专利名称：虾白斑综合征病毒iel启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒基因启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子，尤其涉及虾白斑综合征病毒(WSSV) iel启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子，本发明还涉及它们的应用，本发明属于虾白斑综合征病毒基因的表达、调控领域。
背景技术：
虾白斑综合征(White spot syndrome, WSS)是对养虾业危害最严重的传染病，病原是虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)。该病于20世纪90年代最先在中国台湾地区暴发，此后迅速传播至整个亚洲及欧美的主要对虾养殖地区。该病毒侵染性和复制能力很强，宿主死亡率可达100%，可侵染对虾的多种组织，且宿主范围很广，对虾、螯虾、蟹类、淡水甲壳类动物均可感染。该病毒给对虾养殖业造成了极大损失，并且威胁整个海洋生态系统的平衡。WSSV是一种大型的双链DNA病毒，具有双层囊膜，不能形成包涵体，隶属于线头病毒科(Nimaviridae)，是该科的唯一成员。为了寻求防治对虾白斑综合征的方法，研究人员对WSSV展开了逐步深入的研究。早期的工作主要集中在病原学、病理学、流行病学等方面， 研究人员还建立了一些实用的病原体检测方法，用于该病的检测。2001-2002年三株WSSV 病毒基因组的全序列测定，拉开了 WSSV分子病毒学研究的序幕，但分析发现其大部分开放阅读框与GenBank中已有的基因序列无同源性，这样就很难借鉴其它病毒的基因表达及复制模式对其进行研究。在基因组测序的基础上，各国学者对该病毒的分子致病机理作了大量研究。迄今为止，已确认的与WSSV致病有关的基因主要有编码囊膜蛋白基因、编码核衣壳蛋白基因、编码病毒复制过程关键酶基因、与病毒潜伏相关的基因和阻止宿主细胞凋亡的基因等。虽然目前针对WSSV的分子生物学研究取得了一定的进展，但是最主要还是集中于病毒结构蛋白方面；目前还没有建立适合该病毒生长的细胞系，对病毒侵染以及复制的分子机制还没有系统的研究；对WSSV感染机制特别是病毒复制的调控机制，病毒与宿主的相互作用等仍缺乏了解；另外，由于虾属于无脊椎动物没有特异性免疫系统，不能产生抗体，因此不能用疫苗免疫的方法来预防该疾病。所以到目前为止，对该病毒病的防治尚缺乏有效的方法。病毒的复制是病毒致病的前提，而病毒基因的表达与调控又是病毒复制的核心环节。研究病毒基因的转录调控，不仅可以揭示宿主细胞某些基因表达的调节机制，而且有助于阐明病毒的致病机理，这对于疾病防治具有重要的理论和实用价值。
发明内容
本发明的目的之一是鉴定一种WSSV iel启动子主要顺式作用元件；本发明目的之二是筛选到与上述WSSV iel启动子主要顺式作用元件相结合调控WSSV iel基因表达的转录因子及其编码基因。本发明目的之三是将筛选到的转录因子及其编码基因应用于制备成调控WSSV基因表达或复制的药物或作为药物有效作用靶点筛选抗虾白斑综合征病毒药物。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种WSSV iel启动子主要顺式作用元件，其核苷酸序列为SEQ ID No. 1所示。一种与所述WSSV iel启动子主要顺式作用元件相结合调控WSSV iel基因表达的转录因子(prohibitin 2，PHB^，其氨基酸序列为SEQ ID No. 3所示，编码该转录因子的基因(sf-pW^)，其核苷酸序列为SEQ ID No. 2所示。本发明从WSSV启动子入手探讨WSSV复制的分子机制，通过实验筛选到了一个泛活性的强启动子，它驱动WSSV—个立即早期基因iel的表达。对该启动子结构与功能的进一步研究发现，位于转录起始位点上游-78 -67bp区间的12-bp DNA序列(SEQ ID No. 1) 决定其启动子的强活性；由于在此12-bp序列之内没有可以预测的转录因子结合位点，说明该12-bp序列包含一个全新的上游调控元件，一个新的转录因子与该调控元件结合，启动该病毒iel基因的表达和病毒的复制。本发明通过DNA亲和层析的方法从Sf9细胞核蛋白中提纯与iel启动子12_bp DNA序列结合的蛋白，进而用生物质谱分析方法确定该蛋白为抑制素2 (prohibitin 2， PHB2)。本发明从无脊椎动物细胞(Sf9)中克隆了 PHB2基因，并命名为Sf-pt!b2。在有脊椎动物细胞中，PHB2是一个具有广泛功能的蛋白质，它既存在于线粒体内膜上，发挥分子伴侣作用；也存在于细胞核内，作为转录调节因子发挥负性转录调控作用，因而对细胞代谢、生长、分化、衰老以及凋亡等诸多方面发挥着重要的调控作用，已经被确认为诸如糖尿病、肿瘤、肥胖等多种疾病的治疗靶点；此外，最近的报道证明PHB2可以作为细胞膜上病毒的主要受体蛋白，在介导病毒内吞中起重要作用。目前关于PHB2的功能研究主要在有脊椎动物中进行，还没有PHB2作为转录因子直接结合DNA的报道。本发明的研究表明，在Sf9细胞中，Sf_PHB2作为转录因子通过结合12-bpDNA序列调控WSSV iel基因表达。Sf-PHB2作为转录因子是基于以下实验首先，DNA亲和层析是研究DNA结合蛋白的经典方法，许多转录因子，诸如，Spl和C/EBP等都是通过这种方法得到的。本发明也是通过这种方法从Sf9细胞中提纯12-bp DNA结合蛋白得到Sf-PHB2的；其次，本发明通过凝胶阻滞实验证明，Sf-PHB2能与12 — bp DNA序列特异结合；第三，Sf_PHB2 具有核定位信号(NLS)并部分在细胞核内表达；更重要的是通过SMART软件(http:// smart, embl-heidelberg. de/)对蚊子、虾、蛾、蚕等无脊椎动物PHB2蛋白的结构进行结构分析发现，它们具有转录因子特征性结构域螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)。 在无脊椎动物中，PHB2蛋白具有转录因子DNA结合结构域的典型特征(HTH)，这提示它可能作为转录因子发挥作用，而这种结构域在有脊椎动物的PHB2蛋白并不存在。最近的研究表明，该基因在WSSV侵染与非侵染的对虾组织中存在差异表达，这也表明，PHB2可能作为主要转录因子启动WSSV在体内的复制以及虾白斑综合征的发生与发展过程。PHB2所调控的iel是WSSV—个重要的立即早期基因，现已证明它编码一个具有锌指结构的转录因子。根据转录的起始时间不同，WSSV基因可被分类为立即早期基因、迟早期基因、晚期基因和极晚期基因。在感染细胞内，病毒基因的表达以及DNA复制是一种有序的级联事件，病毒基因表达的级联是在转录水平上发生的调节，在这个级联模型中(cascademodel)，病毒的一种时相的基因产物直接或间接地反式激活后一时相的基因转录。在无脊椎动物中，PHB2作为转录因子，通过结合WSSV iel基因启动子的12-bp DNA，启动WSSV立即早期基因的转录，在WSSV复制起始的过程中起主要作用，因此可以作为抗WSSV药物的有效作用靶点。同时，PHB2也可能作为对虾转基因抗病育种的重要候选基因。
图IWSSV iel启动子缺失和突变分析；A. WSSV iel启动子位于翻译起始位点与其 388-bp上游之间的DNA序列；数字以箭头所示的转录起始密码子(+1)为基准，下划线部分分别为12-bp DNA序列、阴Spl结合序列和TATA盒序列，方框中部分表示翻译起始密码子 ATG0 B.启动子荧光素酶报告基因活性分析；每一截短的末端用它们与转录起始位点之间的距离表示，推测的Spl结合位点和 TATA盒突变的报告基因质粒分别被命名为ρ (-55/+53) Δ和ρ (-35/+53) Δ。图2DNA亲和层析提纯WSSV iel启动子12_bp基序结合蛋白的SDS-PAGE分析；M 蛋白质分子量标准1. DNA亲和层析纯化蛋白的SDS-PAGE电泳银染(箭头所示为纯化的蛋白带)。图3生物质谱分析结果；左、右图分别代表质谱分析得到的两段氨基酸序列 VPffFQYPIIYDIR 和 FNASQLITQR。图4Sf-ptA2基因DNA序列以及推导的氨基酸序列；划线部分为质谱分析氨基酸片段对应的序列；方框中的序列为核定位信号(NuclearLocalization Signal, NLS)；阴影部分的氨基酸序列为推测的螺旋-转角-螺旋(HeliX-TUrn-HeliX，HTH)结构域。图5免疫荧光检测Sf-PHB2在Sf9细胞中的分布；A.正常的Sf9细胞；B. Sf_PHB2 在Sf9细胞中的表达；C. DAPI染色用于指示细胞核；D. A. B. C重叠的结果。图6凝胶阻滞试验验证Sf_PHB2与DNA的相互作用；箭头1表示supershift条带，箭头2迁移条带，箭头3表示游离探针；1.未加Sf9细胞核蛋白；2，3，4.加入Sf9细胞核蛋白并分别加入2、5、10倍的冷探针；5.加入Sf9细胞核蛋白；6.加入Sf9细胞核蛋白及 EBNA探针；7，8.加入Sf9细胞核蛋白和分别加入1. 0μ 1、0· 5μ 1 Sf-PHB2抗体。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1、材料与方法1. 1报告基因质粒构建及其缺失和突变分析以WSSV病毒基因组DNA为模板，采用表1中的引物序列PCR方法对iel基因启动子从5'和3'端进行一系列的缺失和突变分析，方法和策略见图1，突变体中基因调控元件的位置以iel转录起始位点(+1)推算。通过一系列的5'和3'端缺失分析，利用不同引物序列组合，产生一系列5'、3'启动子缺失序列。为进行Spl结合位点基序 (TGTGGGCGGAGCA)和 TATA 盒(GTGTATATAAGAGCC)的突变分析，用突变引物 Mutl 和 Mut2 进行PCR获得定点诱变的iel启动子克隆，每个PCR产物用Kpn I和Hind III消化，克隆到 phRG-B 载体。表1用于构建报告基因质粒的引物序列(酶切位点如下划线所示)
权利要求
1.一种虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus) iel启动子主要顺式作用元件，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID No. 1所示。
2.与权利要求1所述的虾白斑综合征病毒iel启动子主要顺式作用元件相结合的转录因子，特征在于其氨基酸序列为SEQ ID No. 3所示。
3.编码权利要求2所述转录因子的基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQID No. 2所不。
4.权利要求1所述的虾白斑综合征病毒(Whitespot syndrome virus) iel启动子主要顺式作用元件在制备调控虾白斑综合征病毒iel表达或复制的药物中的用途。
5.权利要求2所述的转录因子作为药物有效作用靶点筛选抗虾白斑综合征病毒药物中的用途。
6.权利要求2所述的转录因子在作为药物有效作用靶点筛选杀虫剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种虾白斑综合征病毒(WSSV)ie1启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子和应用。本发明从WSSV ie1的转录调控入手，通过缺失和突变对其启动子进行结构与功能分析，发现一个12-bp DNA序列是其主要顺式作用元件，它决定着ie1的高表达。本发明采用DNA亲和层析方法从Sf9细胞核蛋白中提纯了与该段DNA相结合的蛋白，生物质谱鉴定该蛋白为PHB2，凝胶阻滞实验证明两者的相互作用是特异的。实验结果表明PHB2作为转录因子通过特异结合ie1启动子12-bp DNA序列来启动WSSV立即早期基因转录，进而调控WSSV的复制，可作为药物有效作用靶点筛选抗虾白斑综合征病毒药物。
文档编号C12N15/113GK102174518SQ201110032519
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月30日 优先权日2011年1月30日
发明者于力, 马国达 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所