专利名称：一种蝉拟青霉菌株的鉴定方法
技术领域：
本专利涉及分子生物学技术领域，具体涉及保藏号为CGMCC No. 3453的蝉拟青霉菌株的鉴定方法。
背景技术：
蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉拟青霉菌寄生后的产物，是ー种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝶棒束孢霉Isaria cicadae。此后出现多种同物异名。如蝶卓 Cordyceps cicadae,基生_束抱 Isaria basiIi,羊克籴球壳抱 Sphaeria sinclairii, 丛生虫壳菌Torrubia caespitosa,辛克莱虫草Cordyceps sinclairii,哈里棒束抱Isariahariottii,小蝶鸾Cordyceps sobolifera,辛克莱棒束抱 Isaria sinclairii,蒙克苏棒束抱 Isaria mokanshawii 和多枝棒束抱 Isaria arbuscula 等等。蝶拟青霉的有性阶段被认为是大蝶草Cordyceps cicadae,在自然界广为分布的是蝉拟青霉，大蝉草稀少。常采到的是蝉拟青霉及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉拟青霉寄生后的虫菌复合体。蝉拟青霉属半知菌类真菌，其孢梗束自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长I. 5 8. O厘米，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。本发明所涉及的蝶拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为 CGMCC No. 3453。该蝶拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]采用如下方法进行分离从云南三江源头采集纯净无污染野生蝉花标本，在浄化工作台上用火焰灭菌过的移植镊从样本上取少量分生孢子于加入孟加拉红的PSA平板上置22°C -25°C下培养120h后再挑取单菌落接入斜面培养基，在22°C _25°C下培养并经反复纯化即可得本发明所述的虫单拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]。蝶拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCC No. 3453 属于半知菌亚门Deuteromycotina,丝抱纲Hyphomycetes,束梗抱目Stilbellales,束梗抱科Stilbellaceae,拟青霉属Paecilomyces。其主要形态特征为在PDA培养基上25°C培养10天，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，背面浅黄色，直径5 6厘米。菌丝无色，分枝，具隔膜，宽I. 2 2.5 μ m。分生孢子梗多分枝，宽3. O 5. 5 μ m，由每轮2 5个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4. 5 6. 5 X 2. 5 3. 5 μ m。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6. 5 8. 8( 11. O) X2. 5 3. 5 μ m。蝶拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCC No. 3453 经试验证实其培养物具有易于培养、产量高的特点，其培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血月旨、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补強壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的エ业化应用价值。由于地理来源不同、寄主不同的蝉拟青霉菌株，其次生代谢产物方面具有较大的变异性。但是现有的蝉拟青霉鉴定方法是通过菌体形态，生长特性及生理反应的特征进行鉴定的，这些形态学鉴定的方法受环境因素影响，难以对形态差异较小的种间和种内菌株加以鉴别。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用RAPD (random amplified polymorphic DNA随机扩增多态性DNA标记)技术鉴定蝶拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCCNo. 3453的方法，以及特定引物和反应条件下蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的RAPD条带图
-i'Tfe レ曰。本发明公开了一种鉴定 !单拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq. ) SamsonCGMCCNo. 3453的方法，包括下列步骤I)提取待检菌株的DNA ；2)对步骤I)获得的待检菌株DNA分别采用下列引物进行PCR扩增S6 TGCTCTGCCC ；SlO CTGCTGGGAC ；S31 CAATCGCCTG ；OPV-14 AGATCCCGCC ；0PW-06 AGGCCCGATG ；3)将步骤2)获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAH)条带图谱；4)将步骤3)获得的待检菌株的RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较
判定获得鉴定結果。进ー步的，步骤2)的引物还包括以下引物中的ー种或多种S7 GGTGACGCAG ；S33 CAGCACCCAC ；S69 CTCACCGTCC ；0PC-10 TGTCTGGGTG ；0PF-06 GGGAATTCGG ；0PG-03 GAGCCCTCCA ；OPH-18 GAATCGGCCA ；0PH-20 :GGGAGACATC。进ー步的，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应体系如下总体积25ul，DNA样本20-50ng,Mg2+ 50n mol,dNTP 5n mol，引物IOp mol，Taq 酶1. 5U (如 TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液2. 5ul (如TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul。进ー步的，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应条件如下先95°C 3分钟；而后依次95°C 40秒，560C I分钟，72°C 2分钟，共循环40次；然后72°C延伸5分钟，最后降温至4で。
进ー步的，所述步骤4)中，将步骤3)获得的待检菌株RAH)条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较，如两者相似度为95%以上，则鉴定待检菌株为蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq. ) Samson CGMCC No. 3453。所述相似度的计算方法为F = 2NXY/(Νχ+Νγ)*100% (其中F为相似度，Nxy为待检菌株RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较后二者相同的条带数，Nx为待检菌株RAPD条带图谱拥有的条带数，Ny为标准样本的RAPD条带图谱拥有的条带数)。采用本发明的鉴定方法，可快速、准确地鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453，并且不受环境影响。
图I :各引物对应的标准样本的RAPD条带图谱I :S6为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是:23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，IOOObp,900bp,800bp,700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 6500 6000bp 之间，5500 4700bp 之间，2600 2300bp 之间，2000 1800bp 之间，1700 1600bp 之间，1450 1350bp之间，1300 1200bp之间。2 :S7为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp,9416bp,6557bp, 2322bp, 2027bp, 1000bp, 900bp, 800bp,700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 4700 3700bp 之间，2000 1800bp 之间，1550 1400bp 之间，1350 1200bp 之间，790 720bp 之间。3 :S10为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR結果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 5700 5200bp 之间，4800 4300bp 之间，2300 2050bp之间，2000 1900bp之间，1850 1700bp 之间，1350 1200bp 之间，920 880bp 之间，830 790bp 之间，740 700bp 之间，450 410bp 之间。4 S31为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR結果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 8100 6900bp 之间，4700 3300bp 之间，2200 1800bp 之间，1650 1300bp 之间，1200 IIOObp 之间，870 830bp之间，690 650bp之间。5 :S33为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR結果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 5000 4000bp 之间，2800 2300bp 之间，2150 200bp 之间，1750 1550bp 之间，1500 1380bp 之间，1200 1050bp 之间，900 850bp 之间。6 S69为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR結果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp, 700bp,600bp, 500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 45000 35000bp 之间， 6000 4300bp 之间，2900 2300bp 之间，2130 1900bp 之间，1500 1270bp 之间，400 380bp之间。7 0PC-10为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR結果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 5000 4300bp 之间，3800 3300bp 之间，2000 1750bp 之间，900 850bp 之间，750 800bp 之间。8 0PF-06为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR結果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 65000 50000bp 之间，6500 4800bp 之间，4300 3800bp 之间，2500 2300bp 之间，1850 1600bp 之间， 1250 1050bp 之间。9 0PG-03为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR結果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 4700 4300bp 之间，4000 2800bp 之间，2400 2050bp 之间，1900 1700bp 之间，1080 IOOObp 之间。10 :0PH-18为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 4300 3600bp 之间，2600 2300bp 之间，1950 1750bp 之间，1650 1350bp 之间，1020 970bp 之间，750 720bp之间，560 540bp之间。11 :0PH-20为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 5500 4300bp 之间，3500 3100bp 之间，2700 2400bp 之间，2350 2280bp之间，1830 1600bp 之间，1050 980bp之间，650 620bp之间，440 420bp之间。12 :0PV-14为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 6400 4700bp 之间，4300 3700bp 之间，2100 2000bp 之间，1950 1800bp 之间，1620 1500bp之间，1350 1250bp 之间，1220 1180bp 之间，830 860bp 之间。13 :0PW_06为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 6000 5200bp 之间，4700 4100bp 之间，3700 3000bp 之间，2200 2070bp 之间,1700 — 1550bp 之间,1500 —1300bp 之间，1050 IOOObp 之间。图2 =RAPD指纹图谱的稳定性试验获得的电泳图谱I S6为引物的RAPD条带图谱2 S10为引物的RAPD条带图谱3 S31为引物的RAPD条带图谱4:0PV-14为引物的RAPD条带图谱
5 0PW-06为引物的RAPD条带图谱6 =OPC-IO为引物的RAPD条带图谱图3 :内不同批次抽提的蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA的RAPD多态性相似度试验获得的电泳图谱I :S6为引物的RAPD条带图谱2 S10为引物的RAPD条带图谱 3 S31为引物的RAPD条带图谱4 :S33为引物的RAPD条带图谱5 =OPV-14为引物的RAPD条带图谱6 0PW-06为引物的RAPD条带图谱7 =OPC-IO为引物的RAPD条带图谱图4 :同一菌株不同传代数的样本DNA的RAPD相似度试验获得的电泳图谱I :S6为引物的RAPD条带图谱2 :S10为引物的RAPD条带图谱3 S31为引物的RAPD条带图谱4 :S33为引物的RAPD条带图谱5 =OPV-14为引物的RAPD条带图谱6 0Pff-06为引物的RAPD条带图谱条带A :第11代的蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453对应的RAPD条带图谱条带B :第10代的蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453对应的RAPD条带图谱条带C :第5代的蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453对应的RAPD条带图谱条带D :第I代的蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453对应的RAPD条带图谱图5 (包括图5-1和图5-2):不同菌株RAPD多态性指纹图谱检测试验获得的电泳图谱I :S6为引物的RAPD条带图谱2 :S7为引物的RAPD条带图谱3 :S10为引物的RAPD条带图谱4 S31为引物的RAPD条带图谱5 :S33为引物的RAPD条带图谱6 :S69为引物的RAPD条带图谱7 =OPC-IO为引物的RAPD条带图谱8 0PF-06为引物的RAPD条带图谱9 0PG-03为引物的RAPD条带图谱10 =OPH-18为引物的RAPD条带图谱11 0PH-20为引物的RAPD条带图谱12 =OPV-14为引物的RAPD条带图谱13 0PW-06为引物的RAPD条带图谱条带E :蛹虫草菌株对应的RAPD条带图谱条带F :细脚拟青霉菌株对应的RAPD条带图谱
条带G :蝉拟青霉菌株B-5对应的RAPD条带图谱条带H :蝉拟青霉菌株Π2对应的RAPD条带图谱条带I :蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453对应的RAPD条带图谱
具体实施例方式下面结合实施例进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中菌种培养及DNA的提取均采用常规方法进行。本发明基于RAPD技术，先人工合成多个随机多态核苷酸序列作为引物，从中筛选出重复性好，扩增条带种间及种内差异明显的随机多态核苷酸序列S6，S7，S10, S31，S33，S69, OPV-14, 0PW-06、0PC-10, 0PF-06、0PG-03、OPH-18 和 0PH-20，并进ー步优化反应条件，从而获得建立了对蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的鉴定方法。 实施例IRAPD指纹图谱的稳定性试验试验操作I.常规方法提取蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA，采用引物S6，S10，S31，S80，OPV-14, 0PW-06, 0PC-10进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带图谱。2. PCR反应条件如下反应体系体积25ul, DNA :20_50ng, Mg2+ :50n mol, dNTP :5n mol,引物IOp mol,Taq酶1. 5U(TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液2. 5ul (TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul，用移液器吹打均匀。PCR反应条件95 °C 3分钟，接下来是95 °C 40秒，56 °C I分钟，72 °C 2分钟，循环40次，然后72°C延伸5分钟，最后降温至4°C。I.琼脂糖凝胶电泳，胶1.5%的琼脂糖胶；缓冲液IX TBE缓冲液(90m MTris-H3BO3, 2m M EDTA)，电压160v,时间:45 分钟。2.图像拍摄，拍摄仪器Tanon 2500。实验结果分别以S6，S10，S31，S80，0PV-14，0PW-06和0PC-10为引物，以同一次提取的蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA为模板的PCR获得电泳图谱(如图2所示)从电泳图谱上看，以同一次抽提的DNA作为模板的PCR反应，得到的主要的随机扩增片段是一致的，按照公式F = 2NXY/(NX+NY)*100% (其中F为相似度，Nxy为二者相同的条带数，Nx为X拥有的条带数，Ny为Y拥有的条代数)，计算二者的相似度为100%。从以上试验结果可以得出，RAPD检测DNA的多态性是一种稳定的方法。实施例2，内不同批次抽提的蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA的RAPD多态性相似度试验操作I.取不同批次提取的蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA，分别以引物S6，S10,S31，S33，OPV-14, 0PW-06, 0PC-10进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带图谱。2. PCR反应条件如下
反应体系体积25ul，DNA :20_50ng，Mg2+ :50n mol, dNTP :5n mol，引物10p mol,Taq 酶IU (TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液2. 5ul (TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul，用移液器吹打均匀。PCR反应条件95 °C 3分钟，接下来是95 °C 40秒，56 °C I分钟，72 °C 2分钟，循环40次，然后72°C延伸5分钟，最后降温至4°C。3.琼脂糖凝胶电泳，胶1.2%的琼脂糖胶；缓冲液IX TBE缓冲液(90m MTris-H3BO3, 2m M EDTA)，电压160v,时间:45 分钟。4.图像拍摄,拍摄仪器Tanon 25 00。实验結果电泳图谱(如图3所示)是36，510，531，(^-14，0 胃-06和0卩(-10为引物，以两次提取的BA001的DNA为模板的PCR反应結果。从电泳图谱上看，以两次不同抽提的DNA作为模板的PCR反应，得到的主要的随机扩增片段是一致的，并且次要扩增片段也存在很高的相似性，按照公式F = 2NXY/Νχ+Νγ*100% (其中F为相似度，Nxy为二者相同的条带数，Nx为X拥有的条带数，Ny为Y拥有的条代数)，计算二者的相似度为98.8%。从以上结果可以得出，本发明的RAPD检测不同样本的DNA多态性是一种稳定的，可操作的方法。实施例3，同一菌株不同传代数的样本DNA的RAPD相似度试验试验操作I.提取同一蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的四个不同传代数的样本的DNA，做RAPD引物S6，S10, S31，OPV-14, 0PW-06进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带图谱。2. PCR反应条件如下反应体系体积25ul, DNA :20_50ng, Mg2+ :50n mol, dNTP :5n mol,引物IOp mol,Taq酶1. 5U(TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液:2. 5ul (TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul，用移液器吹打均匀。PCR反应条件95 °C 3分钟，接下来是95 °C 40秒，56 °C I分钟，72 °C 2分钟，循环40次，然后72°C延伸5分钟，最后降温至4°C。5.琼脂糖凝胶电泳，胶I. 5 %的琼脂糖胶；缓冲液IX TBE缓冲液(90m MTris-H3BO3, 2m M EDTA)，电压160v,时间:45 分钟。6.图像拍摄，拍摄仪器Tanon 2500。实验結果电泳图谱(如图4所示)分别是S6，S10, S31，OPV-14和0PW-06为引物，以ー个菌株的四个不同传代数的样本的DNA为模板的PCR反应結果。从电泳图谱上看，以两次不同抽提的DNA作为模板的PCR反应，得到的主要的随机扩增片段是一致的，并且次要扩增片段也存在很高的相似性，按照公式F = 2NXY/Νχ+Νγ*100% (其中F为相似度，Nxy为二者相同的条带数，Nx为X拥有的条带数，Ny为Y拥有的条代数)，计算第I代样本与第5代样本的相似度为98. 2 %，计算第I带样本与第10代样本的相似度为98. 2%，计算第I带样本与第11代样本的相似度为96. 3 %，计算第5代样本与第10代样本的相似度为100%，计算第5代样本与第11代样本的相似度为98. 2%，计算第10代样本与第11代样本的相似度为98. 2%。由以上实验结果可以得出，RAPD鉴定菌株是ー种稳定的、可操作的方法。实施例4蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453及其它两种蝉拟青霉菌株、细脚拟青霉菌株和蛹虫草菌株RAPD多态性指纹图谱检测实验操作I.取蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453，蝉拟青霉菌株Π2 (分离自安徽繁昌采集的竹蝉蛹)，蝉拟青霉菌株B-5 (分离自上海采集的鳞翅目蛹体)，细脚拟青霉菌株(分离自上海采集的鳞翅目蛹体)，及蛹虫草菌株(分离自黑龙江黑河采集的蚱蝉蛹体)分别培养后提取 DNA，分别采用引物 S6、S7、S10、S31、S33、S69、0PC-10、0PF-06、0PG-03、0PH-18、0PH-20、OPV-14、0PW-06进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带图
-i'Tfeレ曰。引物编号序列对照表
权利要求
1.一种鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的方法，包括下列步骤 1)提取待检菌株的DNA； 2)对步骤I)获得的待检菌株DNA分别采用下列引物进行PCR扩增56TGCTCTGCCC ；SlO CTGCTGGGAC ；S31 CAATCGCCTG ；OPV-14 AGATCCCGCC ；0PW-06 AGGCCCGATG ； 3)将步骤2)获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAH)条带图谱； 4)将步骤3)获得的待检菌株的RAH)条带图谱与标准样本的RAH)条带图谱比较判定获得鉴定結果。
2.如权利要求I所述鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，步骤2)的引物还包括下列引物中的ー种或多种57GGTGACGCAG ；S33 CAGCACCCAC ；S69 CTCACCGTCC ；0PC-10 TGTCTGGGTG ；0PF-06 GGGAATTCGG ；0PG-03 GAGCCCTCCA ；OPH-18 GAATCGGCCA ；0PH-20 :GGGAGACATC。
3.如权利要求I所述鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应体系如下总体积25ul，DNA样本20_50ng，Mg2+ :50n mol,dNTP 5n mol，引物IOp mol, Taq酶1. 5U,酶反应缓冲液2. 5ul,加双蒸水至25ul。
4.如权利要求I所述鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应条件如下先95°C 3分钟；而后依次95°C 40秒，56°C I分钟，720C 2分钟，共循环40次；然后72°C延伸5分钟，最后降温至4で。
5.如权利要求I所述鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述步骤4)中，将步骤3)获得的待检菌株RAH)条带图谱与标准样本的RAH)条带图谱比较，如两者相似度为95%以上，则鉴定待检菌株为蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453。
6.如权利要求5所述鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述相似度的计算方法为F = 2Nノ(Νχ+Νγ)*100% (其中F为相似度，Nxy为待检菌株RAH)条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较后二者相同的条带数，Nx为待检菌株RAPD条带图谱拥有的条带数，Ny为标准样本的RAPD条带图谱拥有的条带数)。
全文摘要
本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo.3453的方法，包括下列步骤提取待检菌株的DNA；对待检菌株DNA分别采用引物S6、S10、S31、OPV-14和OPW-06进行PCR扩增获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAPD条带图谱；将获得的待检菌株的RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较判定获得鉴定结果。采用本发明的鉴定方法，可快速、准确地鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo.3453，并且不受环境影响。
文档编号C12Q1/04GK102643895SQ201110042699
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者孙长胜, 张健, 江三多, 陈超, 魏宁, 鲍晓妮 申请人:上海泛亚生命科技有限公司