专利名称：饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程和农作物育种领域，特别涉及一种柠檬酸转运子基因的克隆及一种新型的番茄转基因材料；具体地讲，涉及饭豆(Vigna umbellate)柠檬酸转运子(MATE)基因的克隆及超表达此基因后培育的转基因番茄在酸性土壤上种植铝耐性提高方面的应用。
背景技术：
土壤酸度是一个普遍存在于世界范围内的严重农业生产问题，它影响着全世界 40%耕地的作物生产[1]。植物生长在酸性土壤中会遭遇一系列非生物胁迫，如氮、磷、钾等养分的缺乏，干旱，铝和锰的毒害等。而由于铝可迅速损坏根尖从而导致植物对养分和水分吸收的障碍[2]使得铝毒成为限制酸性土壤作物生产最主要的因子。我国酸性土壤面积达 203万km2，主要分布于华南热带、亚热带地区，约占全国耕地面积的21% [3]0近年来工业的不断发展，环境的日益恶化，酸雨的频繁发生，以及农业生产中肥料的不合理利用都加速了土壤的酸化，因此铝毒已经引起了国内外专家学者的普遍关注。伴随着人口的增加和可耕地面积的减少，开发利用酸性土壤具有重大的战略意义。针对酸性土壤上的铝毒害问题，传统上，人们往往采用施石灰和肥料等农艺措施进行改良以提高土壤的PH降低Al的活度。施用石灰和肥料虽能减轻或防治表土的铝毒害问题，但对于心底层土壤施用石灰或肥料既有困难也不经济，而且这些措施需要投入大量的人力、 物力和财力，长期施用还会破坏土壤结构，使Zn、Fe等微量元素的生物有效性降低，难以取得良好的经济效益和生态效益。因此，在改土施肥的同时，还须考虑植物的因素，一是充分挖掘植物潜力，筛选天然存在的耐铝的优质种质资源；二是通过遗传改良来获得抗铝毒能力较强的植物品种；这是持续、高效地解决酸性土壤铝毒害的有效途径[4]，有利于农业的可持续发展。通过遗传改良的方法获得耐铝的转基因品种近年来得到人们的重视，其根本实现途径在于研究耐铝植物的分子生物学机理，克隆耐铝的关键基因，通过基因工程的手段获得高效耐铝的转基因植物。目前铝胁迫下植物根系有机酸的分泌是大多数植物最重要也是研究最为透彻的耐铝机里[5’6]，早在1991年，Miyasaka等就发现了铝能诱导有机酸分泌的现象[7]。有机酸是一种低分子量的碳氢氧化合物，因携带有一个或多个羧基功能团易和金属发生螯合作用， 其本身的特性在植物或微生物对营养元素的吸收和代谢、植物对金属的解毒等方面起着不可替代的作用[8]。耐铝植物在铝胁迫条件下会分泌大量的有机酸，分泌到质外体的有机酸能有效螯合Al3+，转变为对植物无毒害的络合物的稳定形态，滞留在外质体中。因此基因工程手段提高耐铝性的工作主要集中在两个方面一是转入有机酸合成代谢有关的基因，但这些基因的转入在一部分植物中并不能提高铝耐性，有报道指出植物体内有机酸的含量与植物对铝的耐受程度无关；二是转入负责有机酸分泌的基因，这方面的工作常常得到预期的效果。在耐铝中起重要作用的有机酸主要有苹果酸、柠檬酸和草酸。第一个克隆到的负责Al胁迫条件下有机酸分泌的基因是小麦中的苹果酸转运子TaALMTl[9]，将其过量表达于大麦中使转基因大麦获得了分泌苹果酸的能力，显示了更高水平的铝耐性[1°]。随后，苹果酸转运子的同源克隆发现了拟南芥中的AtALMTl[11]和油菜中的BnALMTl和BnALMT2[12]， 缺失AtALMTl的拟南芥突变体分泌更少的苹果酸，对铝毒害也更加敏感。把BnALMTl和 BnALMT2转到烟草悬浮细胞中使其在铝胁迫下分泌苹果酸并提高耐铝性。柠檬酸在结合 Al3+的能力方面大于其它有机酸，具有更高的解铝毒的能力。最近铝激活的柠檬酸转运子基因也先后从高梁(SbMATE)和大麦(HvMATE)中克隆，它们属于MATE (multidrug and toxic compound extrusion)蛋白家族，将SbMATE转入小麦或HvMATE转入烟草都使柠檬酸分泌量和铝耐性得到大幅度提[13’14]。随后在拟南芥(AtMATE)和玉米(ZmMATEl)中也发现了 MATE 的同源基因。它们在耐铝性中也发挥重要作用，其中ZmMATEl与耐铝的QTL共定位[15’16]。 可见，定位于细胞膜上的有机酸转运子是控制有机酸分泌和铝耐性的关键因子。上述参考文献具体如下[1]. Von Uexkiil HR,Mutert E (1995) Global extent, development and economic impact of acid soils.(全球酸性土壤的分布范围、发展趋势和经济影响)Plant Soil 171 :1-15。[2]. Kochian LV(1995)Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants.(植物中铝毒和铝耐性的细胞学机制)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46 :237_260。[3],严小龙，张福锁著(1997)植物营养遗传学.中国农业出版社.北京.1_21。[4]. Hiradate S, Ma JF, Matsumoto H(2007)Strategies of plants to adapt to mineral stresses in problem soils.(植物适应限制性土壤中矿质胁迫的策略)Adv Agron 96 :65-132。[5] .Ma JF,Ryan PR,Delhaize E(2001)Aluminium tolerance in plants and the complexing roleof organic acids.(植物中铝的耐受性和有机酸的多样化作用)Trends Plant Sci 6 :273_278。[6]· Ryan PR Delhaize Ε,Jones DL(2001)Function and mechanism of organic anion exudation from plant roots.(植物根系中有机酸阴离子分泌的功能和机制)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52 :527_560。[7], Miyasaka S, Quta J G, Hdwell R K,Foy C D(1991)Mechanism of aluminum tolerance in snapbeans.(菜豆耐IS的机理)Plant Physiol 96:737—743。[8] .Ma J F(2000)Role of organic acids in detoxification of aluminum in higher plants.(高等植物中有机酸在解铝毒方面的作用)Plant Cell Physiol 41: 383-390。[9], Sasaki Τ, Yamamoto Y, Ezaki B, Katsuhara Μ, Ahn S J, Ryan P R, Delhaize Ε,Matsumoto H(2004)A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.(小麦中编码铝激活的苹果酸转运子的基因)Plant J 37 :645_653。[10]. Delhaize E, Ryan P R, Hebb D M, Yamamoto Y, Sasaki Τ, Matsumoto H(2004)Engineering high-level aluminum tolerance in barley with the ALMTl gene. (采用生物工程的手段以ALMTI基因来提高大麦的铝耐性)P Natl Acad Sci USA 101 15249-15254。[11], Hoekenga 0 A，Maron L G，Pineros M A, Cancado G M A, ShaffJ, Kobayashi Y,Ryan P R,Dong B,Delhaize E,Sasaki Τ,Matsumoto H,Yamamoto Y,Koyama H,Kochian L V(2006)AtALMT1, which encodes a malate transporter, is identified as one of several genes cirtical for aluminum tolerance in Arabidopsis.(编石马苹果酸转运子的AtALMTl基因在拟南芥铝耐性中起关键作用)P Natl Acad Sci USA 103 :9738_9743。[12]. Ligaba A, Katsuhara M, Ryan PR, Shibasaka Μ, Matsumoto Η(2006) The BnALMTl and BnALMT2 genes from Rape encode aluminum-activated malate transporters that enhance the aluminum resistance of plant cells.(油菜中有两个编码铝激活的苹果酸转运子基因BnALMTl和BnALMT2，它们能提高植物细胞对铝的耐受能力)Plant Physiol 142:1294-1303。[13], Magalhaes J V, Liu J, Guimaraes C Τ, Lana U G P, Alves V M C, Wang Y H, Schaffert R Ε, Hoekenga O A, Pineros M A, Shaff J Ε, Klein P Ε, Carneiro N P, Coelho C Μ,Trick H N,Kochian L V(2007)A gene in the multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family confers aluminum tolerance in sorghum.(负责多禾中药物禾口毒性成分分泌的基因家族中的一个基因赋予高梁对铝的耐受性)Nat Genet 39 :1156_1161。[14]. Furukawa J,Yamaji N,Wang H,Mitani N,Murata Y,Sato K,Katsuhara Μ, Takeda K, MaJF (2007)An aluminum-activated citrate transporter in barley.(大麦中一个铝激活的柠檬酸转运子)Plant Cell Physiol 48:1081-1091。[15]. Liu J P, Magalhaes J V, Shaff J and Kochian L V (2009) Aluminum-activated citrate and malate transporters from the MATE and ALMT families function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance.(分另ll 来自MATE和ALMT家族的铝激活的柠檬酸和苹果酸转运子在拟南芥铝耐性中发挥独立的作用)Plant J 57 :389-399。[16], Maron LG, Pineros M A, Guimaraes C Τ, Magalhaes J V, Pleiman J K, Mao C Ζ, Shaff J, Belicuas S N J, Kochian L V(2010)Two functionally distinct members of the MATE (muIti-drug and toxic compound extrusion)fami Iy of transporters potentially underlie two major aluminum tolerance QTLs in maize.(玉米中两个功能不同的MATE基因与两个铝耐性的主效QTL共定位)Plant J 61 :7观_740。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE及其应用。为了解决上述技术问题，本发明提供一种饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE，其具有 SEQID NO 1所述的核苷酸序列。本发明还同时提供了一种耐铝性的转基因农作物的培育方法，包括以下步骤1)、选用具有SEQ ID NO=I所述核苷酸序列的饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE ；2)、组成型表达转基因载体的构建在双元载体pCAMBIA2300的多克隆位点，利用酶切连接方法插入花椰菜花叶病毒组成型启动子CaMV35S、绿色荧光蛋白GFP和梨核酮糖-I，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶基因终止子nos的正向串联子，得到改造的pCAMBIA2300载体；在上述改造的pCAMBIA2300载体的 CaMV35S启动子和GFP之间利用酶切连接的方法正向插入饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE， 得到过量表达VuMATE的转基因载体pRBM ；3)、转基因农作物的培育将转化了上述pRBM载体的农杆菌EHA105侵染番茄Micr0-1Tom的叶盘，经过转基因的共培养、选择、分化和生根步骤，获得转基因番茄MATE-2。作为本发明的的耐铝性的转基因农作物的培育方法的改进步骤3)中的选择为卡那霉素抗性筛选。本发明还同时提供了上述饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE的用途用于植物转基因，从而提高农作物的耐铝性。本发明针对现有农作物所存在的对铝毒敏感的问题，以及目前还没有报道从头合成的柠檬酸转运子及其在植物转基因育种中得到应用的现状，首先从铝耐性植物中克隆了从头合成柠檬酸转运子的基因，即从耐铝的饭豆(Vigna umbellate)中克隆了编码柠檬酸转运子的基因VuMATE。其次是用转基因的方法培育高耐铝性的新型农作物，即提供了过表达VuMATE的转基因番茄材料，此转基因材料表现出高柠檬酸分泌能力和铝耐性提高的应用前景。构建的重组载体可作为基因资源用于商业用途及便于在农业生产上提高农作物的耐铝性。本发明所采用的技术方案一是利用简并引物同源克隆法结合cDNA末端快速扩增 PCR法(RACE)，以25 μ M Al处理12h的饭豆Icm根尖的RNA为模板，先用简并引物，通过 RT-PCR的方法，得到了 VuMATE基因片段，再根据此片段设计5，-RACE和3，-RACE引物， 用RACE方法获得了未知的5’端和3’端的基因片段，从而克隆了饭豆VuMATE全长cDNA， 并测定了核苷酸序列。饭豆(Vigna umbel lata)柠檬酸转运子基因VuMATE全长2041bp， 111-1808编码区(最后3个碱基是终止密码子)，共编码565个氨基酸。全长cDNA序列如 SEQ ID NO 1 所示。本发明所采用的技术方案二是叶盘法转化番茄，过表达VuMATE基因提高番茄的柠檬酸分泌量，从而得到高耐铝性的农作物。上述技术方案二包括以下步骤1)、选用饭豆从头合成柠檬酸转运子的基因VuMATE2)、组成型表达转基因载体的构建在双元载体pCAMBIA2300 (图1)的多克隆位点，利用酶切连接方法插入花椰菜花叶病毒组成型启动子CaMV35S、绿色荧光蛋白GFP和梨核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶基因终止子nos的正向串联子，得到改造的pCAMBIA2300载体，在改造的pCAMBIA2300载体的CaMV35S启动子和GFP之间同样利用酶切连接的方法正向插入饭豆柠檬酸转运子基因 VuMATE，得到过量表达VuMATE的转基因载体pRBM(图2)。3)、转基因农作物的培育将转化了 pRBM载体的农杆菌EHA105侵染番茄品种“Micro-Tom”的叶盘，经过转基因的共培养、选择(卡那霉素抗性筛选)、分化、生根步骤获得转基因番茄MATE-2。发明人的发明基础如下目前已经报道的柠檬酸转运子都是单子叶植物中的，尽管拟南芥是双子叶植物，但拟南芥的耐铝机制主要是通过苹果酸的分泌而不是柠檬酸的分泌，因此我们试图克隆双子叶植物中的柠檬酸转运子基因；另外，已知的柠檬酸转运子都是组成型表达的，比如大麦的HvMTEl的表达不受铝的影响，我们试图发现诱导型表达的柠檬酸转运子，以便专一有效的对铝胁迫做出响应，为转基因育种提供优良的候选基因。饭豆是一种能够在酸性土壤上良好生长的铝耐性的双子叶植物，Al胁迫可以诱导饭豆分泌大量的柠檬酸，而且柠檬酸的分泌存在至少3小时的滞后期，用蛋白质合成抑制剂处理可以抑制柠檬酸的分泌表明饭豆的柠檬酸转运子可能是从头合成的，属于受Al诱导的基因。这个基因尚未被克隆，是否能提高转基因植物对铝的耐受能力目前也尚无报道。 本发明从提高植物柠檬酸分泌量的角度来研究如何提高耐铝性的问题，并通过新基因克隆及其在转基因植物中的表达来研究柠檬酸转运子在提高耐铝性方面的应用。本发明所得的转基因番茄MATE-2，其柠檬酸分泌量和铝耐性远高于非转基因的番茄品种。这在现有番茄品种中从未有报导。本发明还提供了同一发明构思下的按照上述方法获得的转基因农作物的用途将该种转基因农作物种植在酸性铝毒的土壤上，因其具有良好铝耐性的柠檬酸转运子，在铝胁迫下大量分泌柠檬酸，螯合A13+将其滞留在质外体中，从而使转基因农作物表现出强的铝耐性。本发明的效果和益处在于VuMATE是首次被克隆的从头合成的柠檬酸转运子基因，突破了从头合成的柠檬酸转运子还没有在植物转基因育种中得到应用的现状。因 VuMATE所编码的诱导型柠檬酸转运子参与到解铝毒的过程中，将其构建到表达载体上转化农作物(特别是番茄)，达到了提高柠檬酸分泌量和铝耐性的目的。因此，本发明克隆的新基因VuMATE及提供的培育新型转基因农作物(特别是番茄)的途径在农业生产上具有很高的价值。我们可以利用本发明培育具有高耐铝性的转基因农作物，解决酸性土壤上铝毒害严重影响作物产量的问题，具有重大的应用前景。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是双元载体pCAMBIA2300的示意图；图2是转基因载体pRBM的示意图；图3是“Micro-Tom”和MATE-2转基因番茄的相对根伸长的对比图；图4是“Micro-Tom”和MATE-2转基因番茄的柠檬酸分泌量的对比图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例1、饭豆柠檬酸转运子基因的克隆将表面消毒后的饭豆种子于去离子水中浸泡过夜，用湿润的纱布包裹放在25°C 暗室中催芽，发芽后的种子置于漂浮在0.5mM CaCl2(pH4. 5)溶液的网篮上避光生长， 根长约为3cm时置于光照条件下，待根长长到4-5cm时转移网篮至含有25 μ M Al的 0. 5mMCaCl2(pH4. 5)溶液中，处理12h后用清洁刀片切取Icm的根尖用于RNA的提取。用Olig0(KT)18为引物逆转录合成的cDNA作为后续同源克隆的模板。Oligo (1(1018是公知技术，具体序列是18个连续的T。根据高梁、大麦、拟南芥中已知的柠檬酸转运子基因(SbMATE、HvMATE U AtMATE)及白羽扇豆、大豆、蒺藜苜蓿、水稻中可能的柠檬酸转运子基因(LaMATE、 GmAlTsbl、MtMATE, 0sl0g0206800)的保守序列设计了两对简并引物(上游引物 5，-ACMACWTCNTTYGTNGCDGARGA-3，，下游引物 5，-HCCRTCNGCRAGAA⑶GA-3，和上游引物 5，-TCHCTTCYGCNGAYGG-3，，下游引物 5，-HCCRTCNGCRAGAA⑶GA-3，)，以上述 cDNA 为模板， 聚合酶链式反应体系为模板lyLdOOng/yL)、引物(IOpM)各3 μ L、dNTP (dA/G/C/TTP IOmMeach) 2 μ L、Taq (5u/μ L)0. 2 μ L、10Xbuffer (含 2. 5mM Mg2+)2. 5μ L、水 13. 3 μ L，反应条件为94°C 3m, 94°C 30s,48°C 50s,72°C lm，共35个循环，终延伸72°C 10m，扩增得到两条 cDNA片段，分别约为900bp和300bp，回收测序后拼接为约1200bp的VuMATE cDNA片段。根据得到的约1200bp 的 VuMATE 片段，按照 SMART RACE cDNA amplification kit(CLONTECH)的要求，分别设计5，-RACE和3，-RACE引物5，-RACE 引物5，-TGGTTGAGTAGCAGCCACAAACGGGATG-3，；3，-RACE 引物5，-AGCGTCATTAGCAGCAAGGCTTGGTTCA-3，。反应体系为RACE模板 2. 5 μ L，UPM 5 μ L, RACE 弓丨物 1 μ L, IOXAdvantage 2 PCR buffer5 μ L, dNTP 1 μ L, 50 X Advantage 2 Polymerase Mix IyL0反应条件为94°C30s, 72°C 3min，5 个循环；94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 3min，5 个循环；94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 3min，共 25 个循环。RACE后克隆得到VuMATE的5，端(约1600bp)和3，端(约800bp)的cDNA序列。 测序拼接后得到了 cDNA全长为2041bp的饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE的序列，如SEQID NO 1所示，其中111-1808为编码区。实施例2、组成型表达转基因载体的构建双元载体pCAMBIA2300(图1)是一个用于农杆菌介导的植物转基因载体，在载体中已有一个完整的筛选标记基因表达框，即由35S启动子驱动的卡那霉素抗性基因。在此35S启动子的上游有一个可用于基因克隆的多克隆位点(pUC18 MCS)。本试验中利用 DNA片段酶切和连接方法在多克隆位点上插入了花椰菜花叶病毒组成型启动子CaMV35S、 绿色荧光蛋白GFP和梨核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶基因终止子nos，得到改造的 PCAMBIA2300载体。在改造的pCAMBIA2300载体的CaMV35S启动子和绿色荧光蛋白GFP 之间正向插入饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE，得到转基因载体pRBM(图2)。其中VuMATE 序列用于转基因时的引物为VuMATE-TF CGGGGTACCTTAATGGAAGAGAATGG 和 VuMATE-TR CGGGGATCCAGCCAATGAACAACCT，所用酶切位点为KpnI和BamHI。可参考分子克隆实验指南进行上述操作。实施例3、番茄转化双元转基因载体pRBM通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中，得含有双元质粒载体的EHA105菌株，用此含有双元质粒载体的EHA105菌株来转化番茄。具体为将番茄的成熟种子消毒后浸泡在无菌水中于摇床上摇至露白，然后播种于1/2MS 培养基上，待子叶完全展开并刚刚露出真叶时，把子叶切去叶尖和基端，切成0. 5cm2的小
8块，离轴面向下置于预培养基上25°C黑暗条件下预培养2d，将其作为转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染番茄叶盘，在黑暗、25°C条件下培养3天后，在含有IOOmg/ L卡那霉素(Kanamycin sulfate)的选择培养基上筛选四周后获得抗性芽，经生根培养后获得转基因幼苗。转基因苗炼苗3-5天后，移栽到土壤中栽培收获转基因一代(Tl代)种子。其中预培养基为含有100 μ MAS,2. 0mg/LZeatin、0. 5mg/LIAA的MS培养基，选择培养基为含有 100mg/L Kana、200mg/L Timetin、2. Omg/L Zeatin、0. 5mg/L IAA 的 MS 培养基。为了证明本发明方法所得的转基因番茄所具有的优越性，发明人作了如下的对比实验1、番茄Al胁迫下的相对根伸长实验铝毒的典型性状是抑制根伸长，因此相对根伸长实验能表征植物对铝的耐受性。 分别将“Mico-Tom”和MATE-2转基因材料(即本发明实施例3所得)的种子依次用体积浓度75%酒精和体积浓度10% NaClO表面消毒后浸泡在灭菌水里于摇床上摇至露白，然后播种于含0. 5mM CaCl2, pH4. 5的0. 8%的琼脂粉平板上，待根长约为3cm时开始量根长先测量Mh的根伸长量，然后将其转移到添加100 μ M Al的琼脂粉平板上，再测量接下来24h 的根伸长量，相对根伸长(RRG%)即为第二次的根伸长量除以第一次的根伸长量再乘以 100%。结果表明转基因(MATE-2)番茄相对根伸长比非转基因(“Micro-Tom”)对照提高了 22.9%。具体见图3。2、番茄柠檬酸分泌量测定水培条件下的番茄根系分泌物300ml先分别通过阳离子树脂和阴离子树脂，用IN HCl (15ml)洗脱下来的溶液旋转蒸发后溶解于800 μ L的去离子水中，然后取100 μ L用于柠檬酸的测定。根系柠檬酸的测定方法为每100 μ L的样品加入700 μ L的水、120 μ L的 Tris-HCl (1Μ，ρΗ7· 8)、15 μ L的NADH(IOmM)、2 μ L的苹果酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶(均为0. 25mg/mL)，340nm读数，然后加入5 μ L柠檬酸裂解酶(50mg/mL)，340nm读数，两次读数的差值即正比于柠檬酸的量。“Micro-Tom”和MATE-2转基因根系柠檬酸分泌量分析表明， 水培条件下，转基因根系的柠檬酸分泌量为20.6nmOl/株/3h，25μM Al处理后分泌量为 9. 6nmol/株/3h，但是非转基因“Micro-Tom”没有柠檬酸分泌，或者说其分泌量在所用方法的检测限以下。具体见图4。上述实验说明本发明所得的转基因番茄MATE-2，其柠檬酸分泌量和铝耐性远高于非转基因的番茄品种。实施例4、目的基因表达的分子检测"Micro-Tom"和转基因植株的幼嫩叶片取样提取RNA，经逆转录-PCR后获得目的基因VuMATE在转基因MATE-2植株中表达，而在未转基因植株(即，Micro-Tom)中没有表达。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE，其特征是具有SEQID NO: 1所述的核苷酸序列。
2.一种耐铝性的转基因农作物的培育方法，其特征是包括以下步骤1)、选用具有SEQID NO: 1所述核苷酸序列的饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE;2)、组成型表达转基因载体的构建在双元载体PCAMBIA2300的多克隆位点，利用酶切连接方法插入花椰菜花叶病毒组成型启动子CaMV35S、绿色荧光蛋白GFP和梨核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶基因终止子nos的正向串联子，得到改造的pCAMBIA2300载体；在上述改造的pCAMBIA2300载体的 CaMV35S启动子和GFP之间利用酶切连接的方法正向插入饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE， 得到过量表达VuMATE的转基因载体pRBM ；3)、转基因农作物的培育将转化了上述PRBM载体的农杆菌EHA105侵染番茄Micr0-1Tom的叶盘，经过转基因的共培养、选择、分化和生根步骤，获得转基因番茄MATE-2。
3.根据权利要求2所述的耐铝性的转基因农作物的培育方法，其特征是所述步骤3) 中的选择为卡那霉素抗性筛选。
4.如权利要求1所述饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE的用途，其特征是用于植物转基因，从而提高农作物的耐铝性。
全文摘要
本发明公开了一种饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE，其具有SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列。本发明还公开了一种耐铝性的转基因农作物的培育方法，包括以下步骤1)选用具有SEQ ID NO:1所述核苷酸序列的饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE；2)组成型表达转基因载体的构建；3)转基因农作物的培育将转化了上述pRBM载体的农杆菌EHA105侵染番茄Micro-Tom的叶盘，经过转基因的共培养、选择、分化和生根步骤，获得转基因番茄MATE-2。本发明所述的饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE能用于植物转基因，从而提高农作物的耐铝性。
文档编号C12N15/29GK102154318SQ201110032700
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月30日 优先权日2011年1月30日
发明者杨建立, 杨晓颖, 郑绍建 申请人:浙江大学