专利名称：Rt-lamp检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术与医学领域，更具体的说，涉及RT-LAMP恒温基因扩增的方法在快速检测人体血衆/清或其他体液中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的有无以及半定量检测中的应用。
背景技术：
环介导等温扩增技术(Loop—mediatedisothermal amplifieation, LAMP)是2000年Notomi等发明的体外等温扩增特异核酸片段的技木。该技术利用针对基因序列中6个特异性片段的两对特殊引物和有链置换活性的Bst (Bacillus stearotherrnophilus)DNA聚合酶，使模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在60-65°C恒温条件下使引物与模板结合并进行链置换扩增反应。LAMP可以在60分钟内扩增出IO9 IOltl倍靶序列拷贝，结果可用直观的荧光或电泳检测，也可用焦磷酸镁浊度法检测。环介导等温扩增技术起始于DNA的扩增，适用于DNA基因组的检測。随后，检测RNA基因组的反转录-环介导扩增技术也被提出，即是在LAMP扩增之前加上反转录步骤。目前，已有甲型流感病毒、猪瘟病毒等多种RNA病毒的RT-LAMP扩增方法被提出。丙型肝炎是由丙型肝炎病毒HCV引起的严重危害健康的感染性疾病。目前，对于HCV的检测主要依靠免疫学方法即抗体的检测，这种方法实际检测的是被感染者对于感染的免疫反应情況。对于HCV载量的检测，目前主要依赖Realtime-PCR技术，该技术需要定量PCR仪等昂贵设备，难以在基层及现场开展。将RT-LAMP技术用于HCV的测定已有相关报道，目前技术方法的结果判断有实时法和終点法，实时法需要使用定量PCR仪；终点法主要面临非特异扩增的问题。现有的HCV载量检测技术的主要不足是能够实现较精确定量的Realtime-PCR等方法仪器设备要求、人员操作要求高；而现有的RT-LAMP方法主要是以终点法进行检测，无法实现对于HCV载量的定量，且对于体系污染等假阳性缺乏监测，影响了这些方法的实际应用。
发明内容
本发明的目的在于提供RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，可以实现人体血浆/清或其他体液中丙型肝炎病毒的快速半定量和定性检测。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案=RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，包括以下步骤
(I)选取HCV的特异性基因片段用于LAMP扩增；(2)用于HCV基因扩增的结果判断；步骤(I)中用于HCV基因扩增的特异性引物为
F3 GCAGAAAGCGTCTAGCCA ； B3 CTCGCAAGCACCCTATCA ；
FIP TACTCACCGGTTCCGCAGTTTTTGCAGCCTCCAGGACCCC ；BIP TGGAGATTTGGGCGTGCCTTTTTGCCTTTCGCGACCCAACA ；
用于HCV基因扩增的体系为ニ步法或者一歩法； 步骤(2)中在检测时使用Sybgreen染液实时观察，加入梯度浓度的标准品以及阴性血清对照，在紫外灯下每5分钟对标准品、对照及待测样本直接观察，即可获得待测样本的HCV载量。所述ニ步法第一步反转录的体系为总体积20 U I ;其中10XAMV缓冲液2 ii I,HCVRNA 模板 2 ii 1，AMV 酶 Iii I, dNTP 2u 1，其中 dATP、dlTP、dCTP、dGTP 浓度各 10 mM，引物 B3
1u 1，补足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 y I ;
ニ步法第一步反转录的反应条件为50°C 30分钟；
ニ步法第二步扩增的体系为总体积20iU ;其中IOXBst DNA pol大片段缓冲液
2iil，第一步反转录的产物 2 iil，Bst DNA pol 大片段 I iil，dNTP 4 yl，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 浓度各 10 mM,引物 F3、B3 各 0. 1，引物 FIP、BIP 各 2 y 1，IOOXSybgreen2 U 1，补足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 y I ;
ニ步法第二步扩增的反应条件为62°C 60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察一次结果。所述ー步法的体系为总体积20 U I ;其中IOXBst DNA pol大片段缓冲液2 yl，HCV RNA 模板 2 ii 1，AMV 酶 I ii 1，Bst DNA pol 大片段 I ii 1，dNTP 4u 1，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 浓度各 10 mM，引物 F3、B3 各 0. 1，引物 FIP、BIP 各 2 y 1，IOOXSybgreen2 U 1，补足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 y I ;
ー步法的反应条件为50°C 20分钟；62°C 60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察一次结果。LAMP扩增的温度为60 V -650C，优选为62°C。本发明的优点在于本发明公开的技术方案实现了 RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的新的应用，对于硬件设备的要求低，不需要PCR仪、定量PCR仪、电泳仪、成像仪等设备，仅需水浴箱和紫外灯即可，操作简便快捷，适用于现场或基层检测。本实验方法既可以用于定性检测(一歩法)HCV病毒的有无，也可以用于HCV病毒载量的初歩判断(ニ步法半定量)。本实验方法使用Sybgreen染液实时观察，结果判断方便快速，且可以有效监测可能存在的LAMP反应的污染或假阳性結果。
图I为常规Real-time PCR的检测結果。图2为使用定量PCR仪检测的RT-LAMP的检测結果。图3为RT-LAMP反应40分钟产物的电泳结果。图4为RT-LAMP反应60分钟产物的电泳結果。图5为60分钟时的直接目测结果，其中上为白光照射，下为紫外光照射。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。实施例一快速检测丙型肝炎病毒载量的RT-LAMP检测方法。
I、选取HCV的特异性基因片段用于LAMP扩增。目前，已经完成基因组测序的HCV主要有6型，这6型也是目前最主要的HCV流行株。因此，为了实现对这些主要的不同型别的HCV载量进行检测，就必须选取不同型别HCV的保守基因片段以供扩增。应用DNAMAN等软件对不同型别的HCV进行比较，选定5-UTR区域作为HCV的候选基因扩增区域。II、用于HCV基因扩增的特异性引物。在本方案中，用于HCV基因扩增的特异性引物为
F3 GCAGAAAGCGTCTAGCCA B3 CTCGCAAGCACCCTATCA
FIP TACTCACCGGTTCCGCAGTTTTTGCAGCCTCCAGGACCCCBIP :TGGAGATTTGGGCGTGCCTTTTTGCCTTTCGCGACCCAACA。III、用于HCV基因扩增的体系和反应条件(ニ步法、ー步法)。本方案中，HCV基因扩增可由ニ步法或一步法进行。ニ步法第一步反转录的体系为总体积20 U I ;其中10XAMV缓冲液2 ii I,HCV RNA模板2 u 1(抽提自血清等体液，常规酚-氯仿法或者病毒RNA试剂盒抽提均可)，AMV酶I yl(20 单位)，dNTP 2 ill (dATP、dlTP、dCTP、dGTP 浓度各 10 mM)，引物 B3 I y 1，补足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 U I。ニ步法第一步反转录的反应条件为50°C 30分钟。ニ步法第二步扩增的体系为总体积20 U I ;其中IOXBst DNA pol大片段缓冲液
2ii I，第一步反转录的产物 2 iil，Bst DNA pol 大片段 I iil(8 单位)，dNTP 4 yl( dATP、dTTP、dCTP、dGTP 浓度各 10 mM),引物 F3、B3 各 0. 5 y 1，引物 FIP、BIP 各 2 y 1，IOOXSybgreen2u I，补足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20y I。ニ步法第二步扩增的反应条件为62°C 60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察ー
次結果。ー步法的体系为总体积20 U I ;其中IOXBst DNA pol大片段缓冲液2 yl，HCVRNA模板2 u I (抽提自血清等体液，常规酚-氯仿法或者病毒RNA试剂盒抽提均可)，AMV酶I u I (20 单位)，Bst DNA pol 大片段 I ii I (8 单位)，dNTP 4u I (dATP、dTTP, dCTP、dGTP浓度各10 mM)，引物F3、B3各0.5111，引物卩1 、81卩各2111，100\37ゎ8代611 2yl，补足DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 U I。ー步法的反应条件为50°C 20分钟；62°C 60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察
一次結果。IV、用于HCV基因扩增的结果判断。对于HCV基因扩增的结果判断，目前常用的Realtime-PCR方法需要专用设备，而RT-LAMP方法又多为终点法。本方案将通常最终浓度为IX的Sybgreen染液浓度扩大到10X，以有效増加目測的灵敏度，每隔5分钟观察一次结果，可以根据目测荧光判断待测样本中HCV的有无，附以梯度稀释的标准品后，可以初步判断HCV载量(半定量)。同时由于一步法RT-LAMP检测有一定的假阳性率，本方案在实验工程中加入阴性样本对照，可以有效控制终点法结果观测的假阳性率。
附图为HCV载量检测方法的结果判断，图I为常规Real-time PCR的检测结果；图2为使用定量PCR仪检测的RT-LAMP的检测结果；图3、图4为RT-LAMP反应40和60分钟产物的电泳结果，可见对不同浓度的HCV样本可以实现半定量；图5为60分钟时的直接目测结果(上为白光照射，下为紫外光照射)。从图3、图4可以看出，RT-LAMP对于不同浓度的HCV样本可以实现半定量，但随着反应时间的延长，在图4的低浓度样本条带中，可见到非特异性的扩增。由于LAMP反应是在60-65°C (本方案优选62°C )下进行等温扩增，整个体系中的DNA链处于不稳定状态，因此随着反应时间延长，极易产生非特异性扩增导致假阳性。因此本方案的检测中加入阴性对照并每隔5分钟观察一次荧光结果，可以有效降低非特异性扩增对结果判断的影响。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，包括以下步骤 (I)选取HCV的特异性基因片段用于LAMP扩增；(2)用于HCV基因扩增的结果判断；其特征在干， 步骤(I)中用于HCV基因扩增的特异性引物为F3 GCAGAAAGCGTCTAGCCA ；B3 CTCGCAAGCACCCTATCA ；FIP TACTCACCGGTTCCGCAGTTTTTGCAGCCTCCAGGACCCC ；BIP TGGAGATTTGGGCGTGCCTTTTTGCCTTTCGCGACCCAACA ； 用于HCV基因扩增的体系为ニ步法或者一歩法； 步骤(2)中在检测时使用Sybgreen染液实时观察，加入梯度浓度的标准品以及阴性血清对照，在紫外灯下每5分钟对标准品、对照及待测样本直接观察，即可获得待测样本的HCV载量。
2.根据权利要求I所述的RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，其特征在于，所述ニ步法第一步反转录的体系为总体积20μ I ;其中IOXAMV缓冲液.2 μ 1，HCV RNA 模板 2 μ 1，AMV 酶 I μ 1，dNTP 2 μ 1，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 浓度各 10mM，引物 B3 I μ I，补足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 μ I ； ニ步法第一步反转录的反应条件为50°C，反应30分钟； ニ步法第二步扩增的体系为总体积20 μ I ;其中IOXBst DNA pol大片段缓冲液.2 μ 1，第一步反转录的产物 2 μ 1，Bst DNA pol 大片段 I μ 1，dNTP 4μ 1，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 浓度各 10 mM,引物 F3、B3 各 O. 5μ 1，引物 FIP、BIP 各 2 μ 1，IOOXSybgreen.2 μ 1，补足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 μ I ; ニ步法第二步扩增的反应条件为62°C，反应60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察ー次結果。
3.根据权利要求I所述的RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，其特征在于，所述ー步法的体系为总体积20μ I ;其中IOXBst DNA pol大片段缓冲液.2 μ 1，HCV RNA 模板 2 μ 1，AMV 酶 I μ 1，Bst DNA pol 大片段 I μ 1，dNTP 4 μ 1，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP浓度各 10 mM，引物F3、B3 各 O. 5 μ 1，引物FIP、BIP各 2 μ I, IOOXSybgreen.2 μ 1，补足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 μ I ; ー步法的反应条件为50°C，反应20分钟；62°C，反应60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察一次結果。
4.根据权利要求I所述的RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，其特征在于，LAMP扩增的温度为60°C -65°C。
5.根据权利要求4所述的RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，其特征在于，LAMP扩增的温度为62°C。
全文摘要
本发明公开RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，包括以下步骤(1)选取HCV的特异性基因片段用于LAMP扩增；(2)用于HCV基因扩增的结果判断；用于HCV基因扩增的体系为二步法或者一步法；步骤(2)中在检测时使用Sybgreen染液实时观察，加入梯度浓度的标准品以及阴性血清对照，在紫外灯下每5分钟对标准品、对照及待测样本直接观察，即可获得待测样本的HCV载量。本发明对于硬件设备的要求低，操作简便快捷，适用于现场或基层检测，且本发明既可以用于定性检测HCV病毒的有无，也可以用于HCV病毒载量的初步判断。
文档编号C12Q1/68GK102649981SQ201110045349
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者李擎天, 熊慧, 王颖, 郭晓奎, 金维荣 申请人:上海交通大学医学院