专利名称：一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法
技术领域：
本发明涉及废水处理微生物培养方法，具体为一种利用酒精废水发酵生产 印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法。
背景技术：
随着工业的发展，染料的需求量日益增加，印染和染料工业也随之发展起 来，同时也造成了环境的严重污染。目前全球染料的生产量很大(约百万吨)，
其中大约有10% 15%的染料会直接排放到环境中，此现象在我国更加严重，尤 其是工业发达地区。染料废水中含有的残存染料使水体的透明度下降，造成一 定的视觉污染，并且具有毒性，具有"三致"作用(致癌、致畸、致突变)，对于水 体环境造成强烈的破坏作用，不利于水体正常生态环境的保持。
染料废水通常通过物理或化学方法处理，主要包括吸附技术、混凝沉淀技 术、化学氧化法、离子交换技术、超滤膜技术、光催化技术、反向渗透技术等[1，2]。 但是这些技术的脱色效果不佳，处理时费用较高，并且处理废水的范围较窄， 有时还会产生大量难以处理的污泥。微生物处理的方法能够克服这些缺点，所 以现在众多学者把注意力转移到微生物上来，研究焦点也集中到微生物对染料 废水的处理上，目前已发现许多能脱色降解染料的微生物的报道。
在工业生产中使用的人工合成染料种类很多，按照结构主要分为偶氮染料、 蒽醌染料、硫化染料、靛旋染料、三苯甲烷、酞菁染料以及含有杂环结构的染 料等，其中生产量最大、最难降解的是偶氮染料，因此有关于偶氮染料的研究 也居于多数。
分子中含有偶氮基(一N-N—)的染料称为偶氮染料，其中有酸性、媒染、 活性/阳离子、中性染料、分散^料等，被广泛用于印染、纺织、印刷、制药等 行业。这些行业产生的废水具有排放量大，色度高，有机组分多，结构复杂和 含盐量高等特点，从而使其成为难以处理的工业废水之一，因此，对于此类染料 的脱色降解也成为现在工业上十分重要的问题，迫切需要解决。
印染废水高效脱色菌剂有多种专属脱色菌，可多种专属脱色菌组合在一起， 主要针对可溶性的偶氮类、蒽醌类、三苯甲烷类染料的脱色，可降解纺织印染 废水中的洗漆剂(LAS)、浆料(PVA辨染料的脱色产物(如苯胺)，可有效去除纺织 印染废水的染料和其他污染物。适用于棉、毛、丝等纺织印染行业废水的色度 和COD去除处理，在适配的处理工艺和构筑物中邀行接种挂膜，可有效处理色 度600—800倍、COD 2000 mg/L以下、pH中性的纺织印染废水，水力停留时 间8 12小时即可达标排放，同时几乎没有剩余污泥产生。基建投资和处理运 行费用可节省20%。
酒精废水含有还原糖、总糖、固形物等丰富的碳源，还有蛋白质、氨基酸、 维生素等，另外还有氮、磷、钾、钙、镁、纤维素等有机和无机物。每生产1 吨酒精排出13-15吨废液， 一间日产量20吨酒精的车间排出的废液相当与一个 30万人口的城市生活污水排放^排放程度。据估计，目前我国每日共排酒精废 水约21000吨，由于废水中污染物浓度高，含有类黑色素等物质，采用生化和 物化法难以脱色，目前大部分生产厂家尚无行之有效的处理措施，大部分生产 废水未加治理即排放入江湖，造成极大的污染，制约了生产的发展。因此，在 我国环境科技发展"九五"目标中，已将此类酿造行业废水列入需开发和完善的典型重点工业废水污染控制领域。瞎前，对于糖蜜酒业废水的治理主要有资 源化治理和直接处理两大类型。资源化治理是充分利用资源，减轻治理负担的 好方法。从发展趋势看，资源化治SI和污染治理技术相结合是酒精废水理想的 治理途径。
利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂，从本身意义上来 讲已经超越了低成本带来的经济利益， 一方面将工业'废水开发成高价值的生物 产品，对解决工业废水处置出路有重要的意义，另一方面更重要的是，阵低二
次污染，达到了以废治废的目的一 是辑家鼓,展韵环境保护技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用酒精废氷发酵生产印染废水染料专属生物 脱色菌剂的方法。酒精厂产生的废水含丰富的碳源、氮和无机盐，用于发酵生 产生物脱色菌成本低廉，生物脱色菌用来处理印染废水，达到以废治废的目的。
本发明具体技术方案如下
一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法，包括 以下步骤
a、 取印染厂废水池污泥，用玻璃珠打散，加100mL无菌水搅匀；
b、 各吸取5 mL加入富集培养基中，28 r静置富集培养3 d;
c、 而后过滤培养液，将滤渣点种于固体培养基上，28 。C培养3 d;
d、 用挖块法接种于染料浓度为30 mg丄—i培养液中，28 "C驯化培养5 d;
e、 再进行驯化富集培养2 3代；f、 选取有脱色的菌液，^^法接种于染料培养基上，28 。C培养3 5 d;
g、 挑取脱色圈周围的菌接种于相应的含50 mg丄—'染料培养液培养3 d;
h、 把脱色液接种到驯化的固体籍^基上，划线分离，经多次纯化，获单株脱色 菌；
i、 生物脱色菌种子扩大培养，将单株脱色菌接种到100ml灭菌细菌培养基中， 置30 °C,转速180r/min的摇床上通气培养24h;
j、发酵罐发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌，以稀释8倍的酒精废水为原 料，添加少量的淀粉4.0g/L，脲0.5g/L， KH2P042.0g/L， K^HP045.0g/L，50 mg'L—1 染料，PH调节至7.2，经121。C， 30min灭菌后，按1% 4% (w/w)的比例接种入 液体种子，于3(TC, 200r/min条件下，通气发酵72h后放罐。
一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法，生物 脱色菌富集培养基配方为酵母膏lg，蛋白胨2g，牛肉膏lg，葡萄糖10g，蒸馏 水1L， PH=7.0，生物脱色菌固体培养基配方为牛钩膏0.05%，蛋白胨0.1%， NaCl 0.05%， pH =7.0，生物脱色菌染料培养基是在固体培养基中加入染料成含染料
培养基。
一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法，生物 脱色菌种子扩大培养采用灭菌细菌培^基培养，配方为l: 2牛肉浸液2/3，蛋 白胨1%， NaCl 0.5%，蒸馏水1/3，染料50 mg'L-1， PH=7.2。
一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法，生物 脱色菌扩大培养采用灭菌培养基培养，配方是以稀释8倍的酒精废水为原料， 添加少量的淀粉4.0g/L，脲0.5g/L， KH2P042.0g/L，K2HP045.0g/L，50mgl/i染料， PH调节至7.2。 一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法，用发
酵罐发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌，是指用酒精废水稀释8倍后，添 加少量的碳、氮、磷及染料制成培养基，经I2TC, 3054n灭菌后，按1% 4%(w/w) 的比例接种入液体种子，于30。C， 200r/min条件下，通气发酵72h后放罐。
一种利用酒精废水发酵生产印染废水染l^专属生物脱色菌剂的方法，步骤i 中灭菌细菌培养基为，1: 2牛肉浸液2/3，蛋白胨1%, NaC10.59&,蒸馏水1/3， 染料50 mg丄一1， PH=7.2。
本发明提供的利用酒精^7jC发^^;产^^废水染料专属生物脱色菌剂的方 法，具有以下有益效果
本发明提供的生产原料是工业废水一酒精废水，来源多而易得。
以废水作为生物脱色菌剂的生产原料，为培养生物脱色菌提供营养，开发 成有价值的生物制品，有利于解决工业废水处置出路，对保护环境有重要意义。
酒精废水发酵生产的印染废水染料专属生物脱色菌用来处理印染废水，达 到了以废治废的目的。
图l为不同培养基培育脱色菌(LJH-801)对染料活性艳红K-2BP的脱色率 图2为不同培养基培养时间与染料的脱色率的关系 图3为不同培养基培养温度与染料的脱色率的关系
具体实施例方式
下面结合具体事实方式对本发明作进一歩说明。
具体实施例
(1)从四川启明印染厂、四川德阳润宝印染有限公司、四川绵阳南山印染 厂、四川华新砂洗厂等废水池中取一小块污泥，混合，用玻璃珠打散，加100 mL 无菌水搅匀，各吸取5mL加入富集培养基中，28 X:静置富集培养3 d，而后过 滤培养液，将滤渣点种于固体培养基上。28 'C培养3 d。用挖块法挖取菌丝体 连同少量培养基，转接到染料(活性艳红K-2BP)浓度为30 mg丄—i培养液中，. 28 "C驯化培养5 d，再进行驯化富集培养2 3代。选取有脱色的菌液，用涂布 法将O.lml菌悬液小心地滴在染料(活性艳红K-2BP)平板培养基表面中央位置 (O.lml的菌液要全部滴在培养基上，若移液管尖端有剩余的，需将移液管在培 养基表面上轻轻地按一下便可)。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将 菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，^Et分布均匀，然后改变方向沿另一垂 直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。28"C培养3 5d， 可以观察到脱色圈出现。挑取脱色圈厨围的菌接种于相应的含50mg'L—i染料(活 性艳红K-2BP)培养液培养3 d，可观察到有明显脱色现象。把脱色液接种到驯 化的固体培养基上，划线分离，经多次纯化^获单株脱色菌(LJH-801)。
(2)生物脱色菌种子扩大培养将单株脱色菌(UH-801)接种到100ml灭菌 细菌培养基中，(1: 2牛肉浸液2/3，蛋白胨1%， NaCl 0. 5%，蒸馏水1/3，染 料(活性艳红K-2BP) SOmgl/1, PH=7.2)，置30。C，转速180r/min的摇床上 通气培养24h，做液体种子。
(3)用酒精废水和玉米粉培养基发酵生产生物脱色菌剂的比较试验， A. 以稀释8倍的酒精废水为原料，添加少量的淀粉4.0g/L，脲0.5g/L， KH2P042. 0 g/L， K2HP045.0 g/L，50 mgl^染料(活性艳红K-2BP)， PH调节至7.2。
B. 用玉米粉培养基作原料:玉米，1%，黄豆饼粉0.5%，酵母菌0.15%， 蛋白胨0.05%， KH2P040.75%， CaCO30.05%， MgSO40.035%， 50 mg丄—!染料(活 性艳红K-2BP) PH=7*2。
比较试验方法取两种培养基各IOO扱I分装于500ml三角瓶中，经121。C， 30min灭菌后，按29&接种入生l^rg菌(UH-801)种子菌液，于置30 °C，转速 180r/min的摇床上通气培养72h。
检验方法
脱色试验用紫外分光光度计对活性艳红K-2BP进行波长扫描,获得染料在可 见光范围内的最大吸光度。经上述试验培养进行脱色， 一定时间后,将该菌种培 养物高速离心分离,取上层清液,用紫外分光^fe度计测出可见光范围内的最大吸 光度,与不接种菌体的染料溶液进行对比,计算脱色率。以脱色率表示菌株对染料 的脱色能力
脱色率-(A-B)/Ax 100%
式中:A---不接种菌液的最大吸光光度；
B---接种过菌液的染料溶液的最大吸光光度。
结果与分析
a.用酒精废水和玉米粉培养基发酵生产生物脱色菌剂(LJH-801)对染料活性艳红 K-2BP进行脱色试验，降解72h，染料的脱色率测试结果见图1 b.用酒精废水和玉米粉培养基发酵生产生物脱色菌剂(UH-801)的培养时间对 染料活性艳红K-2BP脱色的影响见图2
由图2可以看出,在培养菌脱色24h后,脱色率为13.6。/o和15.2%,48h后为 18.65%和24.53%,孰60h后脱色率增长到37.2<%和40.25%,72h都达到最大 值;继续培养脱色,到96h和108tv后,脱色率有所下降,但下降趋势不太明显。这是 微生物生长分四个时期的体现:延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。当菌种接到新 鲜培养基中后,一般不立即生长繁殖,而是要经过一段时间的调整和适应,于是出现 了延滞期。
当菌体通过延滞期的准备,微生物适应了新的环境,其生长为对数期,进入大量 繁殖的时期。此时菌种迅速分裂,使菌量呈几何级数增加。对数期时间最短,细胞生 长速度最高,代谢活力最强。经过^f数期的生长,由于营养消耗、供应不足与代谢产 物的积累,会有一部分菌死亡r于是菌体进入了稳定生长时期,也是上菌量的最高峰。 实际上细菌生长量达到了动态平衡,即一部分死亡,一部分继续分裂,死亡与新生的 菌数相等。随着时间的继续延长,由于营养缺乏和代谢产物积累造成的自身中毒,使
细胞生长受阻,死亡率明显增力n,时间与菌数的对数成反比,这时菌株的生长进入衰
亡期。菌株的生长和对染^l"的脱色是同步的。随着脱色菌的生长脱色率逐步提高， 到72h时菌体的生长量达到了最大值成时脱色率也最高;72h后,脱色菌的生长量 下降,脱色率也有所降低。由此可见,72tr菌体的脱色效果最好。
C.用酒精废水和玉米粉培养基发酵生产生物脱色菌剂(LJH-801)的培养温度 对染料活性艳红K-2BP脱色的影响见图3 .
由图3可以看出,在温度30 32X:时,菌株对染料的脱色率为48.25%和 53.26% 61%和67.05%;当温度到达4CTC时,脱色率只有3.1%和4.3%。这 可能是由于温度过高,使该菌的酶系统遭到破坏,导致该菌活性下降甚至死亡,而使脱色能力大大下降。从图3可以看出,温度从25。C 32'C,脱色率从30.35%和 31.28%提高到61%和67.05%;而从32。C 40。C,脱色率从61%和67.05%变 化到3.1%和4.3%,其间的跨度要远远大于—25t;到32'C的温度变化范围。说明了 菌体生长在低于最适温度的低温区范围较宽,而在高于最适温度的高温区范围要窄 得多,在最适温度的两侧呈不对称分布。所以,该脱色菌在32-C时脱色能力达到最好, 即32'C为该脱色菌对染料脱色的最适温度。
活菌计数测定取lml发酵液样品与9ml无菌蒸馏水中作系列稀释，取O. lml 适当稀释度的菌悬液涂布细菌平板，于28'C，培养24h，计数平板上的菌落数。 结果与分析
3.用酒精废水培养基发酵生产生物脱色菌剂(LJH-801)，菌数达4.5乂109个/1111。 b.用玉米粉培养基发酵生产生物JK色lT剂ajH-801)，菌数达4.8Xl()g个/m]。
(4)用酒精废水为原料配制的培养基通过7—70L发酵罐发酵生物脱色菌 (LJH-801):将4L细菌液体培养基装入7L种子罐中，121°C， 30min灭菌，将100ml 液体种子接种入种子罐中，培养24h，取2L液体种子移种入装有50L的酒精废水为 原料配制的培养基的70L发酵罐(已I21T)， 30min灭菌备用)中，温度控制在30 °C，转速200r/min，通气量40L/min，罐压控制在0. 02~0. 03Mpa，发酵72h即可放
综合比较，在玉米粉培养基中发酵生产生物脱色菌数比在酒精废水培养基中发 酵生产的略高，但两者没有显著性差异，都在109个/ml同一数量级，且两者在染料 脱色率方面也都同样出色。这表明了利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物 脱色菌剂的方法是可行的。
权利要求
1、一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法，其特征在于包括以下步骤a、取印染厂废水池污泥，用玻璃珠打散，加100mL无菌水搅匀；b、各吸取5mL加入富集培养基中，28℃静置富集培养3d；c、而后过滤培养液，将滤渣点种于固体培养基上，28℃培养3d；d、用挖块法接种于染料浓度为30mg·L-1培养液中，28℃驯化培养5d；e、再进行驯化富集培养2～3代；f、选取有脱色的菌液，涂布法接种于染料培养基上，28℃培养3～5d；g、挑取脱色圈周围的菌接种于相应的含50mg·L-1染料培养液培养3d；h、把脱色液接种到驯化的固体培养基上，划线分离，经多次纯化，获单株脱色菌；i、生物脱色菌种子扩大培养，将单株脱色菌接种到100ml灭菌细菌培养基中，置30℃，转速180r/min的摇床上通气培养24h；j、发酵罐发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌，以稀释8倍的酒精废水为原料，添加少量的淀粉4.0g/L，脲0.5g/L，KH2PO4 2.0g/L，K2HPO4 5.0g/L，50mg·L-1染料，PH调节至7.2，经121℃，30min灭菌后，按1％~4％(w/w)的比例接种入液体种子，于30℃，200r/min条件下，通气发酵72h后放罐。
2、根据权利要求1所述的一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱 色菌剂的方法，其特征在于所述的富集培养基配方为酵母膏lg，蛋白胨2g， 牛肉膏lg，葡萄糖10g，蒸馏水1L， PH二7,0，生物脱色菌固体培养基配方为牛 肉膏0.05%，蛋白胨0.1%, NaCl 0.05%， pH=7.0，生物脱色菌染料培养基是在 固体培养基中加入染料成含染料培养基。
3、 根据权利要求1所述的一种利甩酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱 色菌剂的方法，其特征在于所述的脱色菌种子扩大培养采用灭菌细菌培养基 培养，配方为1: 2牛肉浸液2/3,蛋白胨1%， NaCl 0.5%，蒸馏水1/3，染料 50 mg.L—、 PH=7.2。
4、 根据权利要求1所述的一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱 色菌剂的方法，其特征在于所述的生物脱色菌扩大培养采用灭菌培养基培养， 配方是以稀释8倍的酒精废水为原料，添加少量的淀粉4.0g/L，脲0.5 g/L， KH2P042. 0 g/L， K2HP04&. 0 g/L，50 mgl^染料，PH调节至7.2。
5、 根据权利要求1所述的一种利甩酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱 色菌剂的方法，其特征在于所述的用发酵罐发酵生产印染废水染料专属生物 脱色菌，是指用酒精废水稀释8倍后，添加少量的碳、氮、磷及染料制成培养 基，经121°C， 30min灭菌后，按1% 4% (w/w)的比例接种入液体种子，于30 °C， 200r/min条件下，通气发酵72h后放罐。
6、 根据权利要求1所述的一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱 色菌剂的方法，其特征在于所述的步骤i中灭菌细菌培养基为，1: 2牛肉浸 液2/3，蛋白胨1%， NaCl 0.5%,蒸馏水1/3，染料50 mg丄1， PH=7. 2。
全文摘要
本发明涉及废水处理微生物培养方法，具体为一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法。一种利用酒精废水发酵生产印染废水染料专属生物脱色菌剂的方法，包括取污泥、富集培养、过滤培养液、挖块法接种、驯化富集培养等步骤。以废水作为生物脱色菌剂的生产原料，为培养生物脱色菌提供营养，开发成有价值的生物制品，有利于解决工业废水处置出路，对保护环境有重要意义。
文档编号C02F3/34GK101338289SQ20081004588
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者尹家亮, 龙吉海 申请人:龙吉海