专利名称：一种产油微生物的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种产油微生物的培养方法，属于生物技术领域。更具体地讲，是直接利用碳水化合物聚合物为培养基的碳源，在水解酶存在下培养产油微生物，实现将碳源转化为贮存在细胞内的油脂。该油脂含有一种或多种长链脂肪酸及其衍生物，可用于制备生物柴油、功能性油脂或其他高附加值产品。
背景技术：
某些酵母、霉菌、细菌和藻类等在一定条件下，能够以碳水化合物、碳氢化合物等为碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内油脂积累超过细胞干重20%的微生物称为产油微生物(Ratledge C,ffynn JP Adv Appl Microbiol, 2002, 51:1-52)。某些产油微生物的甚至可以积累超过其细胞干重的70%的微生物油脂。微生物油脂，尤其是酵母产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，以C14-C22长链脂肪酸为主。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，被认为是很有潜力的新型油脂资源。因此，微生物油脂不仅可能作为食用油或其他功能性油脂的替代品，还可能在可再生液体燃料生物柴油产业发展中发挥重要作用(赵宗保.中国生物工程杂志，2005，25 (2):8-11)。产油微生物培养的碳源通常是水溶性有机化合物。利用蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、纤维二糖、甘油、水溶性低聚果糖(菊粉)、乙醇等培养产油微生物，已有文献报道(Ageitos JM, et al.Appl Microbiol Biotechnol.2011,90:1219-1227)。常见的生物质，如木材、作物秸杆、农作物种子、农作物营养块茎等，含有大量碳水化合物聚合物。由于聚合度较高，它们一般不溶于水。因此，通常采用各种技术手段，首先将碳水化合物聚合物降解为水溶性化合物，再利用微生物转化制备包括油脂在内的各种代谢产物。特别地，将木质纤维素降解为可发酵性糖，然后利用这些可溶性的糖类混合物为碳源积累油脂已见诸报道。发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans利用脱毒的稻草烯酸水解液发酵,8天后,菌体油脂含量达到 40.1% ( Huang C，et al.Bioresour Technol, 2009,100(19):4535-4538)；利用产油酵母Cryptococcus curvatus对麦杆烯酸水解液发酵,菌体油脂含量为35.5%。利用油脂酵母Lipomyces starkeyi对麦杆烯酸水解液发酵,菌体油脂含量达到31.2% (YuXC, et al.Bioresour Technol, 2011，102:6134-6140)。采用固态发酵模式，可以将生物质原料直接转化为油脂。如，用经气爆预处理的麦杆为原料，培养一种可分泌纤维素酶的植物内生真菌，在额外添加10FPU/g底物的纤维素酶条件下，通过10天发酵，油脂得率为80mg/g干物质(Peng Xff, Chen HZ.BioresourTechnol.2008,99:3885-3889)。在优化条件下，米曲霉 Aspergillus oryzae A-4 转化麦杆生产微生物油脂，培养6天后油脂得率为62mg/g干物质(Lin H, et al.BioresourTechnol.2010,101:7556-7562)。上述例子中，微生物虽然同时具备生产纤维素酶和积累油脂的功能，然而其产酶能力低，酶水解效果差，且采用固态发酵模式，发酵周期长，转化率低，油脂产量低。
由于现有产油微生物培养技术利用水溶性有机化合物为主要碳源，原料成本高，整体效率低，难以规模化生产。因此，研究发展新技术，拓展产油微生物培养的碳源，具有重要意义。
发明内容
直接利用碳水化合物聚合物为碳源，培养产油微生物，有可能大幅度降低原料成本，简化操作工艺，提高效率，改善微生物油脂的技术经济性。因此，发明人对产油微生物的培养条件进行了研究，发现纤维素悬浮液和纤维素酶共存的环境中，加入产油微生物活菌体、孵育一定时间后，细胞内可以积累大量油脂，并且纤维素同时被消耗。进而，发明人对培养条件进行了优化。基于上述发现，本发明提出一种产油微生物的培养新方法，其特征在于培养基的碳源为碳水化合物聚合物，并且培养基中存在水解碳源的酶，产油微生物接种量为0.05 0.50克干菌体/克碳水化合物聚合物，培养温度20 45°C，pH 3 7，通空气液体悬浮培养。该方法使产油微生物培养直接以生物质为原料，提高微生物油脂生产的技术经济性，具有广阔应用前景。该方法获得的微生物油脂含有一种或多种脂肪酸及其衍生物，可用于制备生物柴油或其他高附加值产品。本发明通过下述技术方案实现:1、制备产油培养基。将碳水化合物聚合物或含有碳水化合物聚合物的材料、碳水化合物聚合物水解酶和水混合，制成悬浮液，为产油培养基。2、制备产油微生物种子。采用营养相对丰富的培养基，在20 37°C，pH 3 8，通气培养产油微生物，培养结束后，采用离心分离或过滤的方法收集湿菌体，得到产油微生物活细胞，为产油微生物种子。3、培养产油微生物积累油脂。将产油微生物种子按相当于0.05 0.5克干菌体/克碳水化合物聚合物的接种量添加到产油培养基中，在20 45°C，pH 3.0 7.5，通气培养，当培养基中碳源含 量低于5g/L时,终止培养。4、生物量和油脂量的测定。参照文献(Li YH, et al.Enzyme Microb Technol,2007,41 =312-317)的方法，发酵液经离心、洗涤，收集沉淀。沉淀在105°C干燥至恒重，参照文献(Updegraff DM.Anal Biochem, 1969, 32:420-424)的方法,测定发酵液中残留的纤维素，计算得到生物量；参照文献(李植峰，等.微生物学通报，2001，28 ￠):72-75)使用酸热-有机溶剂法抽提获得油脂，计算菌体油脂量。本发明制备产油微生物种子参照常用的微生物培养方法，使用营养丰富、有利于菌体快速增殖的培养基。在菌体增殖阶段后期，在波长600纳米处测量发酵醪液的光吸收，即得到0D600nm值，采用离心或膜过滤的方法从发酵醪液中分离收集产油微生物细胞。发酵醪液在800g以上的离心力作用下离心，得到湿菌体；发酵醪液也可用孔径小于5um的膜过滤,得到湿菌体,用于接种产油培养基。接种时依据产油培养基的体积和液体种子后期的0D600nm值,可以计算得到接种密度。本发明所适用的碳水化合物聚合物为纤维素、半纤维素、木聚糖、淀粉、主要成份为纤维素和半纤维素的生物质材料、主要成份为淀粉的生物质材料或者它们中几种的混合物。其中主要成份为纤维素和半纤维素的生物质材料为玉米秸杆、麦杆、稻草、甘蔗渣、玉米芯、林业生产下脚料、松木、云杉中的一种或二种以上组合；主要成份为淀粉的生物质材料为玉米、稻谷、高粱、小麦、大麦、木薯、甘薯中的一种或二种以上组合。本发明所述水解碳源的酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶、生淀粉糖化酶、淀粉酶、糖化酶的一种或它们的必要组合。其中，纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖苷酶、淀粉酶和糖化酶从宁夏和氏璧生物技术有限公司购得，比活力分别为5万U/g、120万U/g、15万U/g、120万U/g、3万U/g和3万U/g。生淀粉糖化酶参照文献方法(李或娜，等.应用与环境生物学报，2010，16(5):714-718)制备，比活力为8万U/g。在活力测试条件下，Ig酶制剂水解碳水化合物聚合物施放出相当于Img葡萄糖的还原糖量，定义为I个酶活力单位(U)。本发明每克碳水化合物聚合物添加酶活力为5 100U的碳水化合物聚合物的水解酶，使聚合物在培养过程中水解成可被产油微生物利用的产物。依据碳水化合物聚合物材料的理化性质和产油微生物的性状特征，本发明制备产油培养基可使用多种酶制剂的组合。例如，以预处理过的秸杆为碳源时，为了更好地利用碳源，需要同时使用纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶和葡萄糖苷酶。本发明所述产油微生物液体培养基除含有碳水化合物聚合物和水解酶制剂外，还可含有其他微生物培养常用营养物质，其他微生物培养常用营养物质包括质量为碳源总质量0.1 % 20%的氮源、质量为碳源总质量0.01 % 15%的磷源、或质量为碳源总质量
0.01% 5%的硫源或它们中的二种或三种的组合。本发明所述的氮源为铵盐及经在水溶液中可释放形成铵离子的物质。本发明所述的磷源为磷酸盐及经水解可释放出磷酸根的物质。本发明所述产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20%的真核微生物，它们包括但不限于，油脂酵母，如斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi ;红酵母,如圆红冬抱酵母Rhodosporidi um toruloides、粘红酵母Rhodotorula glutinis和掷抱酵母Sporobolomyces roseus ;丝抱酵母，如皮状丝抱酵母Trichosporon cutaneum和发酵性丝抱酵母Trichosporon fermentans ;隐球酵母，如白色隐球酵母Cryptococcus albidus和弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ;霉菌，如伯顿拟内抱霉Endomycopsis burtoni1、健强地霉 Geotrichum robustum、深黄被抱霉 Mortierella isabellina 和卷枝毛霉 Mucorcircinelloides ;产油细菌中的棒杆菌Croynebacterium、诺卡菌Nocardia和红球菌Rhodococcusο这些菌株可以直接从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)或中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可使用与原菌株性状不同的人工或自然突变菌株。本发明所述的微生物油脂主要为长链脂肪酸及其衍生物的甘油酯。参照文献(LiuB,Zhao Z B.J Chem Technol Biotechnol, 2007,82 (8):775-780)的方法，直接利用产油微生物菌体为原料，可在酸催化条件下转酯化制备生物柴油；或参照文献(里伟，等.过程工程学报，2007,7(1):137-140)的方法，利用提取的微生物油脂，可在酶催化条件下转酯化制备生物柴油。本发明所述的微生物油脂还可用于制备其他高附加值产品或油脂化工产品。本发明的有益效果是:I)本发明直接利用碳水化合物聚合物进行油脂发酵，为培养产油微生物并制备微生物油脂提供了一种新方法；
2)与将碳水化合物聚合物首先降解为可发酵性糖，再培养产油微生物的传统技术相比，本发明将碳水化合物聚合物的酶解糖化和油脂发酵过程耦合，简化了工艺，提高了酶解和发酵效率；3)木质纤维素资源水解得到以葡萄糖和木糖为主的混合糖水解产物，而产油微生物利用混合糖发酵时，往往存在葡萄糖效应，发酵周期长，木糖利用率低。本发明直接利用木质纤维素进行油脂发酵，水解和发酵同时进行，培养基中无水溶性糖积累，避免了葡萄糖效应，纤维素和半纤维素均得到有效利用，提高了资源利用度，底物对油脂的转化率高。4)由于本发明碳水化合物聚合物酶解糖化释放的产物迅速被产油微生物利用，避免了水解产物对水解酶的抑制，酶活力维持时间长，因此，酶用量少；而且，由于培养过程条件温和，含酶的发酵上清可重复利用。因此，本发明不仅可降低酶成本，还可减少废水排放。5)木质纤维素资源在预处理过程中不可避免的产生许多抑制剂，如糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、乙酰丙酸、对羟基苯甲醛、丁香醛和香兰素等，它们对产油微生物的生长繁殖有着显著的抑制效果，从而影响发酵效果。乙酸、甲酸、糠醛和香兰素对产油酵母的发酵具有较强的抑制作用(Chen X, et al.Appl Biochem Biotechnol, 2009,159:591-604) ;lmM的糖醒及其衍生物对产油酵母Rhodosporidium toruloides Y4的生长抑制了 45% (Hu CM, etal.Bioresour Technol, 2009,100 =4843-4847);对玉米秸杆经过生物脱毒后培养产油酵母Trichosporon cutaneum CXl,油脂含量显著提高(Huang X, et al.Bioresour Technol,2011，102 =9705-9709)。传统的油脂发酵必须对预处理过程中产生的抑制性化合物进行脱毒处理。本发明中产油微生物种子接种量较大，菌体基本不增殖，主要进行油脂积累，油脂积累阶段，菌对抑制剂耐受性强，可不对预处理过的木质纤维素原料进行脱毒处理。6)本发明由于产油微生物种子接种量较大，发酵培养基中可溶性有机物浓度低，培养过程中无水溶性糖积累，杂菌难以生长。因此，发酵培养基不需灭菌处理，可简化工艺，降低生产成本。
总之，本发明将碳水化合物聚合物转化为微生物油脂，总体上具有工艺流程简短、原料利用效率高、油脂得率高、成本低的技术优势，可显著改善微生物油脂的技术经济性，对生物能源产业和生物炼制具有重要意义。
具体实施例以下实施例选取了应用典型碳水化合物聚合物为材料培养典型产油微生物的例子，有助于了解本专利，但不以任何形式限制将本发明应用于其他材料或产油菌株。对比例I(I)发酵培养基:将纤维素40g/L、纤维素酶320U/L和葡萄糖苷酶600U/L的悬浮液在 pH 4.8、501:酶水解7211，调整？!1 5.5。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30°C培养24h，将培养液于8000rpm离心5min，得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 15 (相当于干菌体0.27g/L)，在30°C下通空气培养52h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，确定干菌体含量为13.5g/L，发酵液中残糖为3.lg/L。参照文献(李植峰等.微生物学通报，2001，28 (6):72-75)使用酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂6.5g/L，菌体油脂含量为48.1%。实施例1(I)发酵培养基:于水中，纤维素40g/L，纤维素酶320U/L，葡萄糖苷酶600U/L，pH
5.2o(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30°C培养24h，离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 15 (相当于干菌体0.27g/L)，在37°C下通空气培养52h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀测纤维素含量，确定干菌体含量为13.2g/L，残留纤维素1.9g/L。参照文献(李植峰等.微生物学通报，2001，28 ￠):72-75)使用酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂7.6g/L，菌体油脂含量为57.6%。比较对比例I和实施例1的结果发现，使用质量相等的碳水化合物聚合物和活力相同的酶制剂，按本发明的技术方案油脂产量提高了 19%。更重要的是，对比例I为了获得葡萄糖，将纤维素在pH 4.8、50°C下酶水解72h ;而实施例1则完全免除了该水解过程。因此，同以对比例I为代表的现有技术方案比，本发明具有提高油脂产量和生产效率、降低成本、减少设备投资的显著优势。
实施例2(I)发酵培养基:于水中，纤维素50g/L，磷酸二氢钾7g/L，磷酸氢二钠0.5g/L，纤维素酶 750FPU/L, pH 4.8。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Rhodosporidium toruloides AS 2.1389 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，30°C通气培养24h,于8000rpm离心5min,得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 10 (干菌体0.18g/L)，在34°C下通空气培养72h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀测纤维素含量，确定干菌体含量为12.9g/L，残留的纤维素9.2g/L。按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂8.3g/L，油脂含量为64.3%。实施例3(I)发酵培养基:于水中，甘薯淀粉30g/L，硫酸铵1.0g/L,生淀粉糖化酶900U/L，pH 3.0。(2)种子制备:PDA液体培养基中，接入卷枝毛霉Mucor circinelloides AS
3.2208 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，28°C通气培养24h，离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤⑴所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 10 (干菌体0.18g/L)，在40°C下通空气培养60h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，确定干菌体含量为8.9g/L。按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂5.0g/L,油脂含量为56.1%。实施例4(I)发酵培养基:于水中，纤维素30g/L，酵母粉0.01g/L，纤维素酶3000FPU，pH
5.5o(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 5.5，121。。灭菌20min后,粘红酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，26°C，200rpm振荡培养28h，膜过滤得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 42 (干菌体0.75g/L)，在40°C下通空气培养24h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，确定干菌体含量为20.9g/L。按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂5.2g/L，油脂含量为24.9%。
实施例5(I)发酵培养基:于水中，木聚糖36g/L，酵母粉1.0g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，木聚糖酶 180U/L, pH 7.5。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Trichosporon cutaneum AS 2.571 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，30°C通气培养20h，将培养液于8000rpm离心5min，得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤⑴所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 5 (干菌体0.09g/L)，在30°C下通空气培养36h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀测纤维素含量，确定干菌体含量为8.4g/L，残留木聚糖4.2g/L。按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂4.lg/L，油脂含量为48.8%。实施例6(I)发酵培养基:于水中，纤维素120g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氢钾7.0g/L，磷酸氢二钠2.0g/L,纤维素酶7200U/L，葡萄糖苷酶1200U/L，pH 5.0。(2)种子制备:在麦芽汁液体培养基中接入掷孢酵母Sporobolomyces roseus IAM13481 (购自日本JCM菌株保藏中心)，25°C通气培养24h，离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向1.0L步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 40 (干菌体15.6g/L)，在28°C，通空气量0.8vvm下培养84h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀测纤维素含量，确定干菌体含量为36.7g/L，残留的纤维素2.9g/L。按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂19.7g/L，油脂含量为53.7%。实施例7(I)发酵培养基:于水中，纤维素40g/L，重悬于实施例1步骤(4)菌体分离后的含酶发酵上清中，调PH 5.2。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30°C通气培养24h，离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 20 (干菌体0.36g/L)，在37°C下通空气培养66h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀测纤维素含量，确定干菌体含量为15.lg/L，残留的纤维素6.2g/L。按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂7.2g/L，油脂含量为47.7%。本实施例的结果表明，碳水化合物聚合物的水解酶可以回收重复利用。这是因为，油脂积累培养阶段条件温和，有利于酶活力保持。实施例8(I)发酵培养基制备:参照文献(Zhang J, et al.Bioresour Technol, 2011,102:4480-4488)，以稻草为原料，洗净，干燥，粉碎过60目筛，并用2.5%的硫酸浸溃18h，190°C蒸汽处理3min后，冷却至50°C时,加水至固形物浓度为80g/L,调pH 5.2,加入纤维素酶1000U/L,木聚糖酶800U/L，得到发酵培养基。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Lipomyces starkeyi AS 2.1560 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，25°C通气培养40h，将培养液于8000rpm离心5min，得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 15 (干菌体0.27g/L)，在30°C下通空气培养80h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂8.3g/L。实施例9(I)发酵培养基制备:参照文献(Krishnan C, et al.Biotechnol Bioeng, 2010,107:441-450)，以云杉为原料，洗净，干燥，粉碎过60目筛，2: I (w/w)的氨水和云杉，140°C氨膨胀处理30min，冷却至50°C时，加水至固形物浓度为50g/L，调pH 4.8，加入纤维素酶600U/L，木聚糖酶500U/L，葡萄糖苷酶300U/L。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖80g/L，尿素3g/L，酵母粉lg/L，磷酸氢二钾 lg/L, 121°C灭菌 15min 后，接入 Mortierella isabellina AS 3.3410 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，25°C, 200rpm振荡培养36h,离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 10 (干菌体0.2g/L)，在30°C下通空气培养52h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂6.lg/L。对比例2(I)发酵培养基制备:参照文献(Kim S, et al.Bioresour Technol, 2005,96:1994-2006),以玉米稻杆为原料,洗净,干燥,粉碎至2.5mm,按0.073g/g干稻杆添加氢氧化钙后混匀，于55°C通气处理4周，脱除80%以上的木质素后，加水至固形物浓度为70g/L，调pH 4.8，加入纤维素酶1050U/L，木聚糖酶700U/L，葡萄糖苷酶300U/L，于50°C条件下酶水解72h，得到水解液中葡萄糖 为32g/L，木糖为14g/L。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，28°C通气培养24h,于8000rpm离心5min,得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤⑴所述步骤⑴所述水解液中添加步骤⑵所得菌体至接种密度达到0D600nm = 15 (干菌体0.29g/L)，在30°C下通空气培养65h，发酵结束时葡萄糖为1.5g/L，木糖为8g/L。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂6.9g/L。实施例10(I)发酵培养基制备:参照文献(Kim S, et al.Bioresour Technol, 2005,96:1994-2006),以玉米稻杆为原料,洗净,干燥,粉碎至2.5mm,按0.073g/g干稻杆添加氢氧化钙后混匀，于55°C通气处理4周，脱除80%以上的木质素后，加水至固形物浓度为70g/L，调pH 4.8，加入纤维素酶1050U/L，木聚糖酶700U/L，葡萄糖苷酶300U/L。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，28°C通气培养24h,于8000rpm离心5min,得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 15 (干菌体0.29g/L)，在37°C下通空气培养65h。发酵65h后培养基中检测不到葡萄糖，木糖为0.8g/L。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂8.lg/L。比较对比例2和实施例1 0的结果发现，使用质量相等的玉米秸杆和活力相同的酶制剂，按本发明的技术方案油脂产量提高了 17%。对比例2将处理过的玉米秸杆在pH 4.8、50°C下酶水解72h，水解液中葡萄糖和木糖浓度分别为32g/L和14g/L，在产油培养阶段，木糖利用速度慢，发酵65h后残留木糖为8g/L。实施例9由于将水解和发酵过程耦合，免除了单独的水解工艺；更重要的是，发酵65h后培养基中未检测到葡萄糖，木糖为0.8g/L，说明本发明的技术方案显著提高了碳源利用率。因此，本发明具有提高碳源利用率、油脂产量和生产效率的显著优势。实施例11(I)发酵培养基制备:参照文献(Tucker MP, et al.Appl Biochem Biotechnol,2003，105:165-178),以锯末为原料，洗净，干燥，粉碎过80目筛，用0.98%的硫酸浸溃4h，然后自然风干至含水量50% (w/w)，硫酸浓度达到1.0%，190°C处理90s后，冷却至50°C时，加水至固形物浓度为100g/L，调pH 4.5，加入纤维素酶1500U/L，木聚糖酶500U/L。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉20，蛋白胨10，pH 5.5，121。。灭菌20min后,粘红酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，30°C, 200rpm振荡培养28h,于8000rpm离心5min,得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤⑴所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 24 (干菌体0.42g/L)，在35°C下通空气培养72h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂9.lg/L。
实施例12(I)发酵培养基制备:于水中，粉碎玉米30g/L，高温灭菌，待温度冷却至30°C时，加入淀粉酶450U/L，糖化酶300U/L，调pH 6.5。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉20，蛋白胨10，ρΗ 5.5，121。。灭菌20min后，白色隐球酵母Cryptococcus albidus ATCC56298 (购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，22°C, 200rpm振荡培养28h，离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 10 (干菌体0.22g/L)，在20°C下通空气培养48h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂5.4g/L。实施例13(I)发酵培养基制备:于水中，40g/L粉碎的木薯，高温灭菌，待温度冷却至40°C时，加入淀粉酶800U/L，糖化酶400U/L，调pH 7.0。(2)种子制备:菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集:MSM基本培养基，以糖蜜作为碳源，121°C灭菌15min后,接入不透明红球菌Rhodococcus opacus Η)630 (德国微生物菌种保藏中心)，30°C通气培养20h，将培养液于IOOOOrpm离心15min，得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤⑴所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 13 (干菌体0.25g/L)，在45°C下通空气培养40h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂5.lg/L。实施例14(I)发酵培养基制备:参照文献(Krishnan C, et al.Biotechnol.Bioeng.2010,107:441-450)，以甘蔗渣为原料，粉碎过20目筛，加水成150% (w/w)甘蔗渣，按2: l(w/w)混合氨水和甘蔗渣，140°C氨膨胀处理30min，冷却至50°C时，调整至固形物浓度为70g/L，调pH 5.3，加入纤维素酶3500U/L，木聚糖酶300U/L，葡萄糖苷酶2100U/L。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖80，尿素3，酵母粉1，磷酸氢二钾1，121°C灭菌15min后,接入健强地霉Geotrichum robustum CICC 1256 (购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，28°C振荡培养24h，离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向1.0L步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 45 (干菌体16.2g/L)，在34°C下，通空气培养，通气量1.0vvmJt甘蔗渣的量降至2g/L以下，分3次补加120g预处理过的甘蔗渣，到142h发酵结束；(4)油脂提取:步骤⑶所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂15.7g/L。实施例15(I)发酵培养基制备:参照文献(Zhang J, et al.Bioresour Technol, 2011,102:4480-4488)，以稻草为 原料，洗净，干燥，粉碎过60目筛，并用2.5%的硫酸浸溃18h，190°C蒸汽处理3min后，加水至固形物浓度为80g/L，参照文献(汤琪.重庆交通大学学报，2008，27(1):148-151)的方法对预处理过的稻草进行脱磷处理后，使磷源含量降至碳源总质量的0.1 %以下，冷却至50°C时，调pH 5.2，加入纤维素酶1000U/L，木聚糖酶2400U/L。
(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Lipomyces starkeyiAS 2.1560 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，30°C通气培养40h，离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤⑴所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 15 (干菌体0.27g/L)，在30°C下通空气培养80h。(4)油脂提取:步骤⑶所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂8.7g/L。实施例16(I)发酵培养基制备:参照文献(Kim S, et al.Bioresour Technol, 2005,96:1994-2006),以玉米稻杆为原料,洗净,干燥,粉碎至2.5mm,按0.073g/g干稻杆添加氢氧化钙后混匀，于55°C通气处理4周，脱除80%以上的木质素后，加水至固形物浓度为70g/L，参照文献(李柱，等.天然气化工.2009，(34):24-26)采用化学沉淀法对原料进行脱氮处理后，使氮源含量降至碳源总质量的0.1 %以下，冷却至50°C时，调pH 4.8,加入纤维素酶1400U/L，木聚糖酶 1400U/L。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (购自美国典型微生物菌种保藏管理中心),28°C通气培养24h，离心收集湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤(I)所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 15 (干菌体0.29g/L)，在37°C下通空气培养72h。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂8.3g/L。
实施例17(I)发酵培养基制备:参照文献(Tucker MP, et al.Appl Biochem Biotechnol,2003，105:165-178),以玉米株(包括玉米、玉米芯和玉米秸杆等)为原料，洗净，干燥，粉碎过40目筛，用0.98%的硫酸浸溃4h，然后自然风干至含水量50% (w/w)，硫酸浓度达到1.0%，190°C处理90s后，冷却至50°C时，加水至固形物浓度为80g/L，调pH 4.8，加入纤维素酶1600U/L，木聚糖酶800U/L，淀粉酶800U/L，糖化酶400U/L。(2)种子制备:培养基组成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。灭菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，28°C通气培养24h,于8000rpm离心5min,得到湿菌体。(3)油脂积累培养:向50mL步骤⑴所述发酵培养基中添加步骤(2)所得菌体至接种密度达到0D600nm = 15 (干菌体0.29g/L)，在35°C下通空气培养80h。发酵80h后培养基中检测不到葡萄糖和木糖。(4)油脂提取:步骤(3)所得发酵液离心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸热-有机溶剂法提取油脂，得到油脂9.0g/L。实施例18参照文献(LiYH, et al.Enzyme Microb Technol, 2007,41:312-317)的方法，从实施例1获得菌体中提取微生物油脂。参照文献(里伟，等.过程工程学报，2007，7(1)，137-140)的方法，取0.3g油脂在酶催化条件下转酯化制备和纯化生物柴油，得到0.28g，生物柴油收率93%，所得生物柴油的辛烷值为58，适合作为柴油的替代品。实施例19参照文献(LiuB, Zhao Z B.J Chem Technol Biotechnol, 2007,82 (8):775-780)的方法，以实施例6获得的干物质2.0g为材料，制备生物柴油，得生物柴油1.0g,收率为94%，所得生物柴油的辛烷值 为57，适合作为柴油的替代品。
权利要求
1.一种产油微生物的培养方法,其特征在于:以碳水化合物聚合物为液体培养基的碳源，按每克碳水化合物聚合物添加酶活力为5 IOOU的碳水化合物聚合物的水解酶和干菌体质量为0.05 0.50克的产油微生物活菌体，在温度20 45°C，pH 3.0 7.5，通空气条件下，液体悬浮培养。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于:所述碳水化合物聚合物为纤维素、半纤维素、木聚糖、淀粉、主要成份为纤维素和半纤维素的生物质材料、或者主要成份为淀粉的生物质材料、或者它 们中二种以上的混合物。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征还在于:所述碳水化合物聚合物的水解酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶、生淀粉糖化酶、淀粉酶、糖化酶的一种或它们中二种以上的组合。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于:所述产油微生物液体培养基中还可含有其他微生物培养常用营养物质，其他微生物培养常用营养物质包括质量为碳水化合物聚合物总质量0.1% 20%的氮源、质量为碳水化合物聚合物总质量0.01% 15%的磷源、或质量为碳水化合物聚合物总质量0.01% 5%的硫源或它们中的二种或三种的组合。
5.按照权利要求2所述的方法，其特征还在于:所述主要成份为纤维素和半纤维素的生物质材料为玉米秸杆、麦杆、稻草、甘蔗渣、玉米芯、林业生产下脚料、松木、云杉中的一种或二种以上组合。
6.按照权利要求2所述的方法，其特征还在于:所述主要成份为淀粉的生物质材料为玉米、稻谷、高粱、小麦、大麦、木薯、甘薯中的一种或二种以上组合。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20 %的微生物，包括下述微生物中的一种或二种以上，油脂酵母中的斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi ;红酵母中的圆红冬抱酵母Rhodosporidiumtoruloides、粘红酵母 Rhodotorula glutinis 和掷抱酵母 Sporobolomyces roseus ;丝抱酵母中的皮状丝抱酵母Trichosporon cutaneum和发酵性丝抱酵母Trichosporonfermentans ;隐球酵母中的白色隐球酵母Cryptococcus albidus和弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ;霉菌中的伯顿拟内抱霉 Endomycopsis burtoni1、健强地霉 Geotrichum robustum、深黄被抱霉 Mortierella isabellina 和卷枝毛霉 Mucorcircinelloides ;产油细菌中的棒杆菌Croynebacterium、诺卡氏菌Nocardia和红球菌Rhodococcus ο
8.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于:所述产油微生物经培养后得到的菌体积累含有一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂，并且油脂含量占细胞干重的20%以上；所述产油微生物菌体内积累的油脂，可以作为制备生物柴油的原料。
全文摘要
本发明公开一种产油微生物培养的新方法，即以碳水化合物聚合物为微生物培养的碳源，添加相应聚合物水解酶和产油微生物种子，在适宜温度、pH条件下通空气液体悬浮培养，积累含有长链脂肪酸及其衍生物的微生物油脂。微生物油脂可作为制备生物柴油和油脂化工产品的原料。本发明的方法将产油微生物培养的碳源由传统的水溶性有机化合物拓展为碳水化合物聚合物，整合了生物质水解和产油发酵过程，降低了原料成本，简化了工艺，提高了效率，具有显著的经济效益。
文档编号C12N1/00GK103224884SQ20121002054
公开日2013年7月31日 申请日期2012年1月29日 优先权日2012年1月29日
发明者赵宗保, 龚志伟, 沈宏伟 申请人:中国科学院大连化学物理研究所