专利名称：一种矮败水稻培育方法及其所用到的dna的制作方法
技术领域：
本发 明涉及通过基因工程技术培育水稻植株的方法，具体为培育雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株的方法，更具体的涉及利用RNAi技术对水稻花药发育相关基因和对茎杆有伸长作用的基因的表达进行干扰并实现同时下调或沉默，使水稻植株同时表现出矮秆性状和雄性不育，并呈现完全连锁显性遗传。
背景技术：
轮回选择是一种周期性的群体改良方法，以遗传背景丰富的群体为基础，经过周期性地反复异交和选择，集结有益基因，使群体内的优良或增效基因频率逐步增加，不良或减效基因频率不断降低；有利于打破优良基因与不良基因间的连锁，不断提高基因重组体水平；在群体不断改良的同时，保持较高的遗传多样性，为新的优良外缘基因最大表达提供广泛的背景基因型，既可快速有效地改良目标性状，又可提高新种质的利用率和适应性， 进一步增加群体的遗传多样性和长期保持对重要农艺性状进行改良的遗传潜力[1’2]，最终使群体得到改良的育种方法。轮回选择尤其适合于对呈数量遗传的性状进行改良，如提高产量及其构成因素、改善种子和植株品质、提高抗病虫性和对不良环境的耐受性等[3]。如 Sprague从1939年开始用轮回选择方法进行玉米改良，然后从不同轮的改良群体中陆续选出了 B14、B37、B73、B84等一大批优良自交系。Illinois大学对玉米子粒成分的选择，从 1896年开始，经过103轮对高蛋白(IHP)、高油(IHO)、低蛋白(ILP)、低油(ILO)的长期定向选择，证明选择对改变子粒化学成分的巨大作用[4]。在轮回选择整个过程中需要不同的植株进行大量的杂交和混合，玉米等异花授粉作物因容易操作，很早就开始大范围的应用并取得了显著的效果。水稻由于是自花授粉作物需要靠人工去雄授粉配制杂交组合，费工费时，杂交组合数量和分离群体规模受到很大限制。尽管目前水稻已经有很多不育系，但是利用雄性不育系时，正常品种需要具有育性恢复能力，有限的细胞质雄性不育系和恢复系资源制约着水稻轮回选择的广泛开展。而光敏核不育材料的利用虽可解决恢复系资源窄的问题，但其本身的育性易受环境影响、异交结实率低等问题又限制着轮回选择育种的快速发展[5]。此外，单独的雄性不育，只有开花时才能辨认，很难在短时间内大规模地标记区分，势必限制规模的扩大。同时，不育株和可育株同高，导致在授粉时较高植株的花粉有更大的授粉几率，经过几轮选择后，群体有增高的趋势影响作物的丰产性[6]。因此选择矮秆性状标记雄性不育，不仅可以提高不育株的异交率， 又可同时防止群体的逐渐增高。矮秆性状标记雄性不育性状必须是矮秆性状基因与雄性不育基因完全连锁或紧密连锁，才能达到矮秆性状的植株全是雄性不育，高秆的全是可育植株。但在自然界，矮秆性状基因和雄性不育基因在同一条染色体而且紧密连锁的概率非常低，通过常规的方法先找到显性雄性不育基因和矮秆性状基因再将两个基因聚合，一般很难实现。目前仅在小麦中通过常规杂交育种技术获得了矮败小麦。刘秉华等用太谷核不育小麦作材料，以“矮变一号”为标记供体，从杂交后代群体中筛选到显性不育基因Ms2与显性矮秆基因RhtlO在4D染色体短臂呈紧密连锁遗传的材料，其交换率仅为0. 18% [7_1(1]。实践证明，在水稻中通过常规杂交技术，难以获得雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，创新性地通过基因工程技术获得雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻材料，即矮败水稻。因此，本发明的目的是通过RNAi干扰技术，针对水稻花药发育相关基因和茎杆伸长相关基因，使得两种基因表达下调或沉默，使水稻植株同时表现矮秆性状和雄性不育性状，并且表现为显现完全连锁。其中，本发明所述基因的概念是指包括基因的5’端非编码区、外显子、内含子和3’端非编码区。首先，花药发育相关基因可以选择对花药发育有重要作用的基因，只要其表达下调或缺失即能导致花粉败育即可。本发明中，优选花药发育相关基因为RTS基因 (Ricetapetum-specific gene) 0 RTS基因主要在减数分裂过程中花药的绒毡层表达，而在开花之前不再表达。其具有高度的特异性，在其他物种中RTS基因的启动子也能特异地在花药中启动基因表达。RTS对水稻花粉发育起关键作用，反义表达RTS基因影响花药的发育，引起绒毡层发育中断，形成无活力的畸形花粉，导致雄性不育。将RTS的启动子与植物内生菌RNA酶基因barnase或者RTS的反义链进行融合转化到水稻中，导致转基因植株的雄性不育，因此RTS基因及其启动子可以应用于培育水稻雄性不育系[11]。本发明中利用的对茎杆有伸长作用的基因，包括所有其表达下调或缺失就能导致水稻植株矮化的基因。本发明中，优选茎杆伸长相关基因为水稻赤霉素20氧化酶基因 (GA20-氧化酶基因，0sGA20ox2)。决定植物株高的因素很多，但植株体内的赤霉素代谢水平是影响株高的最主要因素。其中，水稻0SGA20ox2基因的突变，导致水稻的半矮秆性状， 其突变基因sd-Ι被称为水稻“绿色革命”基因[12]。根据基因组全序列分析，水稻0sGA20oX 基因家族有 4 个成员 0sGA20oxl，0sGA20ox2, 0sGA20ox3 和 0sGA20ox4，分别位于第 3、1、7 和5染色体上，其核酸序列同源性在30% -65%之间。其中，0sGA20oX2主要控制水稻茎秆节间的伸长，适度调矮的转基因水稻的其他农艺性状并不发生明显的改变[12]，该基因已由 Toyomasu等于1997年克隆[13]。乔枫和赵开军等研究表明，0sGA20ox2-RNAi转基因水稻植株的0SGA20ox2表达水平明显下降，表现为半矮化且育性正常，且能稳定遗传[14]。因此， 0sGA20ox2基因非常合适于本发明。因此利用RNAi技术，选择与株高相关的0sGA20oX2基因的特异片段，通过PCR扩增出。同时选择雄性发育相关基因RTS的特异片段，通过PCR扩增出。再通过重叠PCR技术将上述两个基因片段连接成一个大的片段，利用酶切和连接技术将此大片段转移到植物表达载体的质粒中，构建出发夹结构的RNAi表达载体。通过农杆菌介导法将此RNAi表达载体的发夹结构转到受体水稻基因组中，使雄性发育基因和植株高度基因表达下调或缺失， 同时表现出雄性不育与矮秆性状，而其它性状正常或变化很小而不影响植株正常发育，接收野生型植株花粉后能正常受精结实，其后代一半为矮秆性状植株全部雄性不育，另一半植株株高正常全部可育。由此构建出的矮败水稻可以广泛应用到水稻的轮回选择中，对水稻的育种和生产具有积极而深远的影响。下面对本发明的具体内容进行描述。本发明提供一种DNA，该DNA包括(a)整体有义编码DNA片段，它由编码对茎杆有伸长作用的基因任一区域的有义RNA的有义编码基因组DNA片段，与编码花药发育相关基因任一区域的有义RNA的有义编码DNA片段正向连接而成；(b)所述整体有义编码DNA 片段的反向序列；(c)间隔区，所述整体有义编码DNA片段通过间隔区与所述整体有义编码 DNA片段的反向序列连接；(d)启动子序列，它与通过间隔区连接之后的DNA片段可操作地连接。其中，所述对茎 杆有伸长作用基因是GA20-氧化酶基因0sGA20oX2，所述花药发育相关基因是RTS基因；0sGA20oX2基因的有义编码DNA片段长度为IOObp以上至所述基因的全长序列，优选为300-1200bp，更优选为900-1200bp ；RTS基因的有义编码DNA片段长度为IOObp以上至所述基因的全长序列，优选为200bp以上至所述基因的全长序列。进一步地，编码GA20-氧化酶基因有义编码DNA片段相应于GenBank登录号 AF465255所示序列的第2400位到5182位碱基之间的满足上述长度的任意片段，优选为第 2414位到3412位碱基之间上述长度的任意的片段；RTS基因的有义编码DNA片段相应于 GenBank登录号U12171. 1所示序列的第1225位到1600位碱基之间上述长度的任意的片段，优选为第1272位到1561位碱基之间上述长度的任意的片段。所述间隔区可基于本领域技术人员的知识可以选择，其只要不影响正向序列和反向序列在表达后形成RNA发夹结构即可，通常而言所述接头长度为1 3000bp，优选为 10 IOOObp，更优选为400 600bp。启动子可以采用任何有利于在水稻植株中启动基因表达的启动子，例如水稻肌动蛋白(actin)和玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子，优选为水稻源启动子。本发明还提供含有上述DNA的表达载体，优选为植物表达载体.相应地，本发明进一步提供含有上述表达载体的细胞系，例如细菌和真菌细胞系。本发明提供一种培育雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株的方法，利用上述表达载体转化水稻，在转化的水稻植株中选择雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株， 优选包括进一步培育植株获得雄性不育与矮秆性状同时表现并能稳定遗传的水稻品种。上述方法具体步骤包括根据花药绒毡层发育关键基因RTS的序列，设计引物，通过PCR扩增获得相应片段。根据株高相关基因0sGA20oX的序列，设计引物，通过PCR扩增获得相应片段。然后，通过PCR或连接酶将上述两片段连接成一个大片段。通过正向和反向连接到RNAi表达载体中，构建载体称为发夹RNAi表达载体(因为在植物中转录形成的 RNA可以形成发夹形状的结构)。接着，将此发夹RNAi表达载体转化到水稻基因组中，达到使矮秆植株为雄性不育并在遗传上呈现出完全连锁。转化水稻的方法可根据本领域常规知识来选择，例如基因枪法、农杆菌介导法、 PEG介导法或花粉管通道法等，本发明中采用的转化方法优选为农杆菌介导法。转化水稻的表达载体可根据选择的转化方法来确定。转化水稻的原始品种可以是生产中需要的水稻品种，包括粳稻和籼稻，本发明优选的品种是水稻粳稻品种。本发明的有益效果在于，首次利用RNAi技术培育出矮秆和雄性败育同时表现的水稻，而其它性状正常或变化很小而不影响植株正常发育，接收野生型植株花粉后能正常受精结实，其后代一半为矮秆植株全部雄性不育，另一半植株株高正常全部可育。本发明获得的矮败水稻可以广泛应用于水稻的轮回选择，可非常方便地用于培育水稻新品种。
图1反向载体构建流程图。其中，1以水稻品种农院238(简称238)基因组DNA 为膜板，利用带有酶切位点的引物扩增出RTS基因片段rtsR，其带有Mc I酶切位点和能与infl2R连接的序列inf ；2以水稻品种QXl基因组DNA为膜板，利用带有酶切位点的引物扩增出0sGA20oX2基因片段infl2R，其带有Spe I酶切位点和能与rtsR连接的序列Rts ； 3将rtsR与infUR按1 1混合，用引物RTSF-Sa/lnfR-SP，通过重叠PCR技术将rtsR与 infl2R连接成一个大的片段ira ；4将ira与pGEM_T easy载体连接，获得的载体命名为 IRA。图2用引物RTSF-Sa/RTSR-Inf进行PCR扩增，获得rtsR的电泳图。图3用引物hfF-Rts/InfR-SP进行PCR扩增，获得infl2R的电泳图。图4用引物RTSF-SaAnfR-SP通过PCR扩增，将片段rtsR与inf 12R连接成片段 ira的电泳图。图5将IRA质粒用限制性内切酶Mc I和Spe I进行双酶切后的电泳图。图6正向载体构建流程图。以IRA载体为模板，用引物RTSF-B/InfR-K进行PCR 扩增，所得DNA片段命名为irs，其含有限制性内切酶酶切位点BamH I和Kpn I ；将irs与 PGEM-T easy载体连接，获得的载体命名为^S。图7以IRA载体为模板，用引物RTSF-B/InfR-K进行PCR扩增irs的电泳图。图8IRS质粒用限制性内切酶BamH I和Kpn I进行双酶切的电泳图。图9载体^SACK构建流程图。将质粒IRA和质粒PTCK303用限制性内切酶Spel/ Sacl分别进行双酶切，分别回收IRA酶切小片段ira和PTCK303大片段，然后二者进行连接，所获载体命名为IRACK ；将质粒IRS和质粒IRACK用限制性内切酶BamH I /Kpn I分别进行双酶切，分别回收IRS酶切小片段ira(1289bp)和IRACK大片段，然后二者进行连接， 所获发夹RNAi载体命名为mSACK。图10质粒IRA用限制性内切酶Spel/Mcl进行双酶切后的小片段ira电泳图。图11质粒PTCK303用限制性内切酶Spel/Mcl进行双酶切的大片段电泳图。图12IRACK质粒用限制性内切酶Spel/Mcl双酶切的电泳图。图13质粒IRS用限制性内切酶BamH I /Kpn I进行双酶切后的小片段irs电泳图。图14质粒IRACK用限制性内切酶BamH I /Kpn I进行双酶切后的大片段电泳图。图15^SACK质粒用限制性内切酶BamH I /Kpn I双酶切后的电泳图。图16IRSACK质粒分别用限制性内切酶组合BamH I /Kpn I ,Spel/SacUBamH I / SpeUKpn I /&icl和BamH I /&icl进行双酶切后的电泳图。其中，1 (BamH I /Kpn I )符合 ira(1289bp)片段大小；2 (Spel/Sacl)符合 irs(1289bp)片段大小；3 (BamH I /Spel)符合 ira+intron(1767bp)片段大小；4(Kpn I /Sacl)符合 irs+intron(1767bp)片段大小； 5 (BamH I /Sacl)符合 ira+irs+intron (3056bp)片段大小。图17转基因植株DNA用引物RTSF-B/In-cla进行PCR扩增后的电泳图。其中，泳道1、2、3、5和6为矮秆不育植株，泳道9为^SACK质粒(阳性对照)，结果都扩增出预期的 DNA片段(1371bp)。泳道4为非矮化可育植株，泳道7为农院238 (阴性对照)，泳道8为吉粳88 (阴性对照)，没有扩增出DNA片段。图18矮秆不育植株。 图19矮秆不育植株的花药。图20通过I2-KI法对矮秆不育植株的花药染色镜检。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法和所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规方法和自常规生化试剂商店购买得到的。常规分子生物学实验方法可参见分子克隆实验指南， J. Sambrook，等编著，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，N. Y.，1989。下述实施方式仅仅是示意性的，并不是意图对本发明保护范围进行限制，例如选择材料仅仅作为例子来使用，本发明并不局限于这些材料本身。实施例一、发夹RNAi表达载体IRSACK的构建一、材料1、供试水稻品种水稻粳稻市售品种QX1、农院238、吉粳88。2、菌株大肠杆菌(Escheriehia coli)DH5a 和 DH10B。3、载体pGEM-Teasy载体购自promega公司；RNAi载体pTCK303，其构建方法可参 JALZHENWANG et al. A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice (Oryzasativa L·)· Plant Molecular Biology Reporter 22 :409_417. December 2004 2004 InternationalSociety for Plant Molecular Biology. Printed in Canada。 中国农业科学院作物研究所也有保存。二、方法1、引物设计(1)根据RTS基因序列(参见GenBank登录号U12171. 1)设计出能扩增出rts全部片段(长290bp)的一对引物RTSF和RTSR，序列如表1所示。表1参考引物RTS
权利要求
1.一种DNA，其特征在于该DNA包括(a)整体有义编码DNA片段，它由编码对茎杆有伸长作用的基因任一区域的有义RNA的有义编码基因组DNA片段，与编码花药发育相关基因任一区域的有义RNA的有义编码DNA片段正向连接而成；(b)所述整体有义编码DNA 片段的反向序列；(c)间隔区，所述整体有义编码DNA片段通过间隔区与所述整体有义编码 DNA片段的反向序列连接；(d)启动子序列，它与通过间隔区连接之后的DNA片段可操作地连接。
2.根据权利要求1所述的DNA，其特征在于所述对茎杆有伸长作用的基因是GA20-氧化酶基因，更优选为0sGA20oX2基因，所述花药发育相关基因是RTS基因。
3.根据权利要求2所述的DNA，其特征在于编码GA20-氧化酶基因的有义编码DNA片段长度为IOObp以上至所述基因的全长序列，优选为300-1200bp，更优选为900-1200bp ； RTS基因的有义编码DNA片段长度为IOObp以上至所述基因的全长序列，优选为200bp以上至所述基因的全长序列。
4.根据权利要求3所述的DNA，其特征在于编码GA20-氧化酶基因有义编码DNA片段相应于GenBank登录号AF465255所示序列的第MOO位到5182位碱基之间的任意片段，优选为第M14位到3412位碱基之间的任意片段；RTS基因的有义编码DNA片段相应于 GenBank登录号U12171. 1所示序列的第1225位到1600位碱基之间的任意片段，优选为第 1272位到1561位碱基之间的任意片段。
5.根据权利要求1所述的DNA，其特征在于所述间隔区长度为1 3000bp，优选为 10 lOOObp，更优选为400 600bp。
6.含有权利要求1-5任一项所述的DNA的表达载体，优选为植物表达载体。
7.一种含有权利要求6所述的表达载体的细胞系。
8.一种培育雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株的方法，其包括以下步骤利用权利要求6所述的表达载体转化水稻，在转化的水稻植株中选择雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株，优选包括进一步培育植株获得雄性不育与矮秆性状同时表现并能稳定遗传的水稻品种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于转化水稻采用基因枪法、农杆菌介导法、 PEG介导法或花粉管通道法，优选采用农杆菌介导法。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于转化水稻的受体品种是水稻粳稻品种或籼稻品种。
全文摘要
本发明通过基因工程获得雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株的培育方法。利用对水稻茎杆有伸长作用的赤霉素合成中GA20-氧化酶基因(OsGA20ox2)和对水稻花药绒毡层发育发挥关键作用的RTS基因，通过RNAi技术培育雄性发育基因和植株高度基因同时表达缺失的矮败水稻，所述矮败水稻雄性不育与矮秆性状同时出现，接收野生型植株花粉后能正常受精结实。所述矮败水稻可以广泛应用于水稻轮回选择育种，对水稻遗传育种和生产有着重要意义。
文档编号C12N5/10GK102174519SQ201110045310
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者刘丕庆, 王坚, 王春连, 赵开军, 高英 申请人:中国农业科学院作物科学研究所, 宁夏农林科学院