描述以及进ー步可以见于图8-13。例如，该BDO途径可以进一歩包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1，4- 丁二醇脱氢酶。本文另外披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括4-氨基丁酸Cok转移酶、4-氨基丁酰-Cok水解酶、4-氨基丁酸-Cok连接酶、4-氨基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4_氨基丁酰-CoA还原酶、4-氨基-I- 丁醇脱氢酶、4-氨基-I- 丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-I- 丁醇转氨酶(见实施例VII和表18)以及可以进一步包括1，4- 丁二醇脱氢酶。例如，该外源性核酸可以编码4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-Cok水解酶或者4-氨基丁酸-Cok连接酶；4-氨基丁酰-Cok还原酶(醇形成)；以及4-氨基-I-丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-I-丁醇转氨酶。此外，该核酸可以编码4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-Cok水解酶或者4-氨基丁酸-Cok连接酶；4_氨基丁酰-Cok还原酶；4_氨基-I- 丁醇脱氢酶；以及4-氨基-I- 丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-I- 丁醇转氨酶。
本文还披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括4-氨基丁酸激酶、4-氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)、4_氨基-I- 丁醇脱氢酶、4-氨基-I-丁醇氧化还原酶(脱氨基)、4_氨基-I-丁醇转氨酶、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸氧化还原酶(脱氨基)、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸转氨酶、4-羟基丁酰-磷酸脱氢酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见实施例VII和表19)。例如，该外源性核酸可以编码4-氨基丁酸激酶；4_氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)-A-氨基-I- 丁醇脱氢酶；和4-氨基-I- 丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-I- 丁醇转氨酶。替代性地，该外源性核酸可以编码4-氨基丁酸激酶；[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸氧化还原酶(脱氨基)或者[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸转氨酶；4_羟基丁酰-磷酸脱氢酶；和4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)。本文另外披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括α -酮戊二酸5-激酶、2，5_ 二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)、2，5_ 二氧代戊酸还原酶、α -酮戊二酸CoA转移酶、α -酮戊二酰基-CoA水解酶、α -酮戊二酰基-CoA连接酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见实施例VIII和表20)。该BDO途径可以进一步包括4-羟基丁酰-Cok还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1，4-丁二醇脱氢酶。例如，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸5-激酶；2，5- 二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)；2，5- 二氧代戊酸还原酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶。替代性地，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸5-激酶；2，5-二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化);2，5- 二氧代戊酸还原酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。替代性地，该外源性核酸可以编码α -酮戊二酸CoA转移酶、α -酮戊二酰基-CoA水解酶或者α -酮戊二酰基-Cok连接酶；α -酮戊二酰基-Cok还原酶、5_羟基_2_氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶。在另一实施方式中，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸CoA转移酶、α -酮戊二酰基-Cok水解酶或者α -酮戊二酰基-Cok连接酶；α -酮戊二酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶和5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。替代性地，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸CoA转移酶、α -酮戊二酰基-CoA水解酶或者α -酮戊ニ酰基-CoA连接酶；α -酮戊ニ酰基-CoA还原酶(醇形成);以及5_羟基_2_氧代戊酸脱羧酶。在仍然另ー实施方式中，该外源性核酸可以编码α-酮戊ニ酸CoA转移酶、α -酮戊ニ酰基-Cok水解酶或者α -酮戊ニ酰基-Cok连接酶；α -酮戊ニ酰基-Cok还原酶(醇形成);以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。本文进ー步披露了ー种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少ー种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶、谷氨酰基-CoA连接酶、谷氨酸
5-激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)、谷氨酰基-Cok还原酶、谷氨酸-5-半醛还原酶、谷氨酰基-CoA还原酶(醇形成)、2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见实施例IX和表21)。例如，该外源性核酸可以编码谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶或者谷氨酰基-CoA连接酶；谷氨酰基-CoA还原酶；谷氨酸-5-半醛还原酶；2_氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸 脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。替代性地，该外源性核酸可以编码谷氨酸
5-激酶；谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)；谷氨酸-5-半醛还原酶；2_氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。在仍然另ー实施方式中，该外源性核酸可以编码谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-Cok水解酶或者谷氨酰基-Cok连接酶；谷氨酰基-Cok还原酶(醇形成);2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。在仍然另ー实施方式中，该外源性核酸可以编码谷氨酸5-激酶；谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)；2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。本文还披露了ー种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少ー种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括3-羟基丁酰-Cok脱氢酶、3-羟基丁酰-Cok脱水酶、こ烯こ酰基-Cok Δ -异构酶或者4-羟基丁酰-Cok脱水酶(见实施例X和表22)。例如，该外源性核酸可以编码3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；3_羟基丁酰-CoA脱水酶；こ烯こ酰基-CoA Δ -异构酶；以及4-羟基丁酸-CoA脱水酶。本文进ー步披露了ー种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少ー种外源性核酸的BDO途径,该BDO途径包括高丝氨酸脱氨酶、高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶、高丝氨酸-Cok连接酶、高丝氨酸-Cok脱氨酶、4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok转移酶、4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok水解酶、4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok连接酶、4-羟基丁 -2-烯酸还原酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok还原酶(见实施例XI和表23)。例如，该外源性核酸可以编码高丝氨酸脱氨酶；4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok转移酶、4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok水解酶、4-羟基丁 -2-烯酰基-CoA连接酶；4_羟基丁 -2-烯酰基-CoA还原酶。替代性地，该外源性核酸可以编码高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶或者高丝氨酸-CoA连接酶；高丝氨酸-CoA脱氨酶；以及4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶。在进ー步的实施方式中，该外源性核酸可以编码高丝氨酸脱氨酶；4_羟基丁 -2-烯酸还原酶；以及4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶或者4-羟基丁酰-CoA连接酶。替代性地，该外源性核酸可以编码高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶或者高丝氨酸-CoA连接酶；高丝氨酸-CoA脱氨酶；以及4-羟基丁 -2-烯酰基-CoA还原酶。本文进ー步披露了ー种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少ー种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括琥珀酰-Cok还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-Cok水解酶、4-羟基丁酰-Cok连接酶、4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表15)。这类BDO途径可以进一歩包括琥珀酰-CoA还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)或者1，4- 丁ニ醇脱氢酶。本文另外披露了ー种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生 物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少ー种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括谷氨酸脱氢酶、4-氨基丁酸氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酸转氨酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酰-Cok水解酶、4-羟基丁酰-Cok连接酶、4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表16)。这类BDO途径可以进一歩包括α-酮戊ニ酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-Cok还原酶(醇形成)或者1，4- 丁ニ醇脱氢酶。上文所述的途径仅仅是示例性的。本领域的技术人员可以根据需要容易地从本文披露的那些途径中选择适当的途径以获得合适的BDO途径或者其他代谢途径。本发明提供允许通过増加所需的产品(如BDO)或者减少不需要的副产品来改善该产品的生产的基因修饰生物。如本文所披露，本发明提供ー种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的1，4-丁ニ醇(BDO)途径。在一个实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性琥珀酰-CoA合成酶(见实施例XII)。例如，该琥珀酰-CoA合成酶可以由大肠杆囷sucCD基因编码。在另ー实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性α-酮戊ニ酸脱羧酶(见实施例XIII)。例如，该α-酮戊ニ酸脱羧酶可以由牛结核分支杆菌sucA基因编码。在仍然另ー实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶以及可选地4-羟基丁酰-CoA/こ酰基-Cok转移酶(见实施例XIII)。例如，该琥珀酸半醛脱氢酶(CoA-依赖的)、4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酰-Coh/こ酰基-CoA转移酶可以由牙龈红棕色单胞菌W83基因编码。在其他实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶(见实施例XIII)。例如，该丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶可以由丙酮丁醇梭菌bukl和ptb基因编码。在仍然另ー实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性4-羟基丁酰-CoA还原酶(见实施例XIII)。例如，该4-羟基丁酰-CoA还原酶可以由拜氏梭菌aid基因编码。另外，在本发明的实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性4-羟基丁醛还原酶(见实施例XIII)。例如，该4-羟基丁醛还原酶可以由热葡糖苷酶地芽孢杆菌adhl基因编码。在另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性丙酮酸脱氢酶亚基(见实施例XIV)。例如，该外源性丙酮酸脱氢酶可以是NADH不敏感的。该丙酮酸脱氢酶亚基可以由肺炎克雷伯氏杆菌IpddA基因编码。在具体的实施方式中，该微生物的丙酮酸脱氢酶亚基基因可以在丙酮酸甲酸裂解酶启动子的控制下。在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以中断编码好氧的呼吸控制调节系统(见实施例XV)的基因。例如，该中断可以是arcA基因的中断。这类生物可以进一步包括中断编码苹果酸脱氢酶的基因。在进一步的实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性NADH不敏感的柠檬酸合酶(见实施例XV)。例如，该NADH不敏感的柠檬酸合酶可以由gltA，如gltA的R163L突变体编码。在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(见实施例XVI)。例如，该磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶可以由流感嗜血杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶基因编码。应理解，如本文所披露的大量基因修饰的任何一种可以单独地或者与本文披露的一种或者多种的基因修饰进行各种组合使用，以增加产BDO的微生物中的BDO生产。在具体的实施方式中，该微生物可以通过基因修饰以纳入任何乃至所有的导致BDO产量增加的 基因修饰。在具体的实施方式中，该包含BDO途径的微生物可以通过基因修饰以表达外源性琥珀酰-CoA合成酶；表达外源性α -酮戊二酸脱羧酶；表达外源性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶以及可选地4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-Cok转移酶；表达外源性丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶；表达外源性4-羟基丁酰-CoA还原酶；以及表达外源性4-羟基丁醛还原酶；表达外源性丙酮酸脱氢酶；中断编码好氧的呼吸控制调节系统的基因；表达外源性NADH不敏感的柠檬酸合酶；以及表达外源磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶。这类用于改善产量的菌株在在实施例XII-XIX中有所描述。因此，应理解，除了上文所述的修饰，这类菌株可以另外包括本文披露的其他修饰。这类修饰包括但不仅限于内源性乳酸脱氢酶(ldhA)、醇脱氢酶(adhE)和/或丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)的删除(见实施例XII-XIX和表28)。另外提供了一种微生物，其中一种或者多种编码外源性表达的酶的基因被整合入宿主生物的fimD位点(见实施例XVII)。例如，一种或者多种编码BDO途径酶的基因可以被整合入该fimD位点，以提高BDO的产量。进一步提供了一种表达提高BDO产量的非磷酸转移酶蔗糖摄取系统的微生物。虽然以包含特定BDO途径酶的微生物作为本文披露的基因修饰的微生物的示例，但是可以应理解，这类修饰可以被纳入任何具有在基因修饰的存在下适于提高产量的BD0、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺途径的微生物。本发明的该微生物因此可以具有本文披露的BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺途径的任何一种。例如，该BDO途径可以包括4-羟基丁酸酯脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、α -酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或者醛/醇脱氢酶(见图I)。替代性地，该BDO途径可以包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-Cok水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA氧化还原酶(脱氨基)、4_氨基丁酰-CoA转氨酶或者4-羟基丁酰-Cok脱氢酶(见表17)。这类BDO途径可以进一步包括4-羟基丁酰-Cok还原酶(醇形成)、4_羟基丁酰-CoA还原酶或者1，4- 丁二醇脱氢酶。另外，该BDO途径可以包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4_氨基丁酰-Cok水解酶、
4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4_氨基丁酰-CoA还原酶、4-氨基-I- 丁醇脱氢酶、4-氨基-I- 丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-I- 丁醇转氨酶(见表18)。此外，该BDO途径可以包括4-氨基丁酸激酶、4-氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)、4-氨基-I- 丁醇脱氢酶、4-氨基-I- 丁醇氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基-I- 丁醇转氨酶、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸氧化还原酶(脱氨基)、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸转氨酶、4-羟基丁酰-磷酸脱氢酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表19)。这类途径可以进ー步包括1，4-丁ニ醇脱氢酶。该BDO途径可以还包括α -酮戊ニ酸5_激酶、2，5_ ニ氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)、2，5-ニ氧代戊酸还原酶、α -酮戊ニ酸CoA转移酶、α -酮戊ニ酰基-CoA水解酶、α -酮戊ニ酰基-CoA连接酶、α-酮戊ニ酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶、α-酮戊ニ酰基-CoA还原酶(醇形成)、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见表20)。这类BDO途径可以进一歩包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1，4- 丁ニ醇脱氢酶。另外，该BDO途径可以包括谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶、谷氨酰基-CoA连接酶、谷氨酸5-激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)、谷氨酰基-Cok还原酶、谷氨酸-5-半醛还原酶、谷氨酰基-Cok还原酶(醇形成)、2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶、5-羟基-2-氧 代戊酸脱羧酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见表21)。这类BDO途径可以进一歩包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1，4- 丁ニ醇脱氢酶。另外，该BDO途径可以包括3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3_羟基丁酰-CoA脱水酶、乙烯こ酰基-CoAA-异构酶或者4-羟基丁酰-Cok脱水酶(见表22)。此外，该BDO途径可以包括高丝氨酸脱氨酶、高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶、高丝氨酸-CoA连接酶、高丝氨酸-Cok脱氨酶、4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok转移酶、4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok水解酶、4-羟基丁 -2-烯酰基-Cok连接酶、4-羟基丁 -2-烯酸还原酶、4-羟基丁酰-Cok转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁 -2-烯酰基-CoA还原酶(见表23)。这类BDO途径可以进一歩包括4-羟基丁酰-Cok还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1，4- 丁ニ醇脱氢酶。该BDO途径可以另外包括琥珀酰-Cok还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-Cok水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表15)。这类途径可以进ー步包括琥珀酰-CoA还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)或者1，4-丁ニ醇脱氢酶。此外，该BDO途径可以包括谷氨酸脱氢酶、4-氨基丁酸氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酸转氨酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表16)。这类BDO途径可以进一歩包括α-酮戊ニ酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-Cok转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)或者1，4- 丁ニ醇脱氢酶。本发明另外提供了ー种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少ー种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)-A-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(见图58，步骤A-C-D)。本发明还提供ー种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括α -酮戊二酸脱羧酶；
4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(图58，步骤B-C-D)。本发明进一步提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括琥珀酸还原酶；4_羟基丁酸脱氢酶，以及4-羟基丁酸还原酶(见图62，步骤F-C-D)。在仍然另一实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括α -酮戊二酸脱羧酶；或者谷氨酸脱氢酶或谷氨酸转氨酶和谷氨酸脱羧酶和4-氨基丁酸脱氢酶或4-氨基丁酸转氨酶；4_羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(见图62，步骤B或者((J或者K) -L- (Μ 或者 N)) -C-D)。
本发明还提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括α -酮戊二酸还原酶；5_羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及
5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶(见图62，步骤Χ-Υ-Ζ)。在仍然另一实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁酰-CoA的4-羟基丁酰-CoA途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁酰-CoA途径，该4-羟基丁酰-CoA途径包括α -酮戊二酸还原酶；5_羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5_羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见图62，步骤Χ-Υ-ΑΑ)。本发明另外提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括琥珀酸还原酶；4_氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4_氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤F-M/N-C-D/E)。在仍然另一实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括α -酮戊二酸脱羧酶；4_氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4_氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤B-M/N-C-D/E)。本发明另外提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶；谷氨酸脱羧酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤J/K-L-C-D/E)。本发明在另一实施方式中提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括α -酮戊二酸还原酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱羧酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤0-P/Q-R-D/E)。还提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括α -酮戊二酸还原酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；鸟氨酸脱氢酶或者鸟氨酸转氨酶；以及鸟氨酸脱羧酶(见图63，步骤0-P/Q-S/T-U)。
在其他的实施方式中，本发明提供ー种具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的非天然存在的微生物，其中该非天然存在的微生物包括编码转化本文披露的任何途径的底物的酶或者蛋白质的至少ー种外源性核酸(见例如，实施例和图1、8-13、58、62和63)。在示例性的用于生产BDO的实施方式中，该微生物可以进行选自如下的底物到产品的转化琥珀酸到琥珀酰-CoA ;琥珀酰-CoA到琥珀半醛；琥珀半醛到4-羟基丁酸盐；4_羟基丁酸盐到4-羟基丁酰-磷酸；4_羟基丁酰-磷酸到4-羟基丁酰-CoA ；4-羟基丁酰-CoA到4-羟基丁醛；以及4-羟基丁醛到1，4-丁ニ醇。在用于生产4-HBal的途径中，微生物可以转化例如，琥珀酸到琥珀半醛；琥珀半醛到4-羟基丁酸盐；以及4-羟基丁酸盐到4-羟基丁醛。这类生物可以另外包括转化4-羟基丁醛到1，4-丁ニ醇的活性以生产BD0。仍然另一用于生产4-HBal的途径可以是例如，α -酮戊ニ酸到琥珀半醛；琥珀半醛到4_羟基丁酸盐；以及4-羟基丁酸盐到4-羟基丁醛。用于生产4-HBal的可选途径可以是例如，α -酮戊ニ酸到2，5- ニ氧代戊酸；2，5- ニ氧代戊酸到5-羟基-2-氧代戊酸；以及5-羟基-2-氧代戊酸到4-羟基丁醛。示例性的4-羟基丁酰-CoA途径可以是例如，α -酮戊ニ酸到2，5_ ニ氧代戊酸；2，5- ニ氧代戊酸到5-羟基-2-氧代戊酸；以及5-羟基-2-氧代戊酸到4-羟基丁酰-CoA。示例性的腐胺途径可以是例如，琥珀酸到琥珀酰-Cok ;琥珀酰-Cok到琥珀半醛；琥珀半醛到4-氨基丁酸；4_氨基丁酸到4-氨基丁醛；以及4-氨基丁醛到腐胺。可选 的腐胺途径可以是例如，琥珀酸到琥珀半醛；琥珀半醛到4-氨基丁酸；4_氨基丁酸到4-氨基丁醛；以及4-氨基丁醛到腐胺。本领域的技术人员会理解这些仅仅是示例性以及基于本文的启示，本领域的技术人员可以容易地确定本文披露的任何适于生产所需产品以及具有转化所需的适当活性的底物-产品对。因此，本发明提供ー种包含编码酶或者蛋白质的至少ー种外源性核酸的非天然存在的微生物，其中该酶或者蛋白质转化途径的底物以及产品(见图 1、8-13、58、62 和 63)。虽然本文中一般地描述了ー种包含4-HB、4-HBal、4_HBCoA、BDO或者腐胺途径的微生物，但是可以理解的是，本发明另外提供了ー种非天然存在的微生物，该微生物包括编码以足够的量表达以生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺通路的中间体的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺途径酶或者蛋白质的至少ー种外源性核酸。例如，如本文所披露，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0和腐胺途径的示例见图1、8_13、58、62和63。因此，除了包含例如，生产BDO的BDO途径的微生物，本发明另外提供ー种包括编码BDO途径酶的至少ー种外源性核酸的非天然存在的微生物，其中该微生物将BDO途径中间体作为产品而非途径的中间体来生产。例如，在一个如图62所示的示例性的实施方式中，本发明提供一种将琥珀酰-CoA、琥珀半醛、4-羟基丁酸盐、4-羟基丁酰-磷酸、4-羟基丁酰-CoA或者4-羟基丁醛作为产品而非中间体来生产的微生物。另ー示例性的实施方式包括例如，将α-酮戊ニ酸、2，5-ニ氧代戊酸、5-羟基-2-氧代戊酸或者4-羟基丁醛作为产品而非中间体来生产的微生物。腐胺途径中的示例性实施方式包括例如，将谷氨酸、4-氨基丁酸或者4-氨基丁醛作为产品而非中间体来生产的微生物。腐胺途径中的可选实施方式可以是例如，将2，5-ニ氧代戊酸、5-氨基-2-氧代戊酸或者鸟氨酸作为产品而非中间体来生产的微生物。应理解，本文披露的任何途径，如实施例中所述的以及附图中示范的途径(包括图1、8-13、58、62和63的途径)，可用以生成一种根据需要生产任何途径中间体或者产品的非天然存在的微生物。如本文所披露，这类生产中间体的微生物可以与另一种表达下游途径酶的微生物组合使用，以生产所需的产品。然而，应理解，生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中间体的非天然存在的微生物可用以将该中间体作为所需的产品来生产。本文一般地参照代谢反应、反应物或其产物，或者具体地参照一种或多种编码酶(所述酶与所参照的代谢反应、反应物或产物有关或者催化所参照的代谢反应、反应物或产物)的核酸或基因对本发明进行描述。除非本文另有明确规定，本领域的技术人员会理解对反应的参照也构成了对所述反应的反应物以及产物的参照。同样，除非本文另有明确规定，对反应物或产物的参照也是对反应的参照，以及对任何这些代谢组分的参照也是参照一种或者多种的编码催化所参照的反应、反应物或产物的酶的基因。同样地，考虑到熟知的代谢生物化学、酶学和基因组学领域，本文对基因或编码核酸的参照也构成对相应的被编码的酶和其催化的反应以及反应的反应物和产物的参照。利用本发明所述的微生物经由生物合成模式生产4-HB是尤其有用的，因为这可以生产出单体4-HB。本发明所述的非天然存在的微生物及其生物合成4-HB和BDO家族化合物也是尤其有用的，因为该4-HB产品(I)可以是分泌的；(2)可以没有任何衍生作用(如 辅酶A) ； (3)避免生物合成期间的热力学转化；(4)允许BDO的直接生物合成，以及(5)使得酸性PH培养基中4-HB到Y-丁内酯(GBL)的自发化学转化成为可能。后面的这种特征对于例如，BDO家族化合物(如1，4- 丁二醇和/或四氢呋喃(THF))的高效的化学合成或者生物合成也是尤其有用的。微生物普遍缺乏合成4-HB的能力，因此本文披露的任何所述化合物都在1，4- 丁二醇家族化合物的范围内或者为本领域的那些人员所知落在1，4- 丁二醇家族化合物的范围内。此外，并非已知的是，具有所有的所述必要的新陈代谢酶催能力的生物从本文所述的酶和示范的生化途径生产4-HB。相反，也许除了下文进一步描述的少许厌氧微生物之外，具有酶催能力的微生物利用4-HB作为底物以生产例如，琥珀酸。相比之下，本发明所述的非天然存在的微生物可以将4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0和/或腐胺作为产品来生成。如上文所述，以其单体形成生物合成4-HB不仅在BDO家族化合物的化学合成中尤其有用，它还使得BDO家族化合物的进一步生物合成成为可能并且完全避免了化学合成程序。通过确保宿主微生物包含用于本发明的至少一种4-HB、4-HBal、4_HBCoA、BDO和/或腐胺生物合成途径的完整的生化合成的官能，来生产可以生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺的本发明所述的非天然存在的微生物。确保至少一种必要的4-HB、4-HBal、4-HBCoA或者BDO生物合成途径赋予该宿主微生物4-HB生物合成能力。为了在图I进行说明，本文示范并示出了数条4-HB生物合成途径。其他4-HB和BDO途径的描述见图8-13。一种4-HB生物合成途径包括从琥珀酸到4-HB的生物合成(琥珀酸途径)。参与这种4-HB途径的酶包括非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶。在这种途径中，非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶按图I中所示的箭头催化逆反应。另一种4-HB生物合成途径包括通过琥珀酰-Cok始自琥珀酸的生物合成(琥珀酰-Cok途径)。参与这种4-HB途径的酶包括琥珀酰-Cok合成酶、依赖Cok的琥珀半醛脱氢酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶。三种其他的4-HB生物合成途径包括从α -酮戊二酸到4-ΗΒ的生物合成(α -酮戊二酸途径)。因此，第三种4-ΗΒ生物合成途径是通过谷氨酸琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶的琥珀半醛的生物合成。第四种4-ΗΒ生物合成途径也包括从α-酮戊二酸到4-ΗΒ的生物合成，但是利用α-酮戊二酸脱羧酶催化琥珀半醛的合成。4-羟基丁酸酯脱氢酶催化琥珀半醛到4-HB的转化。第五种4-HB生物合成途径包括通过琥珀酰-CoA始自α-酮戊二酸的生物合成以及利用α-酮戊二酸脱氢酶生产琥珀酰-CoA，该琥珀酰-CoA通过漏斗进入上文所述的琥珀酰-CoA途径。这些4-HB生物合成途径、它们的底物、反应物和产物的每种于下文在实施例中进一步描述。如本文所述，可以通过包含适于生产BDO的酶以生物合成方式将4-HB进一步转化为BDO (见实施例)。因此，应理解，4-HB途径可以与用于将4-HB转化为BDO以生成BDO途径的酶一起使用。本发明所述的非天然存在的微生物可以通过引入可表达的核酸来生产，该核酸编码一种或者多种的参与一种或者多种的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径的酶。根据选定用于生物合成的宿主微生物，可以表达用于部分或者全部的具体4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺生物合成途径的核酸。例如，如果在所需的生物合成途径(例如，该琥珀酸到4-HB途径)中，选定的宿主存在一种或者多种的酶的缺陷，则将用于缺陷的一种或者多种的酶(例如，在这个例子中是非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶两种)的可表达的核酸引入该宿主用于后续的外源性表达。替代性地，如果该选定的宿主显示出一些途径酶的内源性表达，但是在其他方面存在缺陷，则需要用于缺陷的一种 或者多种的酶的编码核酸，以实现4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺的生物合成。例如，如果该选定的宿主显示出内源性的非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶，但是存在4-羟基丁酸酯脱氢酶的缺陷，则需要用于这种酶的编码核酸，以实现4-HB的生物合成。因此，可以通过引入外源酶或者蛋白质活性以获得所需的生物合成途径来生产本发明的非天然存在的微生物或者可以通过引入一种或者多种的与一种或者多种内源性的酶或者蛋白质一起生产所需的产品(如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺)的外源酶或者蛋白质活性以获得所需的生物合成途径。照同样的办法，其中选择通过琥珀酸到琥珀酰-CoA的途径(琥珀酰-CoA途径)进行4-HB生物合成，针对存在酶(琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和/或4-羟基丁酸酯脱氢酶)缺陷的宿主，将编码核酸在该受体宿主内进行外源性表达。选择通Sa-酮戊二酸到琥珀半醛途径(α -酮戊二酸途径)的4-ΗΒ生物合成可以将外源性表达用于存在一种或者多种如下酶的缺陷的宿主谷氨酸琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶和/或4-羟基丁酸酯脱氢酶；或者α -酮戊二酸脱羧酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶。本领域的技术人员根据本文的披露可以容易地确定用于生产4-ΗΒ或者BDO的途径酶。依据选定的宿主微生物的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物合成途径构成，本发明所述的非天然存在的微生物将包括至少一种外源性表达的4-HB、4-HB、4-HBCoA、BD0或者腐胺途径的编码核酸乃至用于一种或者多种4-HB或者BDO生物合成途径的所有的编码核酸。例如，通过外源性表达相应的编码核酸在存在途径酶或者蛋白质缺陷的宿主内建立4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺生物合成。在存在4_ΗΒ、4_ΗΒ、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的所有的酶或者蛋白质缺陷的宿主内，可以包含该途径中所有的酶或者蛋白质的外源性表达，虽然应理解，即使该宿主包含至少一种途径酶或者蛋白质，也可以表达该途径的所有的酶或者蛋白质。如果需要，可以包含用于生产4-HB、4-HB、4-HBCoA、BDO或者腐胺的途径中的所有的酶或者蛋白质的外源性表达。例如，可以通过4-羟基丁酸酯脱氢酶编码核酸的外源性表达在存在4-羟基丁酸酯脱氢酶缺陷的宿主内通过所有的五种途径建立4-HB的生物合成。相比之下，可以通过所有的如下八种酶的外源性的表达在存在所有的八种酶的缺陷的宿主内通过所有的五种途径建立4-HB的生物合成非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、谷氨酸琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、α -酮戊二酸脱羧酶、α -酮戊二酸脱氢酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶。考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员会理解以可表达的形式引入的编码核酸的数量将，至少，等于所选定的宿主微生物的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径缺陷量。因此，本发明的非天然存在的微生物可以具有一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种乃至所有的编码本文披露的构成一种或者多种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径的酶的核酸。在一些实施方式中，该非天然存在的微生物还可以包括其他促进或者优化4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物合成或者赋予该宿主微生物其他有用的功能的基因修饰。一种这类的其他功能性可以包括例如，对一种或者多种4-HB途径前体(如琥珀酸、琥珀酰-CoA、α -酮戊二酸、4_氨基丁酸、谷氨酸、乙酰乙酰基-CoA和/或高丝氨酸)的合成的增强。一般地，宿主微生物应该这样选择以便其生产4-HB、4-HBal、4_HBCoA、BD0或者腐胺途径的前体，作为自然生产的分子或作为工程产物，其提供所需前体的从新生产或由该 宿主微生物自然生产的前体的增加生产。例如，琥珀酰-CoA、α-酮戊二酸、4-氨基丁酸、谷氨酸、乙酰乙酰基-CoA，以及高丝氨酸自然产生于宿主生物，如大肠杆菌。宿主生物可以设计以增加前体的生产，正如本文所披露。此外，已被设计以生产所需前体的微生物可用作宿主生物并进一步被设计，以表达4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的酶或蛋白质。
在一些实施方式中，本发明的非天然存在的微生物生成自包含合成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的酶催能力的宿主。在该特定的实施方式中，其可用以增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径产物的合成或累积以，例如促使发生4-HB、4_HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径反应，以便生产4_HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。合成或累积的增加可以通过，例如编码本文披露的一种或多种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶的核酸的过表达来完成。该一种或多种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺途径酶的过表达的发生可以，例如通过一种或多种内源性基因的外源性表达或通过一种或多种异源性基因的外源性表达。因此，通过一种、两种、三种、四种、五种、六种等等乃至所有的编码4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径酶的核酸的过表达，天然存在的生物可以很容易地生成为本发明的产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的微生物。此外，非天然存在的生物可以通过造成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径中酶活性的增加的内源性基因的诱变来生成。在特别有用的实施方式中，采用编码核酸的外源性表达。外源性表达赋予对宿主定制表达和/或调节元件的能力以及获得使用人控制的所需的表达水平的应用。然而，其他实施方式中还可以利用内源性表达，例如当连接至诱导型启动子或其他调节元件时，通过去除负调节效应子或基因启动子的诱导利用内源性表达。因此，具有天然存在的诱导型启动子的内源性基因可以通过提供适当的诱导剂上调；或者内源性基因的调节区域可设计以纳入诱导调节元件，从而允许在需要的时候调节内源性基因的上调表达。同样，可以包括诱导型启动子，作为针对引入非天然存在的微生物的外源性基因的调节元件(见实施例)。如本文所用，“外源”意指有关分子或有关活性被引入宿主微生物。分子可以例如,通过将编码核酸引入宿主遗传物质,如通过整合入宿主染色体或作为非染色体遗传物质(如质粒)被引入。因此，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物。当关于生物合成活性使用时，该术语指被引入宿主有关生物的活性。来源可以是例如，表达引入宿主微生物后有关活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源”指在宿主内存在的有关分子或活性。同样，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指包含在微生物体内编码核酸的表达。术语“异源”指来自与有关物种不同来源的分子或活性而“同源”指来自宿主微生物的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源性表达可以利用异源编码核酸和同源编码核酸的其一或两者。应理解，当微生物内包含一种以上的外源性核酸时，所述一种以上的外源性核酸指相关的编码核酸或者生物合成活性，如上文所讨论。进一步应理解，如本文所披露，这类一种以上的外源性核酸可以被引入在单独的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或者在其组合上的宿主微生物，并且仍然被看作是一种以上的外源性核酸。例如，如本文所披露，微生物可被设计以表达两种或者两种以上的编码所需的途径酶或者蛋白质的外源性核酸。在两种编码所需活性的外源性核酸被引入宿主微生物的情况下，应理解，该两种外源性核酸可以作为单一核酸被引入例如，在单一质粒上、在单独的质粒上的，可以被整合入位于单个位点或者多个位点的宿主染色体，以及仍然被看作是两种外源性核酸。同样，应理解，两种以上的外源性核酸可以任何所需的组合形式被引入例如，在单一质粒上、在单独的质粒上 的宿主生物，可以被整合入位于单一位点或者多个位点的宿主染色体，以及仍然被看作是两种或者两种以上的外源性核酸，例如三种外源性核酸。因此，相关的外源性核酸或者生物合成活性的数量指编码核酸的数量或者生物合成活性的数量，而非被引入宿主生物的单独的核酸的数量。用于4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶的编码核酸的来源可以包括，例如其中被编码的基因产物能够催化参照反应的任何物种。这类物种既包括原核生物又包括真核生物，包括但不仅限于细菌(包括古生细菌和真细菌)以及真核生物(包括酵母)、植物、昆虫、动物以及哺乳动物(包括人)。针对这种来源的示例性物种包括，例如大肠杆菌、酿酒酵母、克鲁弗氏酵母、克鲁佛氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、肉毒杆菌、酪丁酸梭菌、破伤风形梭菌、破伤风梭菌、丙酸梭菌、氨基丁酸梭菌、近端梭菌、斯蒂克兰德氏梭菌、富养罗尔斯通氏菌、牛结核分支杆菌、结核分枝杆菌、牙龈红棕色单胞菌、拟南芥、嗜热栖热菌、假单胞菌属(包括绿脓假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌)、智人、穴兔、类球红细菌、布氏热厌氧杆菌、勤奋生金球菌、肠膜明串珠菌、橙色绿屈挠菌、Roseiflexus castenholzii、赤细菌、加州希蒙得木、不动杆菌属(包括乙酸钙不动杆菌和贝氏不动杆菌)、牙龈红棕色单胞菌、硫化叶菌tokodaii、硫磺矿硫化叶菌、嗜酸热硫化叶菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、褐鼠、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、薄肌眼虫、齿垢密螺旋体、热醋穆尔氏菌、海栖热袍菌、盐沼沙雷氏菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、嗜热泉生古细菌(Aeropyrumpernix)、野猪、秀丽隐杆线虫、谷氨酸棒杆菌、发酵氨基酸球菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、念珠菌、土曲霉、乳酸戊糖片球菌、运动发酵单胞菌、巴氏醋杆菌、乳酸克鲁维酵母、巴克氏真杆菌、多毛拟杆菌、Anaerotruncus colihominis、厌氧性嗜盐嗜碱耐热菌(Natranaerobius thermophiIusm)、空肠弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷氏菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、黄色粘球菌、具核梭杆菌、产黄青霉、海洋Y蛋白质菌、产丁酸菌、艾瓦诺卡氏菌、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、人体酵母菌探针、热葡糖苷酶地芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌、烟草、水稻、地中海富盐菌、根癌农杆菌、反硝化无色杆菌、具核梭杆菌、带小棒链霉菌、鲍氏不动杆菌、小家鼠、克鲁佛氏酵母菌、阴道滴虫、布氏锥虫、施氏假单胞菌、大豆慢生根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、牛、粘毛烟草、创伤弧菌、反刍动物月形单胞菌、副溶血性弧菌、闪烁古生球菌、死海盐盒菌、耐超高温热棒菌、包皮垢分支杆菌MC2 155、鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10、海洋分支杆菌M、微代谢冢村氏菌DSM20162、蓝菌属PCC7001、盘基网柄菌AX4，以及本文披露的其他物种(见实施例)。例如，本文参照大肠杆菌和酵母宿主对具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成生产的微生物进行了例证。然而，今天超过550个物种的完整的基因组序列是可得的(这些物种中超过一半的基因组序列在公用数据库，如NCBI中可以得到)，包括395微生物基因组和各种酵母、真菌、植物以及哺乳动物基因组，在这种情况下，编码针对近缘或远缘物种中一种或多种基因的必要的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成活性的基因的识别(包括，例如已知基因的同系、直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换)以及生物之间基因改变的互换在本领域是常规且熟知的。因此，实现本文所述的关于特定生物(如大肠杆菌或酵母)的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺以及其他化合物的生物合成的代谢改变可以以同样的方式很容易地应用到其他微生物，包括原核和真核生物。考虑到本文提供的启示 和指导，本领域的技术人员会得知在一种生物中示范的代谢改变可以同样地应用于其他生物。在某些情况下，例如当替代性的4-HB、4_HBal、BDO或者腐胺生物合成途径存在于不相关的物种中时，可以通过，例如来自催化相似的、但非完全相同的代谢反应以取代参照反应的不相关物种的一种旁系同源物或多种旁系同源物的外源性表达，赋予该宿主物种4-HB、4-HBal、BDO或者腐胺的生物合成。由于不同的生物之间存在代谢网络间的某些差异，本领域的技术人员会理解不同生物之间的实际的基因用法可以存在差异。然而，考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员还会理解本发明的启示和方法可以通过利用对本文那些示例性的微生物所作的同源代谢改变应用于所有的微生物，以在有关的物种中构建会合成4-HB (如单体4-HB、4-HBal、BDO或者腐胺)的微生物。宿主微生物可以选自以及所述非天然存在的微生物可以生成于，例如细菌、酵母、真菌或各种其他适用于发酵过程的微生物的任意一种。示例性的细菌包括选自如下的物种大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、菜豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、氧化葡糖杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、萤光假单胞菌以及恶臭假单胞菌。示例性的酵母或真菌包括选自如下的物种酿酒酵母、人体酵母菌探针、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉、毕赤酵母、无根根霉菌、稻根霉菌(Rhizobus oryzae)等等。黑曲霉和毕赤酵母。大肠杆菌是一种特别有用的宿主生物，因为其是一种适于基因工程的具有良好表征的微生物。其他特别有用的宿主生物包括酵母，如酿酒酵母。应理解，任何适合的宿主微生物可用以引入代谢和/或基因修饰，以生产所需的产品。可以例如，通过本领域熟知的重组和检测方法操作用于构建和测试生产非天然存在的产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的宿主的表达水平的方法。这类方法的描述可以见于，例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001) ;Ausubel 等人，Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)。4-HB 和 GBL 可以通过，例如，利用Spherisorb 50DS1柱和流动相的70%10mM磷酸缓冲液(pH=7)以及30%甲醇的HPLC进行分离，以及利用UV检测器于215nm处进行检测(Hennessy等人2004, J. Forensic Sci. 46 (6) : 1-9)。BDO通过气相色谱分析或通过HPLC以及利用AminexHPX-87H柱和流动相的0. 5mM硫酸的折光率检测器来检测(Gonzalez-Pajuelo等人、Met.Eng. 7:329-336(2005)) ο可以利用本领域熟知的技术(包括但不限于接合、电穿孔术、化学转化法、转导、转染和超声转化)将用于生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的途径中涉及的外源性核酸序列稳定或瞬时地引入宿主细胞。对于大肠杆菌或其他原核细胞中的外源性表达，真核细胞核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码导向信号(targeting signal),如N-末端线粒体导向信号或其他导向信号，如果需要，其可以在转换进入原核宿主细胞之前被去除。例如，线粒体前导序列的去除导致了大肠杆菌中表达的上调(Hoffmeister等人，J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005))。对于酵母或其他真核细胞中的外源性表达，可以 在胞质溶胶中表达基因，而不添加前导序列；或者可以通过添加适于宿主细胞的合适的导向序列(如线粒体导向或分泌信号)将基因导向线粒体或其他细胞器。因此，应理解，对核酸序列的适当的以去除或包含导向序列的修改可被纳入外源性核酸序列中，以提供所需的特性。此外，以本领域熟知的技术可以使基因经受密码子优化，以实现蛋白质的优化表达。表达载体可以被构建以包括如本文所示范的可操作地连接于宿主生物中功能性的表达调控序列的一种或多种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径和/或一种或者多种生物合成编码核酸。适用于本发明的宿主微生物的表达载体包括，例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体(包括可操作地用以稳定地整合到宿主染色体的载体和选择序列或标记)。此外，该表达载体可以包括一种或多种选择标记基因和适当的表达调控序列。还可以包括，例如提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或者提供培养基中没有的关键营养物的选择标记基因。表达调控序列可以包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子以及本领域熟知的诸如此类的表达调控序列。当两个或两个以上外源性编码核酸被共同表达时，两个核酸都可以被插入，例如单一表达载体或独立表达载体。对于单一载体表达，编码核酸可被可操作地连接到一个共同的表达调控序列或连接到不同的表达调控序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以利用本领域熟知的方法确定代谢或合成途径中涉及的外源性核酸序列的转化。这类方法包括，例如核酸分析法，如Northern印迹法或mRNA聚合酶链反应(PCR)扩增；或基因产物表达免疫印迹法；或其他合适的测试引入核酸序列或其相应的基因产物的表达的分析方法。本领域的技术人员应理解，以足以生产所需产品的量来表达外源性核酸以及进一步应理解，可以利用本领域熟知的和本文披露的方法优化表达水平以获得足够的表达。利用本领域熟知的方法如本文所示范构建本发明所述的非天然存在的微生物，以以足够的量外源性表达编码4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶的至少一种核酸，以生产4-HB，如单体4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。应理解，在足以生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的条件下培养本发明的所述微生物。下文实施例中进一步描述了每种途径中的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺酶的示例性表达水平。遵循本文提供的启示和指导，本发明所述的非天然存在的微生物可以实现4-HB (如单体4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺)的生物合成，产生在约O. l_200mM或以上(例如O. l_25mM或以上)之间的细胞内浓度。一般地，4-HB (如单体4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺)的细胞内浓度在约3-150mM或以上之间，特别地在约5-125mM或以上之间以及更特别地在约8-100mM之间，例如，约3-20mM，尤其在约5_15mM之间以及更特别地在约8_12mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或以上。也可以从本发明的所述非天然存在的微生物获得这些示例性范围的每个之间和以上的细胞内浓度。在具体的实施方式中，本发明的所述微生物，尤其是菌株(如本文披露的那些菌株)(见实施例XII-XIX和表28)，可以通过提高4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生产和/或减少不需要的副产物而提供所需产品(如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺)的改善生产。这类生产水平包括但不仅限于本文披露的那些生产水平以及包括每升从约18到约258，例如每升约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 甚或更多量的产物。 除本文披露的培养和发酵条件之外，用于实现BD0、4-HB、4-HBCoA、4_HBal和/或腐胺的生物合成的培育条件可以包括将渗透保护剂添加到培养条件中。在某些实施方式中，可以在渗透保护剂的存在下如本文所述维持、培养或者发酵本发明所述的非天然存在的微生物。简言之，渗透保护剂指作为渗透物起作用以及帮助如本文所述的微生物经受得住渗透应力的化合物。渗透保护剂包括但不仅限于甜菜碱、氨基酸以及海藻糖。这类渗透保护剂的非限制性的实施例是甘油酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基锍基丙酸(dimethyIsulfoniopropionate)>3- 二甲基锍基-2-甲基丙酸、哌可酸、二甲基锍基乙酸、胆碱、L-肉毒碱和四氢嘧啶。在一个方面，该渗透保护剂是甘油酸甜菜碱。本领域的任一普通技术人员应理解，适于保护本文所述的微生物不受渗透应力影响的渗透保护剂的量和类型将取决于所用的微生物。在培养条件下的渗透保护剂的量可以是例如，不多于约O. ImM,不多于约O. 5mM、不多于约I. OmM、不多于约I. 5mM、不多于约2. OmM、不多于约2. 5mM、不多于约3. OmM、不多于约5. OmM、不多于约7. OmM、不多于约10mM、不多于约50mM、不多于约IOOmM或者不多于约500mM。在一些实施方式中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧培育或维持条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。用于发酵过程的示例性的厌氧条件的描述见于本文以及，例如2007年8月10日提交的美国专利申请号US 2009/0047719。任何这些条件可以与所述非天然存在的微生物以及本领域熟知的其他厌氧条件一起使用。在这种厌氧或基本上厌氧的条件下，该4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生产者可以合成细胞内浓度为5-10mM或以上以及本文示例性的所有其他浓度的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺。应理解，虽然上文的描述指细胞内浓度，生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的微生物可以在细胞内生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0或者腐胺和/或分泌产物到培养基内。培养条件可以包括，例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如本文所描述，在厌氧或基本上厌氧的培养条件下可以获得本发明生物合成产物的特别有用的收率。如本文所描述，一种用于实现4-HB、4-HBal、4_HBCoA、BDO或者腐胺生物合成的示例性培育条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中，本发明的所述非天然存在的微生物可以在厌氧或基本上厌氧的条件下维持、培养或发酵。简言之，厌氧条件指缺乏氧的环境。基本上厌氧的条件包括,例如培养菌分批发酵或连续发酵以便培养基中溶解的氧浓度保持在O和10%的饱和度之间。基本上厌氧的条件还包括在保持在小于1%的氧气氛中的密封室内部的液体培养基中或固体琼脂上培育或静置细胞。可以通过，例如用n2/co2混合物或一种或多种其他合适的非氧气体喷射培养菌来保持氧的百分比。本发明还提供一种非天然存在的微生物催化剂，该微生物催化剂包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1，4- 丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物，所述途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸4_羟基丁酸酯脱氢酶、非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-Cok合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、谷氨酸琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、非依赖CoA的醛脱氢酶、依赖CoA的醛脱氢酶或醇脱氢酶，其中该外源性核酸以足以生产1，4-丁二醇(BDO)的量表达。4-羟基丁酸CoA转移酶也统称为4-羟基丁酰CoA :乙酰基-CoA转移酶。本文还披露了其他4-HB或者BDO途径酶(见实施例和图8_13)。本发明进一步提供非天然存在的微生物催化剂，该微生物催化剂包括具有4-羟 基丁酸(4-HB)和1，4- 丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物，该途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸4_羟基丁酸酯脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、α -酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或者醛/醇脱氢酶，其中该外源性核酸以足以生产1，4-丁二醇(BDO)的量表达。还可以生成生物合成BDO的非天然存在的微生物。与本发明的生产4-ΗΒ的微生物一样，该生产BDO的微生物也可以在细胞内生产BDO或者分泌BDO到培养基内。遵循前文提供的针对合成4-ΗΒ的微生物构建的启示和指导，其他的BDO途径可以被纳入该生产4-ΗΒ的微生物，以生成也合成BDO和其他BDO家族化合物的生物。已知BDO及其下游产物的化学合成。本发明的能够生物合成BDO的非天然存在的微生物避免了这些利用4-ΗΒ作为入口点的化学合成，如图I所示。如下文进一步所述，4-ΗΒ生产者还可用以化学转化4-ΗΒ到例如，GBL然后到BDO或者THF。替代性地，4-ΗΒ生产者可以进行进一步的修饰，以包括用于转化4-ΗΒ和/或GBL到BDO的生物合成能力。引入4-ΗΒ生产者的其他的BDO途径包括，例如宿主缺陷背景内的外源性表达或者图I中示范性的如步骤9-13的一种或者多种酶的过表达。一种这类途径包括例如，执行图I中显示为步骤9、12和13的反应所需的酶活性，其中醛和醇脱氢酶可以是单独的酶或者具有醛和醇脱氢酶活性的多官能酶。另一种这类途径包括例如，执行图I显示为步骤10、
11、12和13的反应所需的酶活性，其中醛和醇脱氢酶也可以是单独的酶或者具有醛和醇脱氢酶活性的多官能酶。相应地，该引入4-ΗΒ生产者的其他的BDO途径包括，例如宿主缺陷背景内的外源性表达或者一种或者多种如下酶的过表达4_羟基丁酸CoA转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、非依赖CoA的醛脱氢酶、依赖CoA的醛脱氢酶或者醇脱氢酶。缺少能够修饰4-HB的内源性的酰基-CoA合成酶的情况下，该非天然存在的BDO生产微生物可以进一步包括对4-HB具有选择性的外源性酰基-CoA合成酶或者多种具有作为净反应的从4-HB到4-HB-CoA的转化的酶的组合。如下文实施例进一步示范的，丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶显示BDO途径活性以及用4-HB底物催化图I中所示的转化。因此，这些酶在本文中还可以分别被称为4-羟基丁酸激酶和磷酸转羟基丁酰酶。可用于这些从4-HB到BDO的体内转化的示例性的乙醇和醛脱氢酶列入下文的表I中。
表I.用于4-HB到BDO的转化的乙醇和醛脱氢酶.
解脱氬晦Ce;].].].39苹策酸脱基)
ec:UJJ 醇脱i*ec:l.l.l .40苹果酸脱氣酶(莩*乙酸-脱羧基J
cc:LL] .2 醇 Ii 氱酶(NADP+)(ΜΛ )Ρ+)
cc],].].4 (R,R)-丁二醇隱氣誨ec:1 —I —I—4〗善柠樣酸脱UI(NAD+}
ecilJ.1.5 3-羟基丁W.lt氮酶ec:U.l.42异柠樣酸親^ !(ΝΛ丨)P+)
ec:U.1.6 甘油税氮酶oc: 1.1.1.54￠, 基-酵Uit1 海
ec:Ll.l.7 丙二醇-磷酸親Iu鸯ec:1.1.1.55乳*还原*(ΝΛ〖)ΡΗ)
ec:I.I — I —8 背油-3-磷酸脱_氣酶(ΝΛΙ)+)ec:IJJ-56核糖醇2_脱-氣酶
ec:丨.I丄11 D-H拉伯糖醇4-脱.氣酶ec:[丨丄593-羟基兩酸脱—&錄
cc],].].12 L-Pf拉《德酵4-It氮酶ec:1J J-60基各氧代两8&遝原酶
ecilJ.1.13 I—-Pf#- 糖醇 2-親》氮酶ec:l.U.614-羟基丁酸ft—氱酶
ec:1.1.1.14 I.-艾社糖醇uc: 1.1.1.66co-羟基癸駿ΛS1It
cc:Ll.l.l5 丨>·艾杜糖# 2-ltfv#ec:1.1.1.67甘醇 2-144,6%
cc:Ll.].16 半乳糖醇ee:丨JJ—71醇脱—& ρΜΛ0(Ρ)+1
ec:1JJJ7甘露糖醇-I-磷酸5-,I氬酶ec:U丄72甘油脱.1/·|(ΝΑ Ρ+>
ec],].].18 肌醇 2- ec:丨.丨.丨.73辛醇It—fc*
ec:l-lJ.2l 感还原酶ec;:l.1.1.75(R)-氣基兩醇itli_
ec: 1. 1.1.23 組氨Sf-IC.氬綠w: 1. 1. 1.76(S.S)- 丁二醇脱MM
ec:LI. 1.26乙經酸还原腾ec:1.1'1.77乳齡还原驗
cc;],].].27 L-乳酸說氣($ee:丨JJ —78T基乙二 还原SKNAOTim的)
ec:UJJ8 D-ILaIiftftiICCLLL79乙*酸还暴酶(NADP+)
cc],].L29甘油酸脱Sutec:丨.丨.丨.80异丙醇暖ADP+)
cc:Ll.L30 3-羟基丁酸KiUtee:l.U.81羟基丙#1 原SI
ec:1.1.131 3-羟基异丁酸K氮錄ec:1.1.1.82苹果酸脱. 酶(ΝΛΙ)Ρ+)
cc:Ll.l35 3- Sitl-CoA 脱氮酶ec: 1.1.1.83I)-苹篆酸RKxSiWk基>
cc:Ll.].36乙Sfe乙St基-CoA还原碟ee:丨—丨—丨—84二甲基苹果酸脱&酶
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ec:LL1 SI芳基-醇It氬錄,.NADI~)ec:U丄259夂椏基变二mA E11酶
权利要求
1.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括4-羟基丁酸还原酶；琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)；以及4-羟基丁酸脱氢酶。
2.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括琥珀酰-CoA还原酶(醛形成);4_羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶。
3.根据权利要求I或者2的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
4.一种用于生产4-轻基丁醒的方法,所述方法包括在一定条件下培养权利要求1-3任 意一项的该非天然存在的微生物达足够长的时间以生产4-羟基丁醛。
5.根据权利要求4的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
6.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括4-羟基丁酸还原酶；α -酮戊二酸脱羧酶；以及4-羟基丁酸脱氢酶。
7.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括α -酮戊二酸脱羧酶；4_羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶。
8.根据权利要求6或者7任意一项的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
9.一种用于生产4-轻基丁醒的方法,该方法包括在一定条件下培养权利要求6-8任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产4-羟基丁醛。
10.根据权利要求9的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
11.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括琥珀酸还原酶；4_羟基丁酸脱氢酶，以及4-羟基丁酸还原酶。
12.根据权利要求11的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的三种外源性核酸琥珀酸还原酶；4_羟基丁酸脱氢酶，以及4-羟基丁酸还原酶。
13.根据权利要求11的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
14.一种用于生产4-轻基丁醒的方法,该方法包括在一定条件下培养权利要求11-13任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产4-羟基丁醛。
15.根据权利要求14的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
16.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括α -酮戊ニ酸脱羧酶或者谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶和谷氨酸脱羧酶和4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4_羟基丁酸脱氢酶；以及4_羟基丁酸还原酶。
17.根据权利要求16的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的至少三种外源性核酸α -酮戊ニ酸脱羧酶或者谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶和谷氨酸脱羧酶和4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4_羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶。
18.根据权利要求16的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
19.ー种用于生产4-轻基丁醒的方法,该方法包括在一定条件下培养权利要求16-18任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产4-羟基丁醛。
20.根据权利要求19的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
21.ー种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少ー种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括α -酮戊ニ酸还原酶；5_羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶。
22.根据权利要求21的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的三种外源性核酸α -酮戊ニ酸还原酶；5_羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶。
23.根据权利要求21的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
24.—种用于生产4-轻基丁醒的方法,该方法包括在一定条件下培养权利要求21-23任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产4-羟基丁醛。
25.根据权利要求24的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
26.ー种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少ー种外源性核酸，所述腐胺途径包括琥珀酸还原酶；4_氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4_氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
27.根据权利要求26的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的四种外源性核酸琥珀酸还原酶；4_氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4_氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
28.根据权利要求26的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
29.—种用于生产腐胺的方法,该方法包括在一定条件下培养权利要求26-28任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产腐胺。
30.根据权利要求29的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
31.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括α -酮戊二酸脱羧酶；4_氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4_氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
32.根据权利要求31的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的四种外源性核酸α -酮戊二酸脱羧酶；4_氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4_氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
33.根据权利要求31的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
34.一种用于生产腐胺的方法，该方法包括在一定条件下培养权利要求31-33任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产腐胺。
35.根据权利要求34的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
36.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶；谷氨酸脱羧酶；4_氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
37.根据权利要求36的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的四种外源性核酸谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶；谷氨酸脱羧酶；4_氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
38.根据36权利要求的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
39.一种用于生产腐胺的方法,该方法包括在一定条件下培养权利要求36-38任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产腐胺。
40.根据权利要求39的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
41.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括α -酮戊二酸还原酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱羧酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
42.根据权利要求41的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的四种外源性核酸α -酮戊二酸还原酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱羧酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
43.根据权利要求41的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
44.一种用于生产腐胺的方法，该方法包括在一定条件下培养权利要求41-43任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产腐胺。
45.根据权利要求44的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
46.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括α -酮戊二酸还原酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；鸟氨酸脱氢酶或者鸟氨酸转氨酶；以及鸟氨酸脱羧酶。
47.根据权利要求46的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的四种外源性核酸α -酮戊二酸还原酶；5_氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；鸟氨酸脱氢酶或者鸟氨酸转氨酶；以及鸟氨酸脱羧酶。
48.根据权利要求46的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
49.一种用于生产腐胺的方法,该方法包括在一定条件下培养权利要求46-48任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产腐胺。
50.根据权利要求49的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
51.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁酰-CoA (4-HBCoA)途径的微生物，该途径包括编码以足够的量表达以生产4-羟基丁酰-CoA的4-羟基丁酰-CoA途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁酰-CoA途径包括α -酮戊二酸还原酶；5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。
52.根据权利要求51的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括编码如下酶的三种外源性核酸α -酮戊二酸还原酶；5_羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。
53.根据权利要求51的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
54.—种用于生产4-轻基丁酰-CoA的方法,该方法包括在一定条件下培养权利要求51-53任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产4-羟基丁酰-CoA。
55.根据权利要求54的方法，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
全文摘要
本发明提供包括1,4-丁二醇(BDO)、4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁醛或者腐胺途径的非天然存在的微生物，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO、4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁醛或者腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，该微生物可以被进一步地优化用于表达BDO。本发明还提供利用这类微生物以生产BDO、4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁醛或者腐胺的方法。
文档编号C12N1/20GK102762735SQ201080056425
公开日2012年10月31日 申请日期2010年10月13日 优先权日2009年10月13日
发明者A·P·博加德, 牛巍, 约翰·D·特拉威克, 罗伯特·哈瑟尔贝克 申请人:基因组股份公司