细胞或微生物的培养方法

专利名称：细胞或微生物的培养方法
技术领域：
本发明关于使氧或ニ氧化碳溶解于含有营养成分的培养液中，而对该培养液中的细胞或微生物进行培养的培养方法。
背景技术：
在作为培养例如动物或植物等的细胞或微生物的方法方面，已知有通过供给例如空气等含氧或ニ氧化碳的气体至含有营养成分的培养液中来培养细胞或微生物的方法。该营养成分可例如预先在培养液中混入预定量，或者是在进行培养期间持续性提供给适当的培养液中，而空气则必须在培养期间不断地持续向培养液中供给。将空气提供给培养液中的方法，已知有例如将在前端侧形成有多个气体吐出ロ的管状的起泡器(例如U字形起泡 器等)预先浸入培养液中，使培养液中产生直径为例如数_左右的气泡的方法。在该方法中，为了增加空气向培养液中的溶解量，例如必须利用涡轮式搅拌叶片搅拌培养液，使得自起泡器起泡的空气的气泡变小(加以破碎)，由此增加气液(空气与培养液)接触面积，使空气容易溶解于培养液中。因此，越要增大氧溶解速度(量)，就需越激烈地搅拌培养液，于是，需要很大的能量用于搅拌，且进行培养的装置(搅拌装置)也随之大型化进而高成本化。并且，当培养液温度因搅拌而升高时，就需要用来使培养液的温度降低的冷却能量。而且，在培养细胞的情况下，则存在细胞会因搅拌叶片的搅拌而受到物理性损伤的忧虑。而且，细胞也有可能因为气泡因搅拌而破碎(破裂)时的冲击而受到损伤。专利文献I中，记载了如下技术经由多孔质体使液体中生成微小的气泡,并将该气泡应用于水栽培、鱼贝类的养殖、食品、微胶囊、医药制剂及化妆品等的技木；以及利用上述微小的气泡抑制微生物的繁殖的技术等，然而并未对细胞或微生物的培养方面进行研讨。先行技术文献(专利文献)专利文献I :日本特开2005-169359 (段落0045)

发明内容
发明概要发明欲解决的课题本发明是在此种情况下所完成的，其目的在于提供一种细胞或微生物的培养方法，是在使氧或ニ氧化碳溶解于含有营养成分的培养液中进行细胞或微生物的培养之际，平稳地控制培养液的搅拌、或无需进行搅拌，均能够使氧或ニ氧化碳迅速溶解于培养液中。
用于解决课题的方法本发明的细胞或微生物的培养方法是使氧或ニ氧化碳溶解在含有营养成分的培养液中，而进行细胞或微生物的培养的培养方法，其特征在于包括下述步骤将含氧或ニ氧化碳的气体提供给多孔质体使培养液中产生体积基准的粒度分布中的50%直径在200 μ m以下的气泡，使氧或ニ氧化碳溶解于上述培养液中而进行细胞或微生物的培养；在上述培养液中，含有蛋白质水解物与用以保护细胞的细胞保护剂中的至少其
O上述培养液的表面张カ优选在51. 5dyne/cm以下。上述多孔质体的细孔径优选在50 μ m以下。发明效果本发明是在通过将含氧或ニ氧化碳的气体提供给含有营养成分的培养液中来进 行细胞或酵母、霉菌、细菌及微藻类的微生物的培养之际，将含氧或ニ氧化碳的气体提供给多孔质体以使培养液中产生在体积基准的粒度分布中50%直径在200 μ m以下的气泡，并且 使上述培养液中含有蛋白质水解物与用以保护细胞的细胞保护剂中的至少其一。通过蛋白质水解物或细胞保护剂的界面活性作用，可抑制培养液中的气泡的聚合(凝聚)而获得粒径极其微小的气泡，因此能够增大气液(气泡及培养液)的接触面积。并且，由于可将气泡的浮力抑制至极小，因此与受浮力而上升的例如粒径在300 μ m以上的现有气泡相比，可使气泡在培养液中呈所谓静止状态保持。因此，上述气体可与培养液持续地长时间接触，因此可使氧或ニ氧化碳迅速地溶解于培养液中。并且，由于不用使气泡破碎那样激烈搅拌，因此能够平稳地控制搅拌、或者根本不用搅拌。因此，可缩减装置整体的大小规模或在培养上所需消耗的能量，尤其是能够抑制在培养细胞的情况下，搅拌对细胞所造成的物理性损伤。


图I是示出用于实施本发明的细胞或微生物的培养方法的培养装置的一例的模式图。图2是示出在上述培养装置的培养液中产生气泡的状况的模式图。图3是示出利用现有方法使培养液中产生气泡时的状况的模式图。图4是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图5是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图6是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图7是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图8是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图9是示出本发明的实施例所采用的装置中的搅拌叶片及消泡叶片的设置位置的概略图。图10是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图11是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图12是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图13是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图14是示出本发明的实施例所获结果的特性图。图15是示出本发明的实施例所获结果的特性图。附图标记说明1…细孔；1ト··多孔质体；12…气泡；13…培养液；2ト··培养槽；22…起泡器；23…氧储存部。
具体实施例方式參照图I及图2对本发明的培养细胞或酵母、霉菌、细菌及微藻类的微生物的培养方法的实施方式的一例进行说明。首先，简单说明用以实施该培养方法的培养装置的一例，该培养装置具备培养槽21、起泡器22，该培养槽21用来储存含有营养成分的培养液13，该起泡器22是氧供给部,用以将含氧的气体弄成极度微小的气泡(微泡,micro bubble)12并将其提供给培养槽21内的培养液13，在本例中上述含氧的气体是空气。该培养装置构成为经由氧供给路径24将空气自储存有空气或氧的氧储存部23提供给起泡器22，并经由连接于培养槽21上表面的排气路径25，将从培养槽21内产生的气体(ニ氧化碳或上述空气等)排出。图I中的附图标记31、32、33、34分别为针阀、压カ计、流量计及球阀，且在例如未图示的控制部控制下，能够对空气向培养槽21的供给与中断、以及向培养槽21供给的空气的压カ及流量进行控制。并且，图I中的附图标记27是马达，用以使已插入培养槽21内的搅拌叶片26在圆周方向进行旋转而稳定地搅拌培养液13，使得自上述的起泡器22提供给培养液13中的气泡12在培养液13中扩散。上述的起泡器22是多孔性体，该多孔性体由例如由以内部区域Ila呈空洞的方式形成的、大致圆筒状的多孔质体(多孔质膜)11所构成，且被浸溃在培养液13中。该多孔质体11，上端侧密封连接有已述氧供给路径24，下端侧被例如未图示的密封构件等密封。该多孔质体11形成为如图I的下侧放大部分所示出的那样，整面皆均匀地形成有多个细孔径d在例如50 μ m以下的微小细孔1，且多孔质体11的内部区域Ila与起泡器22的外部区域(培养液13)经由细孔I而在多处连通。该多孔质体11是通过例如将火山灰浮石与石灰(CaO或CaCO3)或硼酸(H3BO3)等玻璃原料混合并高温熔化，之后以700°C左右进行热处理后再进行酸处理而得到的物质。即，利用上述热处理，多孔质体11中的玻璃成分被极其均匀分离成以ニ氧化硅(SiO2)与氧化铝(Al2O3)为主成分的第I玻璃相、及以氧化硼(B2O3)与氧化钙(CaO)为主成分的第2玻璃相，因此通过调整热处理的温度或时间、或者成分的添加量等，即可在酸处理后获得均匀形成有极微小的细孔I的多孔质体11。该多孔质体11例如被称为SPG (浮石多孔性玻璃，pumice porous glass)膜等，由SPG科技股份有限公司生产。培养槽21内的培养液13中，含有进行培养的细胞2或微生物(在本例中为细胞2);还含有作为该细胞2的营养的营养成分。该营养成分是例如由以预定的比例混合的多种氨基酸、维生素、无机盐及糖等所构成的基础培养基。另外，在培养液13中含有作为添加剂用的、蛋白质水解物与用以保护细胞2的细胞保护剂中的至少其一。所述任ー添加剂皆具有界面活性作用，如后述实施例中所说明的那样，所述添加剂是利用该界面活性作用来抑制自上述的起泡器22提供给培养液13中的微小的气泡12进行聚合(凝聚)的试剂。以下对所述添加剂的各个具体的成分进行详细叙述。蛋白质水解物是将蛋白质水解成氨基酸及低分子量的肽的物质，例如是来源于牛奶的蛋白质的酪蛋白的水解物、多聚蛋白胨、蛋白胨、酵母萃取物、肉萃取物及酪蛋白氨基酸等。该水解的方法例如可举出酸分解、酶分解、自体分解等。蛋白胨是将动物性蛋白质或植物性蛋白质水解成氨基酸及低分子量的肽的化合物的总称。作为蛋白胨的一例的多聚蛋白胨是日本制药股份有限公司的产品，是将牛乳酪蛋白以动物来源酶加以分解后，进行精炼及干燥后的粉末。并且，酵母萃取物是对于啤酒酵母(Saccharomyces CerevisiaeMeyen)的水溶性成分抽取和干燥后得到的粉末，有日本制药股份有限公司的产品(产品名粉末酵母萃取物D-3)等。并且，酪蛋白氨基酸是蛋白胨以外的物质，是利用盐酸将蛋白质完全水解成氨基酸后的物质。此外，也可利用该蛋白质水解物来取代所述营养成分。作为细胞保护剂的物质，可列举浦路洛尼库F68 (Pluronic F68)、黛格GF21(Daigo' s GF21 )(生长促进因子)及血清等。浦路洛尼库F68是BASF日本股份有限公司的产品(CAS编 9003-11-6)，其不具备作为营养成分或细胞成长因子的作用，而是具有保护细胞2的作用的界面活性剤的ー种。黛格GF21是日本制药股份有限公司的产品，是以通过牛血清精炼而去除Y球蛋白的GFS (Growth Factor in Serum,血清中生长因子)为主成分的细胞生长促进因子。血清是例如牛胎儿血清或小牛血清，除了具有供给营养成分及细胞生长因子的作用以外，还具备作为细胞保护剂的功能，可保护细胞2免于受到细胞培养时因培养液13的搅拌或通气等造成的物理性应力。以上各种添加剂中，对于为了在培养液13中通过界面活性剤作用而获得微小的气泡12所需的添加量，将于后述实施例中进行说明。 接着，针对本发明的细胞2的培养方法进行说明。首先，将细胞2、营养成分、及已述的蛋白质水解物与细胞保护剂的至少其一，与上述培养液13 —起投入培养槽21。S卩，在血清培养的情况下，除了细胞2，还有例如已述的基础培养基、血清或黛格GF21被投入培养液13中，而在无血清培养的情况下，则例如基础培养基、细胞生长因子及浦路洛尼库F68与细胞2 —起被投入培养液13中。添加到该培养液13中的蛋白质水解物或细胞保护剂的添加量，如后所述，是可通过该蛋白质水解物或细胞保护剂的界面活性作用而使气泡12的聚合(凝聚)受到抑制的程度的量，具体而言，是使培养液13的表面张カ在51. 5dyne/cm以下的添加量。而且，如前所述，也可使用上述蛋白质水解物作为营养成分。接着，利用未图示的加热器或罩体等将培养槽21中的培养液13控制在预定的温度，并且将含有氧的气体自氧供给路径24提供给起泡器22，该含氧气体在本例中为空气。并且，通过马达27使搅拌叶片26稳定旋转，并使自起泡器22提供给培养液13中的气泡12在培养液13中扩散。如图2所示，自起泡器22提供给培养液13中的空气经由多孔质体11的内部区域Ila,以粒径在例如200 μ m以下的极小的多个气泡(微泡，micro bubble) 12的姿态从细孔I被押出进入培养液13中，附着在例如该多孔质体11的外表面。所述气泡12例如受培养液13的表面张カ作用而将在多孔质体11的表面上互相聚合(凝聚)，然而由于培养液13中如前所述含有具有界面活性作用的添加剤，因此上述表面张カ的作用受抑制而变小，于是聚合获得抑制，从而所述气泡12得以维持上述那样细小而被释出到培养液13中。并且，如前所述，所述多孔质体11由玻璃构成，对培养液13具有高湿润性(亲水性)，因此能够对位于该多孔质体11表面的气泡12的聚合起进ー步抑制。而且，上述的图2中，为了将图示简化而仅在多孔质体11单侧描绘出气泡12。通过添加剂的界面活性作用，也可同样抑制在培养液13中的气泡12彼此聚合。因此，例如后述的图4所示，培养液13中的气泡12的粒径(气泡径)变得极其微小而大小均等，成为体积基准的粒度分布中50%直径(D50，中值粒径)在200 μ m以下的微泡。因此，与例如现有数mm程度或300 μ m以上大小的气泡在培养液13中起泡的情况相比，气泡12的比表面积增加，使空气(气泡12)与培养液13的接触面积变大。而且，所谓“上述的体积基准的粒度分布”是说，并不指计算气泡12的个数所求得的粒度分布，而是指以气泡12的体积为基准所求出的粒度分布。这时，由于气泡12的粒径是极小的，例如200 μ m以下，所以该气泡12几乎不受浮力，可以说在培养液13中成为大致上静止的状态。因此,培养液13中的气泡12极稳定上升，与上述的大粒径的情况相比，与培养液13接触的时间更长。并且，如上所述，由于气泡12的粒径极小，故与粒径300 μ m以上的气泡相比，气泡12的内压(内部的空气向培养液13中溶解的力)变大。基于以上情况，在培养液13中产 生的气泡12会迅速溶于培养液13中。在此，培养液13中的细胞2同时消耗营养成分与培养液13中的氧，而生成例如生成物与ニ氧化碳。并且，随着时间的经过，培养液13中的细胞2的数量(个体数)逐渐增加，因此，随着细胞2的持续培养，细胞2对氧的消耗量变得越来越多。因此，溶在培养液13中的氧(溶氧)将会随着时间的经过而減少。但是，如上所述，将气泡12从起泡器22提供给培养液13中，并且该气泡12如已述那样渐溶于培养液13中，因此由细胞2造成的氧的消耗部分可获得补充。也就是说，与将大粒径的气泡供给到培养液13中的情况相比，通过将微小的气泡12供给到培养液13中，可趋缓培养液13中的溶氧浓度的减少速度，或溶氧的减少得到抑制。然后，培养液13中生成的ニ氧化碳会自排气路径25被排放出去。像这样，当由细胞2所造成的营养成分及氧的消耗、与细胞2的増加(培养)进行预定的时间而致使营养成分消失时，则细胞2就不再消耗氧,培养液13中的溶氧浓度就会急速増加。依据上述的实施方式，在培养液13中进行细胞2的培养之际，将空气提供给多孔质体11，进而产生体积基准的粒度分布中的50%直径在200 μ m以下的极微小的气泡12，同时将作为添加剂的、蛋白质水解物与细胞保护剂中的至少其ー加入培养液13中。因此，通过该添加剂的界面活性作用，可抑制培养液13中的气泡12的聚合(凝聚)而获得粒径极其微小的气泡12，所以与例如粒径为300 μ m以上的气泡相比，可获得更大的气液(气泡12及培养液13)的接触面积。并且，由于可将气泡12的浮力抑制至极小，因此与上述大粒径的气泡相比，可使气泡12在培养液13中保持所谓静止状态。因此，可使气泡12与培养液13持续长时间地接触，因此可使氧迅速地溶解于培养液13中。并且,微小的气泡12与大粒径的气泡相比，微小的气泡12内部的空气欲往气泡12的外侧溶出的压カ变高，因此可使氧更进ー步迅速地溶解于培养液13。并且，利用搅拌叶片26的搅拌可获得上述气泡12，无需用于使大的气泡破碎的激烈搅拌，仅需使气泡12分散于培养液13中的安稳搅拌即可。因此可抑制马达27的消耗能量或尺寸，从而可控制在细胞2的培养上所需要的成本(运转成本及装置成本)。并且，由于可抑制由搅拌所产生的热，因此能够縮小例如用于对培养槽21或培养液13进行冷却的设备的規模。并且，由于只要安稳搅拌即可，因此可抑制因搅拌对细胞2所造成的物理性损伤。并且，由于无需将气泡12破碎，因此可抑制气泡12破裂时的冲击对细胞2所造成的损伤。并且，在向培养液13添加添加剂之际，由于培养液13是用于培养细胞2的液体，因此，除上述的蛋白质水解物及细胞保护剂之外，不能向培养液13中投入例如对细胞2或对细胞2的培养有害的物质，然而，本发明可采用有益于细胞2的培养的添加剤。因此，可迅速将氧提供给培养液13中而又不致对细胞2的培养造成不良影响。在此，在现有的例如粒径在300 μ m以上的气泡的情况下，所述气泡在培养液13中会受到很大的浮力而迅速上升，无法取得与培养液13长时间的接触。并且，在培养液13中未含有上述的添加剂的情况下，即使利用上述的起泡器22使微小的气泡12产生，结果也会如图3所示那样，因培养液13的表面张力，气泡12在例如多孔质体11的表面立即聚合，而生成大气泡。在这种情况下，为了使氧迅速地溶解于培养液13，就必须进行激烈搅拌来破碎大气泡，这样马达27的消耗能量或尺寸均増大，同时也存在会对细胞2造成损伤的担忧。在图3中，也同样仅在多孔质体11的单侧描绘气泡。在上述例子中，利用搅拌叶片26进行搅拌以使气泡12在培养液13中扩散；不过，在例如气泡12离开多孔质体11后立即溶解的情况下，也可不必搅拌。并且，上述例子中，供给空气等含氧的气体来进行细胞2的培养，不过，在供给含ニ氧化碳的气体而培养植物细胞或微藻类等的植物的情况下，也同样适用本发明。在这种情况下，含ニ氧化碳气体的微小气泡12也是经由起泡器22而在培养液13中产生，因此与已述例子相同，也能够使ニ氧化碳迅速溶解于培养液13中。在这种情况下，作为为了使气 泡12的粒径变小(为了降低培养液13的表面张力)所添加的添加剤，可使用蛋白质水解物或细胞保护剂。该添加剂的添加量是例如通过实验等来适当设定。
实施例下面，对针对微小气泡12所进行的实验进行说明。(实施例I)首先，在培养动物细胞的培养液13中添加细胞保护剂(黛格GF21)的情况下，测定由上述起泡器22 (细孔径d为I μ m的多孔质体11)生成的气泡12的粒度分布。该粒径的測定方法如下采用激光衍射散射式粒度分布计，将利用起泡器22而产生了气泡12的培养液13连续地提供给该粒度分布计内的流量槽，将激光照射在该培养液13并评价该激光的衍射或散射而进行測定。其结果，在细胞保护剂的添加量为I体积％的情况下，如图4所示，体积基准的粒度分布中的50%直径在200μπι以下(124μπι)。因此，对于该大小的气泡12，可以认为如已述的那样浮力的影响变得极小。另ー方面，在细胞保护剂的添加量为O. 5%的情况下，如图5所示，得知50%直径是238 μ m。对这种添加剂的添加量与所获得的气泡12的粒径的关系进行測定，将黛格GF21的添加量进行各种改变来测定气泡12的粒径时，得到了如图6所示的結果。因此可知，为了使得被认定为受浮力的影响小的粒径在200 μ m以下的气泡12产生，就必须添加I体积％以上的黛格GF21。(实施例2)与上述实施例I同样地，针对添加剂的添加量与生成的气泡12的粒径的相关关系，改变所添加的添加剂的种类及添加量进行实验。首先，如前已述，产生的气泡12的粒径会因应培养液13的表面张カ而变化，因此，对所需的培养液13的表面张カ是何种程度方可使粒径在200 μ m以下的微小气泡12产生进行确认。具体而言，采用黛格GF21作为添加剤，同时在已将该添加剂的添加量做了各种变化的培养液13中，利用已述的起泡器22使气泡12产生，并测定该培养液13的表面张カ与所产生的气泡12的粒径。其结果，如图7所示可知，培养液13的表面张カ与产生的气泡12的粒径间可看出直线性相关关系，且该关系可由以下的(I)式表示。
y=28. 98x-1292... (I)由该(I)式可知，如前已述欲产生200 μ m以下的微小粒径的气泡12，必须使培养液13的表面张カ在51. 5dyne/cm以下。于是，在以下的表I 3所示的添加剂中，分别改变各自的浓度并添加于培养液13，对此时的培养液13的表面张カ进行评价。接着，被推估有这种微小气泡12生成的情况(表面张カ在51. 5dyne/Cm以下)记为〇，而大于此粒径的情况(表面张カ大于51. 5dyne/cm)则记为X。该结果显示在以下的表I 3中。(表I)
度(mg/L) I 5 10 50 100 5UO IOUU 5UUU 10000
_成分_
多聚蛋白胨XXXXXXXXO
酵母萃取物χχχχχχχΟΟ(表2)
度(mg/L)
O 0.1 0.25 0.5 I 10 IUU IUOU 10000
_成分_ ヽ\_________
浦路洛尼库F68xxxxxOOOO(表3)
\农度(vol%)
t .O 0.2 0.5 I 1.5 2 3 5 10
成分 ヽ\
兌株 GF21X X χΟΟΟΟΟΟ由该结果可知，必须根据添加剂的种类调整添加量，方可获得被认为受浮力的影响小的粒径在200 μ m以下的气泡12。(实施例3)接着，在培养微生物的培养基(表面张カ48. 6dyne/cm)中，对气泡12的气泡径与多孔质体11的细孔径d的对应关系进行测定时，获得如图8所示的結果。依据该结果算出近似上述对应关系的线形公式时，获得以下结果y=3. 4x + 17. 5··· (2)其中，(X :多孔质体11的细孔径；y :气泡12的粒径(50%直径))。此时的R2值为
I.O,因此通过该式(2)可知，根据培养液13中的气泡12的粒径可极高精度算出多孔质体11的细孔径d。于是，计算出与被认为受上述的浮力的影响极少的气泡12的粒径(200μπι)相对应的多孔质体11的细孔径d，得知是50 μ m。因此，通过利用细孔径在50 μ m以下的多孔质体U，可获得受浮力的影响极小的微小气泡12。(实施例4)接下来，在分别利用本发明的起泡器22与现有的起泡器(U字形起泡器)使培养液13中产生气泡12的情况，进行了确认给各个培养液13中提供氧气的氧供给性能的实验。具体而言，对于培养槽，使用股份有限公司高杉制作所制的3L小型缸式发酵槽，其内径为130mm,高度为260mm (型号TSC_M3L)，并如图9所示于培养槽中设置外径为55mm的6片叶片，平桨涡轮式搅拌叶片及消泡叶片。利用各自的起泡器，以150ml/min的流量将空气提供给培养液13中，測定显示氧溶解能力的指标I^a值(总氧容量转移系数)。其结果，如图10所示，在使用多孔质体11 (SPG膜)的情况下，即使只是稳定的搅拌仍可获得高的溶氧浓度，然而对于现有的起泡器(U字形)，即使激烈搅拌培养液13仍无法获得高的溶氧浓度，且是使用多孔质体11的情况的十分之一以下。因此得知对于现有的起泡器，为了获得高的溶氧浓度，必须通过搅拌将气泡加以破碎。例如，为了获得301Γ1的K^i值，对于多孔质体11， 搅拌叶片26的转速在250rpm就已足够，但是对于现有的起泡器，就需要达550rpm的激烈搅拌。因此，可以说，通过利用多孔质体11可使搅拌叶片26的转速降低到一半以下。(实施例5)就采用本发明的起泡器22 (多孔质体11)的情况与采用现有的起泡器(U字形)的情况，进行实验来确认实际培养为微生物的大肠杆菌(Escherichia coli, NBRC3301)之际的菌体浓度(0D600)会变得如何。对于空气供给量，各自设为150ml/min。其结果如图11所示，得知与使用现有的起泡器的情况相比，在采用多孔质体11的情况下，培养8小时后菌体浓度变成增多50%左右。该结果与提供给培养液13的气泡12的粒径相对应，即，可以说气泡12的比表面积越大则氧供给速度越快,就越可增加菌体浓度。(实施例6)并且，同样地测定当采用多孔质体11及采用现有的起泡器实际培养大肠杆菌之际的溶氧浓度。其结果如图12所示，可知对于现有的起泡器，随着培养的开始溶氧浓度就立刻減少，然而在采用多孔质体11的情况下，溶氧浓度降低的情况可受到抑制。(实施例7)在上述实施例6中，测定了培养液13中的溶氧浓度，而在本实施例7中，则测定了在培养大肠杆菌时自培养液13释出(排出)的气体中的氧浓度。即，若已供给的空气中的氧溶解于培养液13中并由大肠杆菌所消耗，则所排出的氧量就会变少，然而，在氧未溶于培养液13的情况下，则氧就直接自培养液13中被排出，因此通过測定排气中的氧浓度来确认氧是否被有效地利用。其结果如图13所示，在采用多孔质体11的情况下，排放气体中的氧浓度变低，可知氧溶解于培养液13中或该氧被大肠杆菌消耗。另ー方面，对于现有的起泡器，氧溶解干培养液13的情况并不理想，可知大部分的氧被排出。将该结果作为氧的有效利用率(已经消耗的氧量+已供给的氧量)来计算，则对于多孔质体11，氧的有效利用率为86%，对于现有的起泡器氧的有效利用率为30%。因此，可知通过采用多孔质体11，使气泡12的粒径变小，且空气容易溶解在培养液13中；而现有的起泡器，因气泡大粒径，因此所供给的大部分氧自培养液13被排出。
(实施例8)接下来，在采用本发明起泡器22的情况下、与采用现有的起泡器(烧结金属)的情况下，实际培养属于动物细胞的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary)细胞(生物科技日本股份有限公司(Life Technologies Japan Ltd.);目录编号11619-012)之际,进行了实验来确认活细胞浓度及葡萄糖浓度会变得如何。具体而言，在艾柏尔股份有限公司(ABLECorporation)制的整体为7L的动物细胞培养槽(型号BCP_07NP3)中，贴入(收纳)生物科技日本股份有限公司制的属于无血清培养基的CHO-S-SFM II计5L，培养中国仓鼠卵巢细胞。活细胞浓度采用如下方法进行測定在采取自上述培养槽的培养液中，添加作为细胞生死判定用试剂的0. 05wt (重量)％苯胺黑溶液，利用桑立德硝子股份有限公司(SunleadGlass Corp.)制的托马氏血球计数盘(型号A105)进行測定。另ー方面，葡萄糖浓度是利用股份有限公司岛津制作所制的高速液体色层分析仪(管柱型号Shim-pack SPR-Pb250LX7.8)进行測定的。并且，关于培养液的溶氧浓度，无论是在本发明的情况下还是在
现有的情况下，均控制起泡器22 (起泡器)的空气供给量以使培养液的溶氧浓度分别成为6.31mg/L。关于活细胞浓度，其结果如图14所示，可知与采用现有的起泡器相比，在采用多孔质体11的情况下，最大活细胞浓度可提高75%左右。并且，葡萄糖浓度如图15所示可知，初始值相同，且培养中的浓度的减少趋势也几乎相同。即，自多孔质体11产生的气泡12存在于培养液13中并供给氧，与自现有的起泡器产生的气泡相比，细胞2可更有效率地消耗葡萄糖而进行繁殖。
权利要求
1.一种细胞或微生物的培养方法，是使氧或ニ氧化碳溶解在含有营养成分的培养液中，而进行细胞或微生物的培养的培养方法，其特征在于，包括下述エ序 将含氧或ニ氧化碳的气体提供给多孔质体，使培养液中产生体积基准的粒度分布中的.50%直径在200 μ m以下的气泡，使氧或ニ氧化碳溶解于所述培养液中而进行细胞或微生物的培养； 所述培养液中含有蛋白质水解物与用于保护细胞的细胞保护剂中的至少其一。
2.根据权利要求I所述的细胞或微生物的培养方法，其特征在于，所述培养液的表面张カ在51. 5dyne/cm以下。
3.根据权利要求I所述的细胞或微生物的培养方法，其特征在于，所述多孔质体的细孔径在50 μ m以下。
全文摘要
本发明的课题在于提供一种细胞或微生物的培养方法，其是在使氧或二氧化碳溶解在含有营养成分的培养液中而进行细胞或微生物培养之际，尽管稳定控制培养液的搅拌，也可使氧或二氧化碳迅速溶解于该培养液中。本发明所采用的解决手段是，将含氧或二氧化碳的气体提供给多孔质体(11)，使培养液(13)中产生体积基准的粒度分布中的50%直径在200μm以下的气泡(12)，同时使上述培养液(13)中含有作为添加剂的、蛋白质水解物与用于保护细胞的细胞保护剂中的至少其一。
文档编号C12N1/00GK102725392SQ20108005628
公开日2012年10月10日 申请日期2010年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者久木崎雅人, 奥村大成, 小岛秀藏, 沼田守, 田中智博, 田原直树, 长田靖久, 黑木奉至 申请人:宫崎县, 日挥株式会社