专利名称：小麦条锈菌单管一步巢式pcr检测方法及引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害流行监测领域，尤其涉及一种小麦条锈病单管巢式一步PCR 检测方法及引物。
背景技术：
小麦条锈病是我国主要粮食作物小麦上最重要的病害，其发生危害直接影响小麦产量及质量，威胁国家粮食安全。1949年以来，我国小麦条锈病的4次大流行分别造成小麦产量损失6. 0,3. 0,1. 8和1. 3亿公斤。小麦条锈病是一种气传大区流行性病害，陇南、陇东被公认为我国小麦条锈病越夏基地，该区域秋苗小麦条锈病的发生情况对其它流行区春季病害的发展至关重要，因此实现对陇南、陇东小麦条锈病的早期监测及其防控是我国小麦条锈病综合治理的关键环节。长期以来，传统的检测方法主要是根据病害症状、病原形态学、生理学的特性进行检测，该方法存在诊断过程繁琐、时间周期长，而且检测准确性低、灵敏度不高的缺点，重要的是无法实现尚未显症的病害侵入的监测。随着分子生物学技术的发展，特别是基于核酸扩增(PCR)技术使得建立准确、灵敏、高效的早期病害诊断及病原菌检测成为可能。^iao 等、Wang等利用小麦条锈菌与小麦其它叶部病原菌核糖体ITS序列的差异，设计特异性引物，实现了对小麦条锈病的分子诊断与检测，该技术已经申请专利(专利号CN1888886)。 巢式PCRfcested PCR)是为了提高检测灵敏度，使用两套引物通过两轮PCR特异性扩增目标DNA片断，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断，以提高灵敏度及特异性。2009年Wang等在^iao的工作基础上，设计巢式PCR引物对，利用两管两步巢式PCR方法，可以在小麦条锈病菌潜育24h后检测到小麦条锈病菌的侵入。普通的巢式PCR通常是需要两步反应，在两个PCR管内完成，由于巢式PCR的高灵敏性，存在样品污染、步骤繁琐等缺点。单管巢式PCR(Single tube nested PCR, stn PCR) 是通过内、外两对引物退火温度的差异，实现在单个PCR管内一步完成巢式PCR反应，从而克服普通巢式PCR的不足。目前国内外尚未见基于单管巢式PCR方法检测小麦条锈菌的报道及应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的小麦条锈菌单管一步巢式PCR引物对。小麦条锈病菌潜伏期的幼苗携带的菌量少，与幼苗共同提取的DNA中病菌的DNA 比例极低，进行PCR检测时对引物的特异性、灵敏性要求非常高，针对小麦条锈病菌潜伏期的幼苗的检测，本发明提供了单管一步巢式PCR检测所用的特异引物对，该特异引物对由正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物组成；正向外引物5，-TATGATGGCCACCTTCTCCGTTGTCC-3，；反向外引物5，-AAGTATCGGCCGTGTCTCGGGTCA GA-3，；
正向内引物5，-CCTAAGGTGTCTGATACCGTT-3，；反向内引物5，-GGCATCAAACATTTGCGA-3，。本发明的另一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的小麦条锈菌单管一步巢式PCR检测方法。本发明的小麦条锈菌单管一步巢式PCR检测方法，是以待测小麦叶片或未知病原菌孢子DNA为模板，应用上述的特异引物对，在单个PCR反应管内进行PCR扩增，检测PCR 产物，获得372bp PCR产物的待测小麦或未知病原菌孢子为受到小麦条锈病菌的侵染的小麦或条锈菌孢子。上述正向外引物与正向内引物的摩尔比为1 150。上述正向外引物和反向外引物的摩尔比为1 1 ；上述正向内引物和反向内引物的摩尔比为1:1。上述PCR检测方法中，PCR反应体系为常规PCR反应体系，如Ex Taq Mix 12. 5yL,
0.ΙμΜ上述正、反外引物各1.0μ ，10μΜ的正、反向内引物各1. 5 μ L，20ng/μ L模板DNA
1.0 μ L，用 ddH20 补足至 25. 0 μ L。上述PCR检测方法中，PCR反应程序为适合引物扩增常规PCR反应程序，如95°C 预变性5min ；95°C变性30sec，72°C退火延伸60sec，20个循环；95°C变性30sec，60°C退火 30sec, 72°C延伸 50sec，35 个循环。本发明的再一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的小麦条锈菌单管一步巢式PCR检测试剂盒。本发明的小麦条锈菌单管一步巢式PCR检测试剂盒，含有上述的特异引物对。除了上述特异引物对外，该试剂盒还可以含有进行PCR扩增所需要的试剂，该试剂包括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液等。本发明的特异引物对是根据已报道的小麦条锈菌微管蛋白基因序列设计的引物， 能够将其与小麦其它病害区分开来。本发明利用单管巢式PCR方法，可检测小麦条锈菌DNA 的最低浓度为20fg/μ L，大大提高了检测的灵敏度，对处于潜伏期的病原菌也能及时检测到。本发明采用单管巢式PCR，不需要两次扩增，降低检测成本，方法简单、省时。本发明的方法可用于田间小麦条锈病的早期检测与病害监测，对田间小麦条锈病预防和防治具有重要的有意义。
图1小麦条锈菌内引物Pst-InF/Pst-InR特异性检测图。图2小麦条锈菌内引物Pst-InF/Pst-InR灵敏性检测图。图3单管巢式PCR (stn PCR)灵敏性检测图。图4潜育期小麦叶片的stn PCR检测图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明的实验材料小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici, Pst)共 8 个生理小种或菌系，源于中国农业大学植病流行学实验室单孢繁殖；小麦叶锈菌(P. recondite f. sp. tritici, Prt) > 小麦秆绣菌(P. graminis f. sp. tritici，Pgt)、小麦白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt)分别为2个菌系，来源于中国农科院植保所、河北农业大学，均由中国农业农业大学植病流行学实验室保存收存；小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacereals)、赤霉病菌(Fusarium graminearum)、叶枯病菌 (Alternariatriticina)禾口小麦*艮腐病菌(Cochliobolus sativus)各 1 个菌系，i羊见表 1。
表1.本实验所使用的菌系材料
权利要求
1.单管一步巢式PCR检测的特异引物对，该特异引物对由正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物组成；正向外引物5’ -TATGATGGCCACCTTCTCCGTTGTCC-3，；反向外引物5，-AAGTATCGGCCGTGTCTCGGGTCAGA-3，；正向内引物5’ -CCTAAGGTGTCTGATACCGTT-3，；反向内引物5，-GGCATCAAACAT TTGCGA-3，。
2.权利要求1所述的特异引物对在检测小麦条锈菌中的应用。
3.小麦条锈菌单管一步巢式PCR检测方法，是以待测小麦基因组DNA或未知病原菌孢子DNA为模板，应用权利要求1所述的特异引物对，在单个PCR反应体管内进行PCR扩增， 检测PCR产物，获得372bp的PCR产物的待测小麦或未知病原菌孢子为受到小麦条锈病菌的侵染的小麦或条锈菌孢子。
4.根据权利要求3所述的特异引物对，其特征在于所述外引物与所述内引物的浓度比为 1 150。
5.根据权利要求3或4所述的特异引物对，其特征在于所述正向外引物和所述反向外引物的摩尔比为1 1 ；所述正向内引物和所述反向内引物的摩尔比为1 1。
6.根据权利要求5所述的特异引物对，其特征在于所述PCR反应体系为ExTaq Mix 12. 5yL，0. 1 μ M所述正向外引物、反向外引物各1. 0 μ L，10 μ M的所述正向内引物、反向内引物各 1. 5μ L，20ng/y L 模板 DNA 1. 0μ L，用 ddH20 补足至 25. 0 μ L0
7.根据权利要求5所述的特异引物对，其特征在于所述PCR反应程序为95°C预变性 5min ；95°C变性 30sec，72°C退火延伸 60sec，20 个循环；95°C变性 30sec，60°C退火 30sec, 72°C延伸50sec, 35个循环。
8.含有权利要求1所述特异引物对的小麦条锈菌单管一步巢式PCR检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的小麦条锈菌单管一步巢式PCR检测试剂盒，其特征在于还含有进行PCR扩增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP和/或PCR缓冲液试剂。
全文摘要
本发明涉及一种小麦条锈菌单管一步巢式PCR检测方法及引物。该方法通过在单个PCR反应管内，利用内、外两对小麦条锈病菌特异性引物，一次性完成巢式PCR扩增，通过目标片段判定待测小麦或未知病原菌孢子为受小麦条锈病菌侵染的小麦或小麦条锈菌，内、外两对小麦条锈病菌特异性引物的核苷酸残基的序列如SEQ ID No.1、2、3和4所示。本发明的方法检测灵敏度达20fg，特异性好，简单易行，可用于田间小麦条锈病的早期检测与病害监测。
文档编号C12Q1/68GK102154485SQ20111004313
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月23日 优先权日2011年2月23日
发明者孙振宇, 王海光, 马占鸿, 黄冲 申请人:中国农业大学