专利名称：拟南芥花和胚胎特异启动子el5和el6及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地说，涉及一种拟南芥花和胚胎特异启动子EL5和EL6及其应用。
背景技术：
启动子是基因中重要的顺式作用元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处，其核心结构包括TATA-box和CAAT-box，除核心结构外，还包含转录起始位点、组织特异表达元件和其他调控元件，如生物胁迫和非生物胁迫的诱导元件，这对研究基因的表达和功能具有重要的作用，同时受诱导的启动子能够通过诱导控制该基因在特定的时间和特定的空间表达，并发挥特定的功能。启动子根据转录模式不同可分为三种组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组织或器官特异性启动子的活性是受特定的组织细胞结构和化学、物理信号诱导调节的，即这类启动子的表达具有特定的时空性。在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免目标基因在其他组织器官中表达造成的不利影响。到目前为止，已有大量的组织或器官特异性启动子被分离出来，其中包括花特异启动子和种子特异启动子。如花粉发育有关的组织特异性启动子如TA29、Lat52、0sg6B、 Zml3,Sl等已有详细研究报道；UBC6启动子(Watts，1994)主要在花中表达；Tspl是水稻中绒毡层特异启动子(马沁沁，2005) ；DefH9是子房特异启动子(Rotino，1997) ；PtNIPl是柏树胚胎发育特异性启动子(Vincent，200 。这些启动子都能特异启动目标基因的表达，改变特异组织器官的发育。但能同时在花和胚胎中特异表达的启动子鲜有报道。ESD4是拟南芥中的一种去SUMO化酶，它调节植物中的蛋白质SUMO化修饰状态。 EL5和EL6 (ESD41ike 5和6)是拟南芥中ESD4的同源基因，在活性上，EL5和EL6与ESD4 具有共同的去SUMO化酶活性，但是生理机制不完全相同。ESD4主要影响植物的开花，EL5 和EL6则通过调节花器官、雄配子体、雌配子体及胚胎的发育，从而影响植物的育性。
发明内容
本发明的目的是提供一种从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离出的花和胚胎特异启动子 EL5(ESD4Like 5)和 EL6 (ESD4Like 6)。本发明的另一目的是提供启动子EL5和EL6在植物花和胚胎发育调节中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种拟南芥花和胚胎特异启动子EL5，其具有a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或b) SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。如在不改变启动子功能的情况下，将第28位的C取代为T，将第222位的C取代为T，将第2369位的G取代为A，将第 M73位的T取代为C。
本发明的一种拟南芥花和胚胎特异启动子EL6，其具有c)SEQID NO. 2所示的核苷酸序列；或d)SEQ ID No. 2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由c)衍生的核苷酸序列。如在不改变启动子功能的情况下，第3位后增加了 C， 将第952位的A取代为T，将第1099位的A取代为G，将第M81位的T取代为C。本发明还提供了从拟南芥基因组中克隆得到2500bp的EL5序列所用的引物，其包括正向引物 5，-CTCCCTTATCGTGTTGACA-3，和反向引物 5，-CGCTAGGGAAATCTGAGGAA-3，。本发明还提供了从拟南芥基因组中克隆得到2501bp的EL6序列所用的引物，其包括正向引物 5，-CTGCTGATTATCTCGTTC-3，和反向引物 5，-CCAGTATTATTCTGGCGCCG-3，。本发明还提供了含有启动子EL5和EL6的载体以及含有所述载体的宿主细胞。本发明还提供了含有启动子EL5和EL6的转化植物细胞。本发明还提供了启动子EL5和EL6在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GUS基因。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体及质粒。本发明首次分离了拟南芥花和胚胎特异启动子EL5和EL6，利用启动子EL5和EL6 过表达拟南芥、大豆⑶S基因，结果表明启动子EL5和EL6可明显促进植物花器官和胚胎中 ⑶S基因的表达量，因而，EL5和EL6启动子在植物花器官和胚胎中具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花和胚胎中特异表达目标基因。
图1为质粒pGreen-GW-GUS的结构示意图2为拟南芥EL5-GUS在花器官(雌蕊)中的表达结果；
图3为拟南芥EL5-GUS在花器官(雄蕊、花粉)中的表达结果；
图4为拟南芥EL5-GUS在花器官(花粉)中的表达结果；
图5为拟南芥EL5-GUS在花器官中的表达结果；
图6为拟南芥EL5-GUS在胚胎中的表达结果；
图7为拟南芥EL5-GUS在胚胎中的表达结果；
图8为拟南芥EL5-GUS在胚胎中的表达结果；
图9为拟南芥EL5-GUS在胚胎中的表达结果；
图10为拟南芥EL6-GUS在花器官中的表达结果；
图11为拟南芥EL6-GUS在胚胎中的表达结果；
图12为拟南芥EL6-GUS在胚胎中的表达结果；
图13为拟南芥EL6-GUS在胚胎中的表达结果；
图14为拟南芥EL6-GUS在胚胎中的表达结果；
图15A为拟南芥EL5-GUS在花序中的表达结果，B为拟南芥EL6-GUS在花序中的表达结果；
图16为拟南芥EL5-GUS及EL6-GUS的PCR检测结果。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。实施例1拟南芥EL5和EL6启动子的克隆禾Ij 用正向弓丨物5，-CTCCCTTATCGTGTTGACA-3， 和反向引物 5’ -CGCTAGGGAAATCTGAGGAA-3’从拟南芥基因组中PCR扩增并测序获得长度为2500bp的 EL5启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。禾Ij 用正向弓丨物5，-CTGCTGATTATCTCGTTC-3， 和反向引物 5，-CCAGTATTATTCTGGCGCCG-3，从拟南芥基因组中PCR扩增克隆并测序获得长度为2501bp 的EL6启动子，其核苷酸序列如SEQ IDN0. 2所示。上述PCR扩增体系为QO μ 1体系)LA Taq 酶0. 2 μ 1IOx 缓冲液2. 0 μ 1dNTP(各 2.5mM) Ι.ΟμΙ引物 I(IOuM)1. 0μ 1引物 2 (IOuM)1. 0μ 1DNA 模板Ι.ΟμΙddH2013. 8 μ 1
72 °C 2 min 30sec
72 °C IOmin实施例2拟南芥EL5和EL6启动子调控下游基因⑶S的表达分别将EL5和EL6启动子克隆并与GUS基因融合，然后将获得的融合基因构建表达载体pGreen-GW-GUS (质粒pGreen-GW-GUS的构建过程为采用feiteWay重组克隆的方法(Invitrogen)，先通过BP反应将PCR产物重组到pD0NR207，然后通过LR反应重组到含 ⑶S报告基因的目的载体pGreen-GW-GUS上。pGreen-GW-GUS的结构如图1所示)，获得双元表达载体PEL5-GUS和pEL6-GUS ；将植物表达载体pEL5_GUS和pEL6_⑶S转化至大肠杆菌DH5ci中扩繁。大肠杆菌感受态细胞的转化，包括(1)制备含氨苄青霉素的LB固体培养基；( 取出贮存于-80°C的感受态细胞，冰浴中融化后，加入2μ 1质粒轻轻混勻，冰浴中放置30分钟；C3)42°C热激30秒，然后立即置于冰浴中3分钟；加入300 μ 1不含抗生素的 LB液体培养基，37°C摇床振荡培养1小时(160rpm) ； (4)取适量培养液均勻涂于选择性培养基上，37°C倒置培养12-20小时，用灭菌牙签挑取5-10个(或更多)菌落，置于200 μ 1 选择性液体LB培养基中摇菌培养；(5)PCR检测筛选到的阳性克隆(图16)。通过农杆菌介总体积PCR 程序
权利要求
1.拟南芥花和胚胎特异启动子EL5，其特征在于，其具有a)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或b)SEQID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。
2.拟南芥花和胚胎特异启动子EL6，其特征在于，其具有c)SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；或d)SEQID No. 2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由c)衍生的核苷酸序列。
3.含有权利要求1或2所述启动子的载体。
4.含有权利要求3所述载体的宿主细胞。
5.含有权利要求1或2所述启动子的转化植物细胞。
6.权利要求1或2所述的启动子在调控下游基因表达中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，下游基因为GUS基因。
全文摘要
本发明提供了一种拟南芥花和胚胎特异启动子EL5和EL6，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，利用启动子EL5和EL6过表达拟南芥、大豆GUS基因，结果表明启动子EL5和EL6可明显促进植物花器官和胚胎中GUS基因的表达量，因而，EL5和EL6启动子在植物花器官和胚胎中具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花和胚胎中特异表达目标基因。
文档编号C12N1/19GK102485895SQ20111004589
公开日2012年6月6日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者傅永福, 张晓玫, 柳霖坡, 江颖 申请人:中国农业科学院作物科学研究所