专利名称：产氢量提高的基因工程衣藻及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中产氢量提高的基因工程衣藻及其应用。
背景技术：
化石能源不可再生，且大量使用会造成环境污染和气候变化。因此，迫切需要开发可再生清洁新能源。氢能清洁可再生，燃烧只产生水和巨大能量，不产生任何污染物，是最理想的清洁能源。微藻光合产氢是蓝藻和绿藻利用太阳能分解水产氢的过程，具有可再生、制氢过程清洁等明显优点，是直接利用太阳能生物转化制氢的有效途径。由于光合作用水光解放氧和产氢是微藻细胞内两个既相互矛盾又密切关联的复杂生物代谢过程，而目前人们对这些过程发生机制和调节方式还不清楚，致使遗传改造不能有效进行，光能转化制氢的效率得不到显著提高，从源头上严重制约了微藻光合制氢途径的应用。因此高效产氢遗传藻株的构建是推进该途径工业化应用的关键。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基因工程衣藻。本发明所提供的基因工程衣藻，是通过抑制出发衣藻中铁氧化还原蛋白-NADP还原酶编码基因的表达水平，得到的基因工程衣藻。所述抑制所述铁氧化还原蛋白-NADP还原酶编码基因的表达水平是通过RNA干扰实现的。所述RNA干扰是通过将双链RNA的编码DNA导入衣藻细胞中实现的；其中，所述双链RNA的一条链的核苷酸序列是将序列表中序列1的碱基序列中的T替换为U得到的核糖核苷酸序列，另一条链与其反向互补。所述双链RNA的编码DNA是如下双链DNA片段SEQ正向-X-SEQ反向；其中，SEQmW核苷酸序列是序列表中序列1的碱基序列；SEQ反向与所述SEQmK向互补；X是SEQ_与SEQg之间的间隔序列，X与所述SEQ_和SEQfi^1均不互补。所述双链RNA的编码DNA是通过重组表达载体导入所述出发衣藻的；所述重组表达载体为将所述双链RNA的编码DNA插入表达载体Maa7/X^的多克隆位点得到的重组表达载体；所述出发衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株CC-400。本发明的另一个目的是提供所述基因工程衣藻在制备氢气中的应用。本发明的又一个目的是提供一种双链RNA。本发明所提供的双链RNA，为如下所示一条链的核苷酸序列是将序列表中序列1的碱基序列中的T替换为U得到的核糖核苷酸序列，另一条链与其反向互补。
本发明的又一个目的是提供所述双链RNA的编码DNA。所述双链RNA的编码DNA，为如下双链DNA片段SEQ 正向-X-SEQ 反向；其中，SEQmW核苷酸序列是序列表中序列1的碱基序列；SEQ反向与所述SEQmK向互补；X是SEQM与SEQg之间的间隔序列，X与所述SEQm* SEQfi^1均不互补。含有所述编码DNA的重组表达载体也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为将所述编码DNA插入表达载体Maa7/X^的多克隆位点得到的重组表达载体。本发明以光合产氢模式绿藻莱茵衣藻为材料，采用RNA干扰技术(RNAi， RNAinterference)下调光合关键基因FNRl的表达，通过抗性标签筛选获得突变体株系，并用RT-PCR方法在转录水平验证RNAi藻株中FNRl基因下调，经气相色谱测定缺硫处理48 小时时RNAi藻株的产氢量较野生型藻株提高6-10倍。这一突变藻株的获得为微藻光合制氢产业化的实现奠定了基础。
图1为FNRl RNAi载体构建示意图。其中，Pro 启动子；Sp 间隔区；ter 终止子； aphVIII 巴龙霉素抗性标签序列；S、)(h、E、)(b、B代表不同的限制性内切酶酶切位点，分别为SacI、XhoI、EcoRI、XbaI、BamHI ；Maa7 3’ UTR :5_FI 抗性标签序歹lj。图2为野生型衣藻(CC-400)和RNAi克隆(Fl和F3)在含有5_FI (5mM)固体培养基上的生长情况。图3为野生型衣藻(CC-400)和RNAi克隆(Fl和F3)的FNRl基因表达水平变化。图4为野生型衣藻(CC-400)和RNAi克隆(Fl和F3)放氢量的测定结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、通过RNA干扰技术降低FNRl基因表达水平，获得产氢量提高的突变衣藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株CC-400购自杜克大学藻种库 (Chlamycenter)；Maa7/X^载体购自杜克大学藻种库(Chlamy center)；E. coli DH5a菌株购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为D9057。一、方法1、材料培养配制培养基TAP 液体培养基=NH4Cl 0. 4g/L ；MgSO4 · 7H20 0. lg/L ；CaCl2 · 2H20 0. 05g/L ； K2HPO4O. 108g/L ；KH2PO4 0. 056g/L ；Trisbase 2. 423g/L ；亨特微量元素(Hunter's trace elements) lml/L，冰乙酸 lml/L，其余为水；亨特微量元素EDTA50g/L ；BO3H3 11. 4g/L ；ZnSO4 · 7H20 22. Og/L ；MnCl2 ‘ 4H205. 06g/L ；FeSO4 ‘ 7H20 4. 99g/L ；CoCl2 ‘ 6H20 1 · 61 g/L ；CuSO4 · 5H20 1. 57g/L ； Mo7O24 (NH4) 6 · 4H20 1. lg/L，用 20% KOH 调整 pH 值至 6. 5-6.8。缺硫TAP液体培养基将上述TAP液体培养基中的硫酸盐按摩尔比替换成相同阳离子的氯化盐，其余成分和含量均与上述TAP液体培养基相同。TAP固体培养基在上述TAP液体培养基中加1. 5%的琼脂粉。将购得莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株CC-400在超净工作台中用接种针划线至TAP固体培养基上，置于25°C、200 μ E · πΓ2 · s—1条件下培养7天左右。用接种针从TAP固体培养基上挑取单克隆到TAP液体培养基中，在25°C、200 μ E · πΓ2 · s—1的条件下悬浮培养藻细胞5-7天，至OD值为OD75tl ^ 1. 5左右时，得到处于对数生长期CC400细胞。2、FNRl IR RNAi 载体构建依据Gene Bank中已知铁氧化还原蛋白-NADP还原酶(Ferredoxin-NADP reductase) (FNRl)的基因序列(该基因的GeneBank号为5722854)，设计三条引物，分别命名为FNRl-UTR-F gaattcGCAGCGAGGAGCTTCTGCTCT,划线部分为 EcoRI 酶切位点，FNR1-UTR-R1 :agatctAGTCCTCCAGCCCTTCAAGCCA,划线部分为 Bgl11 酶切位点，FNR1-UTR-R2 :agatctCACAAACGACTCCATCCACTCC,划线部分为 Bgl11 酶切位点。以莱茵衣藻藻株CC-400的cDNA为模板，FNRl-UTR-F和FNR1-UTR-R1为引物扩增出对应于FNRl 3’ UTR区域404bp短片段；同时以FNR-UTR-F和FNR1-UTR-R2为引物扩增对应于FNRl 3，UTR区域610bp长片段。将扩增出的片段分别连到克隆载体pEASY-Blimt Simple Cloning Vector (购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB111)上，测序验证。测序结果表明，扩增得到对应于FNRl 3’UTR区域404bp短片段(FNRl-S)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；扩增得到对应于FNRl 3'UTR区域610bp长片段(FNRl-L)， 其核苷酸序列如序列表中序列2所示。分别从测序正确的载体上通过EcoRI和BglII双酶切获得404bp和6IObp的目的条带并回收；同时通过利用EcoRI酶切Maa7/X^载体并回收载体片段。利用T4连接酶将长短两条目的片段与Maa7/X^载体片段连接(图1)，获得目的重组载体。将获得的重组载体转化DH5 α菌株，通过氨苄青霉素筛选，获得抗性克隆，提取抗性克隆质粒利用EcoRI和BglII双酶切，进行1. O%琼脂糖凝胶电泳检测，获得了大小分别为404bp和610bp的目的片段，则确定为阳性克隆；提取阳性克隆质粒进行测序验证， 测序结果表明该重组载体中插入EcoRI酶切位点的DNA为SEQ1^1-X-SEQ；其中，SEQ正一勺核苷酸序列是序列表中序列1的碱基序列；SEQg与所述SEQttK向互补；X是SEQtt 与SEQg之间的间隔序列，X与所述SEQm* 均不互补。X的核苷酸序列为序列表中序列2第405位到610位所示。该DNA编码shRNA，shRNA再被衣藻体内的酶剪切成双链小干扰RNA，以实现RNA干扰。此测序结果说明重组载体构建正确，将该重组载体命名为FNRl IR RNAi 载体。3、细胞转化及FNRl RNAi克隆筛选验证将步骤2得到的FNRl IR RNAi载体用McI酶切使之线性化后，将此线性化载体(IOyg)与步骤1培养得到的对数生长期CC-400细胞(l*108Cells)以及直径为 425-600 μ m的玻璃珠(0. Ig)混合均勻，置于涡旋振荡器上(7档)振荡15秒，去除玻璃珠，获得转化细胞。将转化后的细胞涂布在含巴龙霉素(5yg/mL)和5-氟吲哚(5_FI，5mM)的 TAP固体培养基上，在25°C、小于50μ E · m_2 · s—1弱光下培养，约三周后长出单克隆。用牙签将野生型(CC400)和RNAi单克隆藻株(Fl和挑到约IOml TAP液体培养基的50ml 三角瓶中培养至对数生长期，将细胞稀释至不同浓度(NlO6ceIlsmr1和l*105cells ml—1) 滴加至含5-FI (5mM)的TAP固体培养基上再次筛选验证，以野生型CC400为对照藻株，能在含5-FI(5mM)的固体TAP培养基上生长的藻株为阳性藻株。7天后观察，结果如图2所示， RNAi克隆Fl和F3均可以在含5-FI (5mM)固体培养基上生长，野生型CC400则不能存活，由此可证明两个RNAi克隆(Fl和F3)是阳性克隆。4、半定量RT-PCR验证FNRl基因的表达(1)提取样品总RNA离心(离心的转速为2，500g，温度为4°C，时间为^iin)收集步骤3得到的Fl阳性克隆和F3阳性克隆以及野生型CC400衣藻细胞，使用天根生化科技(北京)有限公司植物总RNA提取试剂盒提取样品的总RNA，用RNase-free DNase I (购自Takara公司)消化制备的总RNA，以去除其中可能残留的DNA。(2)半定量 RT-PCR分别以上述提取的Fl阳性克隆和F3阳性克隆以及野生型CC400衣藻细胞总RNA 为模板，用Oligo(dT)反转录引物和Quant反转录酶(购自天根生化科技有限公司)进行反转录，分别得到cDNA。根据要检测基因的3’末端片段设计特异引物上游引物GCCTGGACTACGCCCTGTC，下游引物GCTGCTTTCGCCGCTGTTA，分别以cDNA为模板，进行PCR扩增基因FNR1， 以18s rRNA作对照，扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，半定量RT-PCR重复三次。结果如图3所示。RNAi克隆Fl和F3的FNRl基因表达水平较野生型CC-400下调明显，这一结果证实这两个RNAi克隆(Fl和F3)的FNRl基因的表达确实受到抑制。5、测定不同藻株放氢量(1)缺硫处理将步骤3得到的Fl阳性克隆和F3阳性克隆以及野生型CC400衣藻分别接种到IL 的TAP液体培养基中，在温度为25°C和光强为200μ E · m_2 · s—1的连续光照条件下搅拌培养3-5天，至OD75tl ^ 1. 5时，得到处于对数生长期的细胞。2，500g离心2分钟，收集对数生长期的细胞(细胞密度为2X 106-5X IO6个· ml—1)，用TAP-S培养基洗涤一次，将沉淀用少量TAP-S培养基悬浮，取20ul悬浮藻液，加入980ul缺硫培养基。混合均勻后加入丙酮，5000rpm离心5分钟，测定上清液663nm和645nm处的吸光值，根据公式(Chi (a+b)= 8. 02*0D663+20. 21*0D645)计算总叶绿素含量。将悬浮液转移到IOOmL的放氢瓶(Schott type, Germany)中，用TAP-S培养基补充体积至IOOmL,通过计算所得到的总叶绿素含量及培养体积调整培养体系的最初叶绿素浓度为SOyg.mr1。用胶塞封闭瓶口，用石蜡封住瓶口，以防止气体外漏。将培养瓶置于温度为25°C和在光照强度为200μ E · πΓ2 · s—1培养箱中培养，分别取不同的时间点测定放氢量。采用SHIMADZU GC-2014气相色谱测定氢气含量，载气为氮气。测定时用ImL注射器吸取放氢瓶气体部分500 μ L，注入进样孔，用甲烷外标法计算气体体积。
测定放氢量时气相色谱参数设置为检测器=TCD检测器；氮气流速:60ml · mirT1 ；检测器温度100°C ；柱温:60°C ；进样口温度100°C。结果利用气相色谱测定的野生型藻株(CC400)和RNAi克隆(Fl、F3)的光合产氢情况如图4所示。从图中可见，两个RNAi克隆的放氢量明显高于野生型藻株。用H2和CH4的峰面积比值，计算出吐的体积，如表1所示。可以看出缺硫M小时时，野生型藻株刚刚开始产氢，产氢量仅为31. 8μ Ι/lOOmL培养基，而此时Fl和F3的产氢量则均高于130μ 1/lOOmL 培养基，是野生型藻株的4倍以上。缺硫处理48小时时，Fl和F3的产氢量分别达到 299. 5 μ 1/IOOmL培养基和500. 2 μ 1/IOOmL培养基，是野生型的6-10倍。表1野生型藻株(CC400)和RNAi克隆(F1、F3)的光合产氢量
权利要求
1.一种基因工程衣藻，是通过抑制出发衣藻中铁氧化还原蛋白-NADP还原酶编码基因的表达水平，得到的基因工程衣藻。
2.根据权利要求1所述的基因工程衣藻，其特征在于所述抑制所述铁氧化还原蛋白-NADP还原酶编码基因的表达水平是通过RNA干扰实现的。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程衣藻，其特征在于所述RNA干扰是通过将双链RNA的编码DNA导入所述出发衣藻中实现的；其中，所述双链RNA的一条链的核苷酸序列是将序列表中序列1的碱基序列中的T替换为U得到的核糖核苷酸序列，另一条链与其反向互补。
4.根据权利要求1-3中任一所述的基因工程衣藻，其特征在于所述双链RNA的编码 DNA是如下双链DNA片段SEQm -X-SEQ反向；其中，SEQ1^1的核苷酸序列是序列表中序列1的碱基序列； 与所述SEQmK向互补；X是SEQM与SEQg之间的间隔序列，X与所述SEQm* 均不互补。
5.根据权利要求1-4中任一所述的基因工程衣藻，其特征在于所述双链RNA的编码DNA是通过重组表达载体导入所述出发衣藻的；所述重组表达载体为将所述双链RNA的编码DNA插入表达载体Maa7/X^的多克隆位点得到的重组表达载体；所述出发衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株CC-400。
6.权利要求1-5中任一所述的基因工程衣藻在制备氢气中的应用。
7.一种双链RNA，为如下所示一条链的核苷酸序列是将序列表中序列1的碱基序列中的T替换为U得到的核糖核苷酸序列，另一条链与其反向互补。
8.权利要求7所述双链RNA的编码DNA，为如下双链DNA片段SEQ正向反向；其中，SEQ1^1的核苷酸序列是序列表中序列1的碱基序列； 与所述SEQmK向互补；X是SEQM与SEQg之间的间隔序列，X与所述SEQm* 均不互补。
9.含有权利要求8所述编码DNA的重组表达载体。
10.根据权利要求9所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将所述编码DNA插入表达载体Maa7/X^的多克隆位点得到的重组表达载体。
全文摘要
本发明公开了产氢量提高的基因工程衣藻及其应用。本发明所提供的基因工程衣藻，是通过抑制出发衣藻中铁氧化还原蛋白-NADP还原酶编码基因的表达水平，得到的基因工程衣藻。经气相色谱测定，缺硫处理48小时该基因工程衣藻产氢量较野生型藻株提高6-10倍。这一突变藻株的获得为微藻光合制氢技术的产业化奠定了基础。
文档编号C12P3/00GK102181369SQ20111004528
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者孙永乐, 陈梅, 黄芳 申请人:中国科学院植物研究所