年龄相关黄斑变性中的遗传多态性的制作方法

专利名称：年龄相关黄斑变性中的遗传多态性的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及人疾病的治疗。更具体而言，本发明涉及湿性年龄相关黄斑变性、age_relatecl macular degeneration, AMD) 发明背景 AMD是老年人中严重的、不可逆的视カ损失(vision loss)的ー项主要原因。Bressler(2004)JAMA 291:1900-01。它以一大批临床和病理发现为特征，包括称为玻璃疣的浅黄色斑、视网膜色素上皮(RPE)的破坏、脉络膜新血管化(CNV)、和盘状黄斑变性。该疾病分类成两种形式非滲出性(干性)和滲出性(湿性或新血管性)。最近，已经开发出几种用于治疗湿性AMD的疗法使用维替泊芬(verteporfin) (Visudyne )的光动力学疗法；一种VEGF结合适体，即哌加他尼(pegaptanib) (Macugen );和ー种抗VEGF抗体片段，即雷尼珠单抗(ranibizumab) (Lucentis ⑩)。在特定基因中的不同等位基因导致不同表型，包括疾病形成或进展和对治疗性药物的响应时，群体中发生遗传多态性。已经鉴定出与AMD形成或进展有关的多种多态性(例如，Despriet 等(2007) Arch. Ophthalmol. 125:1270-71; Seddon 等(2007) JAMA297:1793-99，2585;Boon 等(2008)Am. J. Human Genet. 82:516-23)。先前的工作已经显示了补体因子H(CFH)基因的氨基酸第402位的特定多态性与对针对AMD的用维替泊芬的I3DT或核准标示外使用的贝伐单抗(bevacizumab)疗法的响应有关(Brantley等(2008)Eye 2月 22 日在线发表，第 I 页-第 6 页；Brantley 等(2007)Ophthalmologyl 14:2168-73)。可以使用与疾病形成有关的和/或预测特定疗法的效カ或安全性的其它多态性的鉴定结果来为会最好地受益于它们的那些患者调整疗法。发明概述本发明部分基于预测AMD风险或用高亲和カ抗VEGF抗体治疗会使AMD患者受益的可能性升高的遗传多肽性的鉴定。在一方面，本发明提供了一种预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用高亲和カ抗VEGF抗体治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选基质金属蛋白酶25基因(MMP25)等位基因中与rsl064875对应的基因组多态性，其中若对应的基因型包含AA或AG，则所述患者具有升高的受益于所述治疗的可能性。在一些实施方案中，基因型包含AA。在一些实施方案中，基因型包含AG。在另一方面，本发明提供了一种预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗体治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选盘基菌蛋白(discoidin)域受体家族成员2基因(DDR2)等位基因中与rsl0917583对应的基因组多态性，其中若对应的基因型包含AA或AC，则所述患者具有升高的受益于所述治疗的可能性。在一些实施方案中，基因型包含AA。在一些实施方案中，基因型包含AC。在另一方面，本发明提供了一种预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗体治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样(BATF)等位基因中与rsl75714对应的基因组多态性，其中若对应的基因型包含AA或AG，则所述患者具有升高的受益于所述治疗的可能性。在一些实施方案中，基因型包含AA。在一些实施方案中，基因型包含AG。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体与由杂交瘤ATCC HB 10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4. 6. I结合相同表位。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体具有重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含下列重链互补决定区(CDR)氨基酸序列CDRHl(GYDFTHYGMN;SEQ ID NO: I)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQ ID NO:2)和raRH3(YPYYYGTSHWYFDV;SEQ ID N0:3)，所述轻链可变域包含下列轻链⑶R氨基酸序列 CDRLl(SASQDISNYLN;SEQ ID N0:4)、CDRL2(FTSSLHS;SEQ ID NO:5)和CDRL3(QQYSTVPWT;SEQID NO:6) o在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体具有Y0317的重链可变域和轻链可变域。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体是雷尼珠单抗(ranibizumab)。在另一方面，本发明提供了ー种用于预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠单抗治疗的可能性的试剂盒，其包含对MMP25等位基因中与rsl064875对应的A/G多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在一些实施方案中，可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸来扩增包含MMP25等位基因中与rsl064875对应的A/G多态性的部分MMP25基因。在另一方面，本发明提供了ー种用于预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠单抗治疗的可能性的试剂盒，其包含对DDR2等位基因中与rsl0917583对应的A/C多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在一些实施方案中，可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸来扩增包含DDR2等位基因中与rsl0917583对应的A/C多态性的部分DDR2基因。在另一方面，本发明提供了ー种用于预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠单抗治疗的可能性的试剂盒，其包含对BATF等位基因中与rsl75714对应的A/G多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在一些实施方案中，可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸来扩增包含BATF等位基因中与rsl75714对应的A/G多态性的部分BATF基因。在另一方面，本发明提供了用于测定患者是否有升高的形成湿性AMD的风险的方法，包括对自患者分离的样品筛选表4或表5中所显示的ー种或多种等位变体,其中表4或表5中所显示的ー种或多种等位变体的存在指示所述患者有升高的形成湿性AMD的风险。附图
简述图I显示了根据来自MMP25、DDR2、和BATF基因的风险等位基因总和分层，12个月的Lucentis疗法后视敏度的均值变化。发明详述除非另有指示，本发明的实践会采用本领域技术内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、和免疫学的常规技木。此类技术在下列文献中完整解释，诸如“ Molecular Cloning: A LaboratoryManual ”，第二版(Sambrook 等,1989); “Oligonucleotide Synthesis”(Μ· J.Gait 编,1984); “AnimalCell Culture，，(R. I. Freshney 编，1987); “Methods in Enzymology”(AcademicPress, Inc.) ; “Current Protocols in Molecular Biology”(F. M. Ausubel 等编，1987，及周期性更新)；iiPCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mull is 等编，1994)。除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology 第 2 版，J. Wiley&Sons(New York, N. Y. 1994),及 March, Advanced OrganicChemistry Reactions, Mechanisms and Structure第 4版，John ffiley&Sons(New York, N.Y. 1992)给本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般指导。通过提及而完整收录本文中所引用的所有參考文献，包括专利申请和出版物。
定义如本文中所使用的，除非上下文另有明确规定，単数形式“ー个”、“ー种”和“所述/该”包括复数。例如，ー个/种细胞还会包括“多个/种细胞”。术语“包含”意图指组合物和方法包括列举的元件，但不排除其它的。术语“ VEGF ”和“ VEGF-A ”可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子和/或相关的121、189、和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如由Leung等Science, 246:1306 (1989)，及 Houck 等 Mol. Endocrin.，5:1806 (1991)所描述的，以及其天然存在的等位和加工形式。“抗VEGF抗体”指以足够的亲和カ和特异性结合VEGF的抗体。优选地，本发明的抗VEGF抗体可以作为治疗剂在靶向和干扰牵涉VEGF活性的疾病或状况中使用。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物诸如VEGF-B或VEGF-C，或其它生长因子诸如P1GF、PDGF或bFGF。ー种优选的抗VEGF抗体是如下的单克隆抗体，其与由杂交瘤ATCC HB 10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4. 6. I结合相同表位，并且是一种高亲和カ抗VEGF抗体。“高亲和カ抗VEGF抗体”比单克隆抗VEGF抗体A4. 6. I具有好至少10倍的对VEGF的亲和カ。优选地，抗VEGF抗体是依照WO 98/45331生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体片段，包括包含Y0317的⑶R和/或可变区的抗体。更优选地，抗VEGF抗体是称为雷尼珠单抗(Lucentis )的抗体片段。术语“抗体”以最广义使用，并且包括单克隆抗体(包括全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。“治疗/处理”指治疗性处理和防范性或预防性措施两者。需要治疗的对象包括已经患有病症的对象及要预防或延迟病症的对象。术语“多态性”指基因序列中在群体内变化的位置。多态性由不同“等位基因”构成。可以通过其在基因中的位置和那里找到的不同氨基酸或碱基来鉴定此类多态性的位置。例如，Y402H CFH指示CFH基因中的氨基酸第402位存在着酪氨酸(Y)和组氨酸(H)间的变化。此氨基酸变化是两种可能的变体碱基C和T (它们是两种不同等位基因)的結果。因为基因型由两个分开的等位基因构成，所以可以在任何ー个个体中观察到几种可能的变体之任一(例如,对于此例子，CC、CT、_TT)。还给个别多态性分配本领域技术人员已知的并在例如NCBI网站可获得的核苷酸序列变异单核苷酸多态性数据库(dbSNP)中使用的独特标识符(“參照 SNP”、“refSNP” 或“rs#”)。术语“基因型”指细胞或组织样品中的某种基因的特定等位基因。在上述例子中，CC、CT、或TT是Y402H CFH多态性方面可能的基因型。术语“样品”包括自患者采集的细胞或组织样品。例如，样品可以包括皮肤样品、颊细胞样品、或血细胞。可以通过本领域技术人员公知的许多方法之任一来实施样品中的特定基因型的
鉴定。例如，可以通过使用本领域中公知的技术克隆等位基因并对其测序来实现多态性的鉴定。或者，可以例如使用PCR来自基因组DNA扩增基因序列，并对产物测序。下文描述了用于对患者的DNA分析给定遗传基因座处的突变的几种非限制性方法。可以使用DNA微阵列技术，例如，供高通量筛选应用的DNA芯片装置和高密度微阵列和较低密度微阵列。用于微阵列制作的方法是本领域中已知的，并且包括各种喷墨(inkjet)和微喷(microjet)沉积或点样(spotting)技术和方法、原位或芯片上(on-chip)光刻寡核苷酸合成方法、和电子DNA探针寻址方法。已经在基因表达分析和点突变的基因型分型、单核苷酸多态性(SNP)、和短串联重复(STR)领域中成功应用DNA微阵列杂交应用。别的方法包括干扰RNA微阵列及微阵列与其它方法诸如激光捕获显微解剖(laser capture microdissection, LCM)、比较基因组杂交(CGH)和染色质免疫沉淀(ChiP)的组合。见例如，He 等(2007) Adv. Exp. Med. Biol. 593:117-133 及 Heller (2002) Annu. Rev.Biomed. Eng. 4:129-153。其它方法包括 PCR、xMAP、侵入物测定法(invader assay)、质谱术、和焦憐酸测序(pyrosequencing) (Wang 等(2007)Microarray Technology and CancerGene Profiling 丛书 Advances in Experimental Medicine and Biology, pub. SpringerNew York 的第 593 卷)。另ー种检测方法是使用交叠多态性位点并且在多态性区周围具有约5，或备选地10，或备选地20，或备选地25，或备选地30个核苷酸的探针来进行等位基因特异性杂交。例如，将能够与等位变体特异性杂交的几种探针附着于固相支持物，例如“芯片”。可以通过多种方法，包括石印术(lithography)来将寡核苷酸结合至固体支持物。使用这些包含寡核苷酸的芯片(又称作“ DNA探针阵列”)的突变检测分析记载于例如Cronin等(1996) HumanMutation 7:244。在其它检测方法中，有必要首先至少扩增基因的一部分，之后鉴定等位变体。可以例如通过PCR和/或LCR或本领域中公知的其它方法来实施扩增。在一些情况中，可以通过限制酶分析来显示来自受试者的DNA中特定等位基因的存在。例如，特定的核苷酸多态性可以导致包含另ー等位变体的核苷酸序列缺乏的限制性位点的核苷酸序列。在又一个实施方案中，可以使用免于切割剂(诸如核酸酶、羟胺或四氧化锇及用哌啶)的保护来检测RNA/RNA、DNA/DNA、或RNA/DNA异双链体中的错配碱基(见例如，Myersm (1985) Science 230:1242)。一般地，通过提供异双链体开始“错配切割”技术，所述异双链体通过杂交任选地标记的包含基因等位变体的核苷酸序列的对照核酸(例如RNA或DNA)与自组织样品获得的样品核酸(例如RNA或DNA)形成。用切割双链体诸如基于对照与样品链间的碱基对错配形成的双链体的单链区的试剂处理双链双链体。例如，可以用RNA酶处理RNA/DNA双链体，及用S I核酸酶处理DNA/DNA杂合物以酶促消化错配区。或者，可以用羟胺或四氧化锇及用哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体以消化错配区。在消化错配区后，然后将所得的材料在变性聚丙烯酰胺凝胶上根据大小分开以测定对照和样品核酸是否具有相同的核苷酸序列或者它们在哪些核苷酸中不同。见例如美国专利 No. 6，455，249;Cotton 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397;Saleeba 等(1992)Meth. Enzymol. 217:286-295。也可以使用电泳迁移率的变化来鉴定特定的等位变体。例如，可以使用单链构象多态性(SSCP)来检测突变型与野生型核酸间电泳迁移率的差异(Orita等(1989)ProcNatl. Acad. Sci USA 86:2766;Cotton(1993)Mutat. Res. 285:125-144 及 Hayashi (1992)Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79)。将样品和对照核酸的单链DNA片段变性，并容许复性。单链核酸的ニ级结构随序列而有所变化，所得的电泳迁移率变化实现甚至单个碱基变化的检出。可以将DNA片段标记或者用经标记的探针检測。可以通过使用RNA(而不是DNA)(其中二级结构对序列变化更敏感)来增强测定法的灵敏性。在另ー个优选的实施方案中，主题 方法利用异双链体分析来分离双链异双链体分子，其基于电泳迁移率的变化进行(Keen等(1991) Trends Genet. 7:5)。也可以通过分析包含多态性区的核酸在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动来获得等位变体的身份，其使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)測定(Myers等(1985)Nature 313:495)。在使用DGGE作为分析方法时，会将DNA修饰以确保它不完全变性，例如通过PCR添加约40bp高溶点富含GC的DNA的GC夹来实现。在又一个实施方案中，使用温度梯度来替换变性剂梯度以鉴定对照和样品DNA的迁移率差异(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys. Chem. 265:1275)。用于检测2种核酸间的至少ー个核苷酸的差异的技术的例子包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增、或选择性引物延伸。例如，可以制备如下的寡核苷酸探针，其中将已知的多态性核苷酸放置在中央(等位基因特异性探针)，然后在只有找到完全匹配时才容许杂交的条件下与靶DNA杂交(Saiki等(1986)Nature 324:163) ; Saiki等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230)。可以使用此类等位基因特异性寡核苷酸杂交技术来检测基因多态性区中的核苷酸变化。例如，将具有特定等位变体的核苷酸序列的寡核苷酸附着于杂交膜，然后将此膜与经标记的样品核酸杂交。然后，对杂交信号的分析会掲示样品核酸的核苷酸的身份。或者，可以与本发明一起使用依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技木。作为引物用于特异性扩增的寡核苷酸可以在分子中央(使得扩增依赖于差别的杂交)(Gibbs等(1989) Nucl. Acids Res. 17:2437-2448)或在一条引物的3’端末端(在那里，在合适的条件下，错配可以阻止或降低聚合酶延伸)(Prossner (1993) Tibtech 11:238及Newton等(1989) Nucl. Acids Res. 17:2503)携带感兴趣等位变体。此技术又称作“PR0BE”，代表探针寡碱基延伸(PRobe Oligo Base Extension)。另外,可以期望在突变区中引入新的限制性位点以创建基于切割的检测(Gasparini等(1992)Mol. Cell. Probes 6:1)。在另ー个实施方案中，使用寡核苷酸连接测定法(OLA)来实施等位变体的鉴定，如记载于例如，美国专利 No. 4，998，617 及 Laridegren, U.等 Science241:1077-1080 (1988)的。OLA方案使用两种寡核苷酸，其设计为能够与靶物的単一链的邻接序列杂交。ー种寡核苷酸与分离标志物连接，例如生物素化的，而另一种是可检测标记的。若在靶分子中找到精确的互补序列，则寡核苷酸会杂交，从而其末端邻接，并创建连接底物。然后，连接容许使用亲合素，或另ー种生物素配体来回收经标记的寡核苷酸。Nickerson，D.A.等已经描述了一种组合PCR和OLA属性的核酸检测测定法(Nickerson, D. A.等(1990) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 87:8923-8927)。在此方法中，使用PCR来实现靶DNA的指数式扩增，然后使用OLA来检测。本发明提供了用于检测MMP25、DDR2和BATF中的单核苷酸多态性(SNP)的方法。因为单核苷酸多态性侧翼有不变序列区，所以其分析仅仅需要測定单个变体核苷酸的身份，并且不必测定每名患者的完整基因序列。已经开发出几种方法来便于分析SNP。可以通过使用专门化的外切核酸酶抗性核苷酸来检测单碱基多态性，如披露于例如美国专利No. 4，656，127的。依照该方法，容许与刚刚在多态性位点3’的等位序列互补的引物与自特定动物或人获得的靶分子杂交。若靶分子上的多态性位点含有与存在的特定外切核酸酶抗性核苷酸衍生物互补的核苷酸，则所述衍生物会被掺入杂交引物末端上。此 类掺入使引物对外切核酸酶有抗性，并且由此容许其检出。因为样品的外切核酸酶抗性衍生物的身份是已知的，所以引物已经变为对外切核酸酶有抗性的发现掲示了存在于靶分子的多态性位点中的核苷酸与反应中使用的核苷酸衍生物的核苷酸互补。此方法具有如下的优点，即它不需要測定大量的无关序列数据。也可以使用基于溶液的方法来测定多态性位点的核苷酸的身份(W091/02087)。如上述的，采用与刚刚在多态性位点3’的等位序列互补的引物。该方法使用经标记的双脱氧核苷酸衍生物来测定该位点的核苷酸的身份，若与多态性位点的核苷酸互补，则所述经标记的双脱氧核苷酸衍生物会被掺入弓I物的末端上。一种备选的方法记载于WO 92/15712。此方法使用经标记的终止物与引物的混合物，所述引物与多态性位点3’的序列互补。如此，掺入的经标记的终止物通过所评估的靶分子的多态性位点中存在的核苷酸确定，并且与所述核苷酸互补。该方法通常是ー种异质相測定法，其中将引物或靶分子固定化于固相。已经描述了用于测定DNA中的多态性位点的多种其它引物引导的核苷酸掺入规程(Komher, J. S.等(1989) Nucl. Acids. Res. 17: 7779-7784; Sokolov, B. P. (1990) Nucl.Acids Res. 18:3671;Syvanen, A. -C.,等(1990)Genomics 8:684-692;Kuppuswamy, M.N.等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :1143-1147 ;Prezant, T. R.等(1992)Hum.Mutat. 1:159-164;Ugozzoli, L.等(1992)GATA 9:107-112;Nyren, P.等(1993)Anal.Biochem. 208:171-175)。这些方法均依赖于经标记的脱氧核苷酸的掺入以区别多态性位点处的喊基。此外，应当理解，可以使用用于检测基因或基因产物或多态性变体中的变化的任何上述方法来监测治疗或疗法过程。可以例如通过利用预包装的诊断试剂盒，诸如那些在下文所描述的试剂盒来实施本文中所描述的方法，所述试剂盒包含至少ー种探针或引物核酸，其可以方便地使用，例如以测定个体是否具有升高的形成AMD的可能性或者湿性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗体治疗的可能性。在上文所描述的诊断和预后方法中使用的样品核酸可以自受试者的任何细胞类型或组织获得。例如，可以通过已知的技术获得受试者的体液(例如，血液)。或者，可以对干样品(例如，毛发或皮肤)实施核酸测试。本文中所描述的发明涉及用于测定并鉴定存在于数种等位基因，包括MMP25、DDR2和BATF等位基因处，分别于rsl064875、rsl0917583和rsl75714处的等位基因的方法和组合物。可以使用探针来直接测定样品的基因型，或者可以与扩增同时或者在扩增后使用探针。术语“探针”包括天然存在的或重组的单或双链核酸或化学合成的核酸。它们可以通过切ロ平移(nick translation)、Klenow填充反应、PCR或本领域中已知的其它方法来标记。本发明的探针、其制备和/或标记记载于SambiOOk等(1989)见上文。探针可以是适合干与含有本发明多态性区的核酸选择性杂交的任何长度的多核苷酸。所使用的探针的长度会部分取决于所使用測定法的性质和所采用的杂交条件。也可以与多态性扩增一起使用经标记的探针。(Holland等(1991)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88:7276-7280)。美国专利No. 5，210，015描述了基于荧光的方法来在PCR期间提供扩增产物的实时测量。此类方法或是已经采用插入染料(诸如溴化こ啶)来指示存在的双链DNA的量，或是它们已经采用含有荧光-淬灭剂对的探针(又称为“TaqMan ”方法)，其中在扩增期间切割探针以释放荧光分子，该荧光分子的浓度与存在的双链DNA的量成比例。在扩增期间，探针在与靶序列杂交时被聚合酶的核酸酶活性消化以引起荧光分子与淬灭剂分子分开，由此使来自报告物分子的荧光出现。TaqMan 方法使用含有报告物分子一淬灭剂分子对的探针，其与含有多态性的靶多核苷酸区特异性退火。可以将探针附于表面以作为“基因芯片”使用。可以通过本领域技术人员已知的多种技术使用此类基因芯片来检测遗传变异。在一种技术中，将寡核苷酸在基因芯片上排列以通过杂交方法，诸如美国专利No. 6，025, 136和6，018, 041中概述的方法实现的测序来测定DNA序列。也可以使用本发明的探针来对遗传序列进行荧光检测。此类技术已 经记载于例如美国专利No. 5，968，740和5，858，659。也可以将探针附于电极表面以电化学检测核酸序列，诸如美国专利No. 5,952, 172中及由Kelley, S. O.等(1999)Nucl. AcidsRes. 27:4830-4837 所描述的。另外，作为探针或引物使用的分离的核酸可以修饰为变为更稳定。修饰的例示性的核酸分子包括DNA的氨基磷酸酷、硫代磷酸酯(phosphothioate)和膦酸甲酯类似物(还可见美国专利 No. 5，176，996; 5, 264，564 和 5，256，775)。如本文中所列的，本发明还提供了用于测定存在于MMP25、DDR2或BATF中的多态性区的等位变体类型的诊断方法。在一些实施方案中，该方法使用包含与MMP25、DDR2或BATF的多态性区互补的核苷酸序列的探针或引物。因而，本发明提供了用于实施这些方法的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定湿性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗体，包括高亲和カ抗VEGF抗体治疗的可能性的试剂盒。此类试剂盒含有本文中所描述的ー种或多种组合物和使用说明书。仅举例而言，本发明还提供了用于测定湿性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠单抗治疗的可能性的试剂盒，其包含对MMP25rsl064875 SNP中的AG多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。对遗传基因座“特异性”的寡核苷酸结合基因座的多态性区或者在基因座的多态性区附近結合。对于要作为扩增引物使用的寡核苷酸，若引物足够接近，使得用于生成包含多态性区的多核苷酸，则它们是相邻的。在一个实施方案中，若寡核苷酸在距离多态性约l_2kb内，例如小于Ikb结合，则它们是相邻的。特异性寡核苷酸能够与序列杂交，并且在合适的条件下不会结合相差单个核苷酸的序列。试剂盒可以包含至少ー种能够与MMP25、DDR2或BATF的多态性区特异性杂交的探针或引物和使用说明书。试剂盒通常包含至少ー种上文所描述的核酸。用于至少扩增MMP25、DDR2或BATF的一部分的试剂盒一般包含两条引物，其中至少一条能够与等位变体序列杂交。此类试剂盒适合于通过例如荧光检测，通过电化学检测，或者通过其它检测来检测基因型。可以将试剂盒中含有的寡核苷酸(无论作为探针还是引物使用)可检测标记。标记物可以直接(例如对于荧光标记物)或间接检測。间接检测可以包括本领域技术人员已知的任何检测方法，包括生物素-亲合素相互作用、抗体结合等。经荧光标记的寡核苷酸还可以含有淬灭分子。可以将寡核苷酸结合至表面。在一些实施方案中，表面是硅土(silica)或玻璃。在一些实施方案中，表面是金属电极。本发明的其它试剂盒包含至少ー种对于实施测定法必需的试剂。例如，试剂盒可·以包含酶。或者，试剂盒可以包含缓冲液或任何其它必需的试剂。试剂盒可以包含本文中所描述的所有或ー些阳性对照、阴性对照、试剂、引物、测序标志物、探针和抗体，用于测定受试者在MMP25、DDR2或BATF的多态性区中的基因型。以下实施例仅意图例示本发明的实施，而并不作为限制提供。
实施例实施例I :遗传多态性及其与AMD发生和治疗结果的关联样品和基因型分型将来自Lucentis 枢要试验(pivotal trial) (MAR I NA、ANCHOR、和 FOCUS)的 250名隐瞒身份(de-identified)的受试者的外周血样品收集,并分离基因组DNA,所述受试者參与HORIZON延长试验(extension trial)的DAWN遗传子研究。分析中使用的所有样品具有列为“白种人”的自身鉴定人种，并且具有新血管性AMD的确诊。样品由104名男性和146名女性组成，并且基线时的平均年龄是75. 7岁龄。从研究中的所有个体获得书面知情同意，并且研究方案得到机构审查委员会批准。在上文所描述的样品外，收集102份样品作为DAWN研究的一部分,产生总共352份总样品。使用Illumina 550K人HapMap珠阵列来对352份样品基因型分型。我们使用严格质量控制(QC)标准来确保最終的分析中包括高质量数据。具体地，我们a)排除具有大于5%遗漏数据的个体，并且b)基于隐性关联性排除个体和基于IBS状态(PI Hat>0. 15，在此数据集中无ー检出)排除复制样品。我们仅包括具有a)小于5%遗漏数据，b)HWEP-值 >lxl(T6，和 c)MAF>0. 01% 的 SNP。使用 PLINK 来实施所有 QC 测试(Purcell 等(2007)Am. J. Hum. Genet. 81, 559-75)。对Lucentis⑩疗法响应的全基因组关联扫描在MARINA、ANCHOR和FO⑶S试验期间基于处理状态将DAWN样品分成2组。Lucentis 处理组包括接受剂量 0. 3mg、0. 5mg 或 0. 5mg+PDT 的个体(N=242)。SHAM/PDT组由接受假注射(SHAM)或仅光动力学疗法(TOT)的个体组成(N=IlO)。我们实施全基因组关联扫描以鉴定与12个月的Lucentis 治疗后视敏度(VA，以字母測量)变化显著关联的遗传变体(表I)。从与VA的均值变化有关的顶部基因座列表看，我们鉴定出3个含有可能在伤ロ修复中发挥作用的基因的基因座(表2)，并且通过对来自MMP25 (rsl064875)、DDR2 (rsl0917583)和BATF (rsl75714)基因座的由每名个体携带的风险等位基因数目求和来创建“基因得分”(图I)。表I :与12个月的Lucentis⑧疗法后视敏度变化最相关的变体的等级次序列表(P〈2xl(T5)。
染色体SNP染色体位置等位基因P值基因符号
(ΒΡ,基于NCBI 构件(build) 36)
I rs 10917583160897518G 5.81E-06 DDR2
22 rs95654825867502A 7.10E-06 MIAT
I rs 10494373160885986C 7.98E-06 DDR2
19rs726054451313304C 8.24E-06 IGFL3
22rs960858025862474G 9.70E-06 MiAT
10 rs791309832014665A 1.22E-05 LQC646034
Irs 16843630160936667G 1.27E-05 DDR2
14rs 17571475051609A 1.63E-05 BATF
16rs 10648753042210A 1.68E-05 MMP25
Irs 191033974640705A 1.69E-05 PAPPA2表2 :根据MMP25、DDR2和BATF基因座处的基因型分层，12个月的Lucentis 治
疗时视敏度的均值变化。
权利要求
1.一种预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用高亲和力抗VEGF抗体治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选基质金属蛋白酶25基因(MMP25)等位基因中与rsl064875对应的基因组多态性，其中若对应的基因型包含AA或AG，则所述患者具有升高的受益于所述治疗的可能性。
2.一种预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗体治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选盘基菌蛋白域受体家族成员2基因(DDR2)等位基因中与rsl0917583对应的基因组多态性，其中若对应的基因型包含AA或AC，则所述患者具有升高的受益于所述治疗的可能性。
3.一种预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗体治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样(BATF)等位基因中与rsl75714对应的基因组多态性，其中若对应的基因型包含AA或AG，则所述患者具有升高的受益于所述治疗的可能性。
4.权利要求I至3中任一项的方法，其中所述抗VEGF抗体与由杂交瘤ATCC HB10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4. 6. I结合相同表位。
5.权利要求4的方法，其中所述抗VEGF抗体具有重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含下列重链互补决定区(⑶幻氨基酸序列⑶RH1(GYDFTHYGMN;SEQ ID NO: I)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQ ID NO:2)和 CDRH3(YPYYYGTSHWYFDV ;SEQ ID NO:3)，所述轻链可变域包含下列轻链CDR氨基酸序列CDRL1 (SASQDISNYLN; SEQ ID NO: 4),CDRL2(FTSSLHS;SEQ ID NO:5)和 CDRL3(QQYSTVPWT;SEQ ID NO:6)。
6.权利要求5的方法，其中所述抗VEGF抗体具有Y0317的重链可变域和轻链可变域。
7.权利要求I至3中任一项的方法，其中所述抗VEGF抗体是雷尼珠单抗。
8.权利要求I的方法，其中所述对应的基因型包含AA。
9.权利要求I的方法，其中所述对应的基因型包含AG。
10.权利要求2的方法，其中所述对应的基因型包含AA。
11.权利要求2的方法，其中所述对应的基因型包含AC。
12.权利要求3的方法，其中所述对应的基因型包含AA。
13.权利要求3的方法，其中所述对应的基因型包含AG。
14.一种用于预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠单抗治疗的可能性的试剂盒，其包含对MMP25等位基因中与rsl064875对应的A/G多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
15.权利要求14的试剂盒，其中可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸来扩增包含MMP25等位基因中与rsl064875对应的A/G多态性的部分MMP25基因。
16.一种用于预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠单抗治疗的可能性的试剂盒，其包含对DDR2等位基因中与rsl0917583对应的A/C多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
17.权利要求16的试剂盒，其中可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸来扩增包含DDR2等位基因中与rsl0917583对应的A/C多态性的部分DDR2基因。
18.一种用于预测湿性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠单抗治疗的可能性的试剂盒，其包含对BATF等位基因中与rsl75714对应的A/G多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
19.权利要求18的试剂盒，其中可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸来扩增包含BATF等位基因中与rsl75714对应的A/G多态性的部分BATF基因。
全文摘要
本发明涉及用于测定患者是否有升高的形成湿性AMD的风险或者患者是否具有升高的受益于用高亲和力抗VEGF抗体治疗的可能性的方法。
文档编号C12Q1/68GK102686743SQ201080056334
公开日2012年9月19日 申请日期2010年10月20日 优先权日2009年10月21日
发明者R.格雷厄姆 申请人:基因泰克公司