β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法
【专利摘要】本发明涉及β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法，属于分析【技术领域】。采用YMC?Carotenoid?C30色谱柱，流动相为1.5％乙酸铵水/甲基叔丁基醚/甲醇＝5/25/70和1.5％乙酸铵水/甲基叔丁基醚/甲醇＝5/85/10，流速0.6mL/min，进样量20μL，柱温25℃，检测波长为200～550nm，显著分离β-隐黄质异构体及氧化产物，APCI+正离子质谱，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围80～1000m/z，毛细管电压2500V，干燥气体5L，雾化气体20psi，汽化温度300℃，蒸汽温度400℃，电晕电流4μA。根据样品的洗脱顺序、质谱和光谱信息进行β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的定性分析，根据峰面积进行定量分析。该方法具有快速有效、重现性好、回收率高等优点。
【专利说明】β -隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法
一、【技术领域】
[0001]本发明涉及一种β -隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法，属于分析【技术领域】。
二、【背景技术】
[0002]β_隐黄质化学名3-羟基-β_胡萝卜素，是一种具有VA前体功能的含氧类胡萝卜素，主要来源于高等植物、真菌、蓝藻等，广泛分布于人体血液、肺、皮肤以及口腔粘膜等组织中。β -隐黄质具有良好的单线态氧及氧自由基清除能力，使其在抗癌、抗氧化方面的作用显著，尤其是对吸烟引起的肺癌有独特的疗效。另外β_隐黄质在预防心血管疾病、增强免疫功能等方面也具有重要作用。
[0003]β -隐黄质化学结构中含有的共轭双键和羟基使其在光照、加热和其他条件下容易发生异构化和氧化反应，并产生多种顺式异构体和氧化物。β -隐黄质全反式构象稳定性和生理活性最强，顺式和氧化结构在物化性质和生理功能上与全反式差别较大。想要避免β -隐黄质制备和应用过程中受外界环境影响产生顺式异构体和氧化物，就需要一种准确高效的定性、定量分析方法进行检测其可能发生的异构和氧化物，进而提出控制措施。
[0004]HPLC技术因为高灵敏度、快速准确等优点，在类胡萝卜素的分析测定中得到普遍应用。C30固定相具有良好的分辨率和独特的分离能力，适用于不同种类类胡萝卜素的分离鉴定。然而，实际操作中由于类胡萝卜素与其异构体的结构和极性非常接近，很难一一分离和检测。有报道选用甲醇和二氯甲烷或者甲醇和甲基叔丁基醚作为混合流动相分离叶黄素和α、β-胡萝卜素的顺式异构体，但未见有β-隐黄质双顺式异构体及酮类氧化物分离检测的相关报道。因此，建立一种β_隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法对β_隐黄质的生产和应用具有重要意义。
三、
【发明内容】
[0005]技术问题
[0006]本发明的目的在于提供一种快速、准确的β -隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的HPLC-MS测定方法，可以对β -隐黄质异构及氧化产物进行准确的定性和定量分析。
[0007]技术方案
[0008]本发明通过碘催化-光异构化反应制备得到β -隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物，应用C30-HPLC-DAD-APC1-MS联合技术对β -隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物进行定性及定量分析，包括以下步骤:
[0009]1、β -隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的制备
[0010]将1.0mg^-隐黄质标准品用甲醇溶解并定容于25mL棕色容量瓶，置于超低温冰箱中待用。取6份2mLi3 -隐黄质甲醇溶液于6支试管中，氮气吹干后分别加入2mL正己烷和ImL碘-正己烷溶液(1.6 μ g/mL)，使碘含量为β -隐黄质质量的将试管放在距恒温摇床中日光灯1cm处(温度25°C，光照强度ISOOlux)，分别照射I?5h后取出处理。用硫代硫酸钠(lX103mol/L)洗涤去除多余的碘，氮气吹干后用2mL甲醇复溶，经
0.45 μ m滤膜过滤后置于超低温冰箱中待测。
[0011]2、色谱及质谱条件
[0012]C3O-HPLC 分析条件:色谱柱 YMC Carotenoid C30 (4.6mmX 250mm, 5 μ m), 二极管阵列检测器，流动相1.5%乙酸铵水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/25/70)和1.5%乙酸铵水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/85/10)进行梯度洗脱，检测波长200?550nm，流速0.6mL/min，进样量 20yL，柱温 25°C。
[0013]MS分析条件:质谱条件为色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10 μ L/min，离子源APCI+，扫描范围80?lOOOm/ζ，毛细管电压2500V，干燥气体5L，雾化气体20psi，汽化温度300°C，蒸汽温度400°C，电晕电流4 μ A。
[0014]3、建立全反式β -隐黄质标准曲线
[0015]准确称取1.0mg全反式β -隐黄质标准品，用甲醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶中，混匀，制成质量浓度为20 μ g/mL的标准液。分别取0.0125、0.025、0.05、0.25、0.5、1.0、
1.5,2.0,2.5mL标准液置于5mL容量瓶中，用甲醇定容并混匀，制成浓度为0.05,0.1,0.2、1、2、4、6、8、10μ g/mL的系列标准溶液，每个系列浓度进样3次，以进样量为横坐标、相应吸收峰面积为纵坐标进行线性回归分析，绘制全反式β -隐黄质标准曲线。
[0016]有益效果
[0017]1、本发明采用甲醇和甲基叔丁基醚作为流动相对全反式β -隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物进行分离，根据甲醇和甲基叔丁基醚的极性不同，通过对两相溶剂不同比例选择优化、洗脱时间和流速的调整增加分离度；在流动相中加入少量的乙酸，一方面可以改善色谱峰型，另一方面保证隐黄质异构及氧化产物质谱的响应信号；分离得到4种单顺式异构体、3种双顺式异构体及2种氧化产物，分离效果良好。
[0018]2、本发明通过优化的质谱条件对碘催化异构化样品进行了正离子模式的LC-APC1-MS和电子吸收光谱分析，以此确定图中各个峰的归属。HPLC-APC1-MS检测结果如图1至图4所示，其中包括HPLC分离图谱、光谱特征图、质谱特征图。通过最大吸收波长、紫外-可见光谱特性、质谱特性、Q值及文献中相关报道对分离所得化合物进行分析鉴定。全反式β -隐黄质其最大吸收波长为450nm,质谱主离子峰为553.4[Μ+Η]+。β , β -胡萝卜素-3-酮质谱主离子峰为551.4[Μ+Η-2]+，与全反式(553[Μ+Η]+)相差两个H，是由于β -隐黄质左侧环上的羟基变成酮基所致。5，6_环氧-β，β -胡萝卜素-3-酮主离子峰为567[Μ+Η+16-2]+，与5，6_环氧-β-隐黄质(质谱离子峰为569[Μ+Η+16].)相差2个H，且质谱碎片m/z221的存在证明β-环有环氧化的发生。
[0019]β -隐黄质的顺式异构体与全反式异构体相比，其电子吸收光谱发生变化，但同时遵循一定规则。首先，最大吸收波长单顺式异构体相对全反式有4-6nm蓝移，双顺式异构体有10-14nm蓝移；其次，顺式异构体在330?340nm之间有顺式吸收，单顺式异构体吸收较强，双顺式异构体吸收较小，甚至没有吸收。除此之外，隐黄质与胡萝卜素有相同异戊二烯结构的主链性质，二者相应位置异构体洗脱顺序理论上一致。因此，可以鉴定出单、双顺式异构体。结果显示，15-、13-、9_和9’ -顺式-β-隐黄质质谱主离子峰均为553.4[Μ+Η]+，最大吸收波长分别为446、444、446和448皿，与全反式有2_6皿蓝移。其Q值和洗脱顺序与文献报道值相符合。13，15-双顺式、9，13-双顺式和9，9’-双顺式-β -隐黄质的最大吸收波长为438、436和440nm，相对全反式β -隐黄质有10_14nm蓝移，顺式吸收分别为0.08,0.13和0.15，符合双顺式异构体特征。三种β -隐黄质双顺式异构体洗脱顺序与β_胡萝卜素双顺式异构体洗脱顺序相一致。
[0020]表1全反式β -隐黄质异构及氧化产物的鉴定
[0021]
【权利要求】
1.β -隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法，其特征在于HPLC条件为色谱柱YMC Carotenoid C30 (4.6mmX 250mm, 5 μ m), 二极管阵列检测器,流动相1.5%乙酸铵水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/25/70)和1.5%乙酸铵水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/85/10)进行梯度洗脱，检测波长200?550nm，流速0.6mL/min,进样量20 μ L，柱温250C ;质谱条件为色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10 μ L/min,离子源APCI+，扫描范围80?lOOOm/ζ，毛细管电压2500V，干燥气体5L，雾化气体20psi，汽化温度300°C，蒸汽温度400°C，电晕电流4μΑ。
2.权利要求1所述隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法，其特征在于在上述HPLC条件下，β，β-胡萝卜素-3-酮、5，6-环氧-β，β-胡萝卜素-3-酮、.13，15-双顺式-β-隐黄质、15-顺式-β-隐黄质、13-顺式-β-隐黄质、9，13-双顺式_ β _隐黄质、全反式_ β _隐黄质、9,9 ’ _双顺式-β _隐黄质、9_顺式-β -隐黄质、9’-顺式-β -隐黄质共10种β -隐黄质全反式、异构及氧化产物得到显著分离，根据色谱、质谱和光谱信息，对这10种化合物进行了定性分析；建立了全反式β -隐黄质标准曲线Y=12.45Χ-4.09，R2 = 0.9995，用于β -隐黄质异构及氧化产物的定量分析，方法重现性好、回收率高。
【文档编号】G01N30/88GK104181267SQ201410352834
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】李大婧, 张钟元, 肖亚冬, 刘春泉 申请人:江苏省农业科学院