专利名称：提高蛋白质结晶率的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高生物大分子结晶率的方法，特别涉及一种提高蛋白质结晶率的方法，属于蛋白质的结晶领域。
背景技术：
根据结构基因组计划的统计数据，从纯度很高的生物大分子到生长出衍射质量的生物大分子晶体，其成功率不足20%。获得生物大分子晶体的过程是从表达开始到获得结构的一系列流程中，成功率最低的环节之一。因此，生长高质量生物大分子晶体仍是结构生物学领域的瓶颈问题之一。生物大分子的结晶与其他的结晶过称过一样，是一个多参数控制的过程，通常要达到热力学不稳定过饱和的状态。生物大分子的结晶是在水溶液中当溶液达到过饱和是进行的，包括晶核形成和生长过程。由于生物大分子对外部条件非常敏感，因此这些物质的结晶是非常困难。需要采用温和的技术手段才能使生物大分子逐渐从溶液中结晶出来，变为固态结晶体，这需要控制待结晶的大分子物质的浓度、沉淀剂、温度、PH和化学添加剂等来实现。生物大分子的结晶方法主要有4种气相扩散法、配液结晶法、液-液扩散法和平衡透析法。气相扩散法的原理是在一个封闭体系内，由于不含生物大分子的池液中结晶剂的浓度高于生物大分子结晶液滴中结晶剂的浓度，导致溶剂不断从低浓度的结晶液滴向高浓度的池液扩散，从而使结晶液滴中生物大分子溶液和结晶剂溶液的浓度不断增加，直到液滴与池液的蒸汽压达到平衡。在此过程中生物大分子液滴逐渐达到过饱和，从而形成晶体。 在传统的气相扩散法中，结晶液滴浓度不断浓缩直至与池液平衡，如果池液的浓度不足以使结晶液滴浓缩至生物大分子形核的过饱和度，则即使所使用的筛选试剂能在更高浓度下获得晶体，但在实际筛选时却得不到晶体。鹿芹芹等人在气相扩散法中利用干燥剂替代池液进行蛋白质分子结晶条件的蹄选，提高了蛋白质分子结晶蹄选率(Replace reservoir solution with desiccant in vapor diffusion protein crystallization screening, Journal of Applied Crystallography, 2010, Vol. 43 :1021-1026)。干燥剂法是使用定量的干燥剂代替池液，起到高度浓缩液滴的作用，使液滴的浓度范围大幅扩展，以此来提高生物大分子结晶筛选的成功率。干燥剂法可以使结晶液滴浓缩到更高的水平，提高了生物大分子结晶筛选的成功率，但是直接加入一定量的干燥剂会使液滴浓度浓缩到一个上限，对结晶液滴浓度浓缩到更高的范围有一定的限制。生物大分子结晶成功率定义为结晶的液滴数与液滴总数的比例，其中的每个液滴的结晶条件是相同，该研究中采用结晶成功率来定义结晶可重复性。文献中将传统的气相扩散方法和干燥剂法下的生物大分子结晶可重复性和结晶条件筛选进行了对比。采用传统的气相扩散方法在溶菌酶浓度分别为10，15，20，和25mg/ml，NaCl :20mg/ml ；池液40mg/ml ；缓冲液0. lmol/L NaAc,pH 4. 60，其结晶成功率分别为0，6. 3%，9. 4%，70. 8% ；而采用 5mg硅胶代替池液的干燥剂法的成功率分别为20. 8 %，62. 5 %，66. 7 %，100 %。采用Hampton Research公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒构建结晶筛选溶液体系，使用干燥剂进行生物大分子结晶条件筛选，干燥剂法下的结晶筛选成功率 溶菌酶结晶筛选成功率为四.2%，蛋白酶K的结晶筛选成功率为39.6%，甜味蛋白的结晶筛选成功率为5.2%，糜蛋白酶原A II的结晶筛选成功率为19.8%，肌血球素结晶筛选成功率为1%，刀豆球蛋白A VI的结晶筛选成功率为36. 5%。该研究采用干燥剂单次加入进行筛选，虽然提高了结晶条件筛选的成功率，但是该方法存在如下缺陷1)干燥剂用量控制困难由于筛选试剂盒中的结晶试剂存在不同的浓度范围，有些结晶溶液浓度比较高，有些结晶溶液浓度比较低，采用干燥剂单次加入的干燥剂法进行结晶条件筛选时，经常导致其中部分条件长出晶体，部分条件仍为澄清液滴，而部分条件产生沉淀；2)生物大分子结晶条件筛选成功率低，筛选试剂盒中的结晶试剂的利用率低。由于筛选试剂盒中的结晶试剂的浓度范围不同，结晶溶液浓度有高有低，采用单次加入干燥剂进行结晶的过程中，则存在部分结晶条件下干燥剂用量不足，结晶溶液浓度没有浓缩到足够高的程度，不形成高分子晶体，而有些结晶条件则又由于干燥剂用量大，结晶液滴因为浓缩速度过快，导致直接产生沉淀，而不能形成高分子晶体，因而降低了生物大分子结晶条件筛选的成功率，不能达到提高蛋白质结晶筛选成功率的目的。
发明内容
为了克服现有的生物大分子结晶条件筛选方法结晶成功率低的不足，本发明提供一种提高蛋白质结晶率的方法，该方法利用干燥剂的强吸湿作用，在气相扩散法中，使用干燥剂代替池液，逐级浓缩结晶液滴，使液滴的浓度范围大幅扩展直至液滴蒸干，以此扫描更宽范围的溶液浓度，来提高生物大分子结晶筛选的成功率。为实现本发明的目的，本发明提供一种提高蛋白质结晶率的方法，该方法包括1) 制备蛋白质溶液将蛋白质加入到缓冲溶液中，溶解，制成蛋白质溶液；2)制备蛋白质结晶溶液将蛋白质结晶试剂与蛋白质溶液混合，制得蛋白质结晶溶液；幻蛋白质结晶将干燥剂和蛋白质结晶溶液置于同一密闭容器中，二者不直接接触，恒温静置进行结晶；其中，步骤3)中将干燥剂分批次加入到容器中，在密闭条件下重复进行结晶处理，直至蛋白质结晶溶液完全干燥为至。本发明方法在蛋白质结晶过程中逐步分批次的加入干燥剂，使蛋白质结晶溶液逐级干燥，先使一些浓度较高的溶液生长出晶体，随着干燥剂量的增加，一些浓度低的溶液也有机会长出晶体，这样就最大幅度提高了结晶率。其中，步骤幻中根据蛋白质结晶溶液的体积确定每批次所加入的干燥剂的用量， 本发明人通过实验确定了每批次所加入干燥剂的最适宜用量，即当蛋白质结晶溶液的体积为1 2 μ 1时，第一次所加入的干燥剂的用量为2 5mg，以后每次所加入的干燥剂用量各为 0. 5-2mgo其中，步骤1)中所述蛋白质溶液的浓度大于0，并且彡50mg/ml，优选为2 50mg/ml，进一步优选为10mg/ml。步骤2)中蛋白质结晶试剂与蛋白质溶液的体积之比为 0.125-8 1，优选为0.5-2 1，进一步优选为1 1。
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所述干燥剂选自酸性干燥剂、中性干燥剂或碱性干燥剂中的一种或多种；优选的， 所述的干燥剂选自硅胶、分子筛、蒙脱石、石灰、氯化钙中的一种或多种。本发明中所述的用于蛋白质容晶的容器可以是蛋白质晶体板、坐滴板或悬滴板中的任一种。步骤3)中所述的恒温优选自0-60°C温度范围中的任何一种温度；所述静置时间优选为48 96小时。本发明虽然仅以溶菌酶、蛋白酶K、甜味蛋白、糜蛋白酶原A II、肌血球素、刀豆球蛋白、核糖核酸酶A I和枯草杆菌蛋白酶A VIII为对象进行了实验，但本发明方法能够适用于提高各种蛋白质的结晶率。其中，步骤幻中所述密闭容器选择密封的蛋白质晶体晶板、坐滴板、悬滴板中的一种；所述气相扩散法结晶处理的温度为0-60°C ；结晶处理时间为48 96小时。其中，骤3)中所述蛋白质结晶包括如下步骤A)首先，向密闭容器中加入第一干燥剂；接着，向密闭容器中加入蛋白质结晶溶液，并且使干燥剂与蛋白质结晶溶液相互分离，容器密封后于恒温条件下静置，蛋白质进行第一次结晶；B)向密闭容器中加入第二干燥剂，容器密封后于恒温条件下静置，蛋白质进行第
二次结晶；C)重复步骤B)至少一次，逐级浓缩蛋白质结晶溶液，直至结晶液滴完全干燥，统计获得蛋白质晶体数。特别是，所述的蛋白质结晶为气相扩散法结晶。特别是，步骤A)中所述第一干燥剂的用量为2 5mg ；所述蛋白质结晶溶液的体积为1 2μ1;步骤B)中加入的第二干燥剂量为0.5-aiig;步骤Α)、Β)中静置结晶的温度为0-60°C ；静置时间为48 96小时。尤其是，步骤3)中所述结晶处理过程包括如下步骤a)首先，向坐滴板的深孔3中加入第一干燥剂；接着，向坐滴板的坐滴孔2中加入蛋白质结晶溶液，密封坐滴板后，于恒温条件下静置，蛋白质分子进行第一次结晶；b)向坐滴板的深孔3中加入第二干燥剂，密封坐滴板后于恒温条件下静置，蛋白质分子进行第二次结晶；c)重复步骤b)至少一次，逐级浓缩蛋白质结晶溶液，直至结晶溶液完全干燥，统计获得蛋白质晶体数。其中，步骤a)中加入到深孔3中的所述第一干燥剂的用量是2 5mg/孔；加入到坐滴孔2中的蛋白质结晶溶液的体积为1 2 μ 1/孔。特别是，所述蛋白质结晶溶液中蛋白质溶液和蛋白质结晶试剂体积之比为 0.125-8 1，优选为0.5-2 1，进一步优选为1 1。特别是，步骤a)中第一次结晶的温度为0-60°C ；静置时间为48 96小时。其中，步骤b)中第二次加入的干燥剂量为0.5-aiig/孔。特别是，步骤b)中采用如下步骤加入所述第二干燥剂b-Ι)取与步骤a)中坐滴板孔位相同的第二坐滴板，向第二坐滴板的每个深孔3中加入第二干燥剂，用透明胶带1密封第二坐滴板；
b-2)倒置第二坐滴板使第二干燥剂黏贴到相应第二坐滴板的深孔3位置的透明胶带1上；b-3)用黏贴了第二干燥剂的透明胶带1密封步骤b)中所述的坐滴板。其中，步骤b-Ι)中所述第二干燥剂的量为0.5-aiig/孔。本发明蛋白质结晶条件筛选的方法的具有的优点如下1、本发明方法中的干燥剂具有强吸湿作用，在气相扩散法中，使用干燥剂代替池液，高浓度浓缩结晶液滴，使结晶液滴的浓度范围扩大，提高了蛋白质分子结晶成功率；2、本发明使用逐渐加入干燥剂进行蛋白质结晶的方法，逐渐浓缩结晶液滴直至将液滴蒸干，先加入较少量的干燥剂使一些浓度较高的溶液生长出晶体，随着干燥剂量的增加，一些浓度低的溶液也能长出晶体，使结晶液滴浓度范围扩大，能够最大幅度提高蛋白质结晶筛选成功率，蛋白质分子结晶成功率达到7. 3 69. 8%，是采用单次加入相同量干燥剂蛋白质结晶成功率的1. 2-7. 3倍。3、本发明方法结晶获得的蛋白质的晶体质量高，比采用单次干燥剂进行一次结晶得到的蛋白质晶体的分辨率提高了0.1-0.5 A。4、本发明方法操作简单，结晶效率高，耗能低，环保，操作工艺条件容易控制，可重复性高，蛋白质结晶晶体质量可控性强，结晶成本低。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作详细说明。
图1是本发明发明所用96孔坐滴板示意图。图2是图1中a部分的放大图，即坐滴板中深孔和坐滴孔相对位置的放大图。图中，1-透明胶带；2-坐滴孔；3-深孔。
具体实施例方式本发明采用Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶筛选试剂盒对溶菌酶、蛋白酶K、甜味蛋白、糜蛋白酶原A II、肌血球素、刀豆球蛋白结晶条件进行筛选，除了 Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶筛选试剂盒之外，其他蛋白质大分子结晶筛选试剂均适用于本发明，除了溶菌酶、蛋白酶K、甜味蛋白、糜蛋白酶原A II、肌血球素、 刀豆球蛋白之外，其他蛋白质大分子均适用于本发明。本发明采用干燥剂硅胶、分子筛、蒙脱石、石灰、氯化钙等进行蛋白质结晶条件筛选，除了硅胶、分子筛、蒙脱石、石灰、氯化钙之外，其他干燥剂均适用于本发明。实施例1 溶菌酶结晶条件的筛选。1、制备溶菌酶溶液。将六次重结晶的溶菌酶(日本kikagaku公司，货号为100940)溶于pH为7. 00， 0. 025mol/L HEPES-Na缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤去杂质，制得浓度为IOmg/ ml的溶菌酶溶液。2、添加干燥剂。向第一 96 孔坐滴板(美国 Hampton 公司，货号为 HR3-143，96-well sitting-drop Intelli-Plates)的每个深孔3中加入3. 5mg的干燥剂硅胶；
3、配制结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别转移到每个深孔3中均添加了 3. 5mg干燥剂硅胶的第一 96孔坐滴板的相应坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2内的结晶试剂的体积为1 μ 1/孔；接着将浓度为10mg/ml的溶菌酶溶液转移到第一 96孔坐滴板的每个坐滴孔2中， 其中，每个坐滴孔2内溶菌酶溶液的体积为1 μ 1，与蛋白质结晶试剂混合，用透明胶带1密封第一 96孔坐滴板，制得溶菌酶结晶溶液，即每个坐滴孔2中溶菌酶结晶溶液的体积是 2μ 1 ；4、结晶处理。1)将密封的第一 96孔坐滴板放入控温箱，恒温静置，溶菌酶进行第一次结晶处理，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为72小时，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，计算溶菌酶第一次结晶成功率为13. 5%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为1.5 A;2)另取与第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每个深孔3中分别加入1. 5mg的干燥剂硅胶，用透明胶带1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥剂硅胶黏贴到相应的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明胶带1上；3)用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的第一 96孔坐滴板的透明胶带1，新的硅胶干燥剂将继续浓缩结晶液滴；4)将添加了新的干燥剂的第一 96孔坐滴板再次放入控温箱中，恒温静置，溶菌酶结晶析出，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为72小时，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，计算溶菌酶第二次结晶成功率为33. 3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为1.5 A;5)重复步骤2、,3)、4)，第三次浓缩溶菌酶结晶液滴，全部溶菌酶结晶溶液蒸干， 在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，计算溶菌酶第三次结晶率为51 %，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为1.6 A。实施例2 蛋白酶K结晶条件的筛选。1、制备蛋白酶K溶液。将蛋白酶K(美国Sigma公司，货号为P6556)溶于pH为7. 00,0. 025mol/L HEPES-Na缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜滤去杂质，滤去杂质，制得浓度50mg/ml蛋白酶 K溶液。2、添加干燥剂。向第一 96孔坐滴板的每个深孔3中加入2. Omg的干燥剂硅胶；3、配制结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别转移到每个深孔3中均添加了 2. Omg干燥剂硅胶的第一 96孔坐滴板的相应坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2内结晶筛选试剂的体积为1 μ 1/孔；接着将浓度为50mg/ml的蛋白酶K溶液转移到第一 96孔坐滴板的每个坐滴孔2 中，其中，每个坐滴孔2内蛋白酶K溶液的体积为Ιμ ，与蛋白质结晶试剂混合，用透明胶带1密封第一 96孔坐滴板，制得蛋白酶K结晶溶液，即每个坐滴孔2中蛋白酶K结晶溶液的体积是2μ1 ；4、结晶处理。1)将密封的第一 96孔坐滴板放入控温箱，恒温静置，蛋白酶K进行第一次结晶处理，其中，恒温静置的温度为0°C，静置时间为96小时，在显微镜下观察，统计出获得蛋白酶 K晶体的数目，计算蛋白酶K第一次结晶成功率为对％，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的蛋白酶K晶体的分辨率，平均分辨率为1.2 A;2)另取与第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每个深孔3中分别加入0. 5mg的干燥剂硅胶，用透明胶带1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥剂硅胶黏贴到相应的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明胶带1上；幻用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的第一 96孔坐滴板的透明胶带1，新的硅胶干燥剂将继续浓缩结晶液滴；4)将添加了新的干燥剂的第一 96孔坐滴板再次放入控温箱中，恒温静置，蛋白酶 K结晶析出，其中，恒温静置的温度为0 °C，静置时间为96小时，在显微镜下观察，统计出获得蛋白酶K晶体的数目，计算蛋白酶K第二次结晶成功率为41.7%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的蛋白酶K晶体的分辨率，平均分辨率为1.3 A；5)重复步骤2)、3)、4)，第三次浓缩蛋白酶K结晶液滴，全部蛋白酶K结晶溶液蒸干，在显微镜下观察，统计出获得蛋白酶K晶体的数目，计算蛋白酶K第三次结晶成功率为 69. 8%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的蛋白酶K晶体的分辨率，平均分辨率为 1.3 A。实施例3 甜味蛋白结晶条件的筛选。1、制备甜味蛋白溶液。将甜味蛋白(美国Sigma公司，货号为T7638)溶于pH为7. 00，0. 025mol/L HEPES-Na缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜滤去杂质，滤去杂质，制得浓度为10mg/ml的甜味蛋白溶液。2、添加干燥剂。向第一 96孔坐滴板的每个深孔3中加入5mg的干燥剂蒙脱石；3、配制结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别转移到每个深孔3中均添加了 5mg干燥剂蒙脱石的第一 96孔坐滴板的相应坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2内的结晶试剂的体积为1 μ 1/孔；接着将甜味蛋白溶液转移到第一 96孔坐滴板的每个坐滴孔2中，其中，每个坐滴孔2内甜味蛋白溶液的体积为Ιμ ，与蛋白质结晶筛选试剂混合，用透明胶带1密封第一 96孔坐滴板，制得甜味蛋白结晶溶液，即每个坐滴孔2中甜味蛋白结晶溶液的体积是 2μ 1 ；4、结晶处理。1)将密封的第一 96孔坐滴板放入控温箱，恒温静置，甜味蛋白进行第一次结晶处理，其中，恒温静置的温度为60°C，静置时间为48小时，在显微镜下观察，统计出获得甜味蛋白晶体的数目，计算甜味蛋白第一次结晶成功率为2. 1%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的甜味蛋白晶体的分辨率，平均分辨率为1.4A;
2)另取与第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每个深孔3中分别加入2mg的干燥剂蒙脱石，用透明胶带1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥剂蒙脱石黏贴到相应的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明胶带 1上；幻用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的第
一96孔坐滴板的透明胶带1，新的蒙脱石干燥剂将继续浓缩结晶液滴；4)将添加了新的干燥剂的第一 96孔坐滴板再次放入控温箱中，恒温静置，甜味蛋白结晶析出，其中，恒温静置的温度为60°C，静置时间为48小时，在显微镜下观察，统计出获得甜味蛋白晶体的数目，计算甜味蛋白第二次结晶成功率为5.2% ；同时回收晶体，用X 射线衍射法测定获得的甜味蛋白晶体的分辨率，平均分辨率为1.4 A；5)重复步骤幻、3)、4)2次，第四次浓缩甜味蛋白结晶液滴，全部甜味蛋白结晶溶液蒸干，在显微镜下观察，统计出获得甜味蛋白晶体的数目，计算甜味蛋白第四次结晶成功率为7. 3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的甜味蛋白晶体的分辨率，平均分辨率为1.5 A。实施例4 糜蛋白酶原A II结晶条件的筛选。1、制备糜蛋白酶原A II溶液。将糜蛋白酶原A 11(美国Sigma公司，货号为C4879)溶于pH为7. 00，0. 025mol/ L HEPES-Na缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤去杂质，制得浓度分别为10mg/ml的糜蛋白酶原A II溶液。2、添加干燥剂。向第一 96孔坐滴板的每个深孔3中加入2mg的干燥剂分子筛；3、配制结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别转移到每个深孔3中均添加了 2mg干燥剂分子筛的第一 96孔坐滴板的相应坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2内结晶筛选试剂的体积为0. 7 μ 1/孔；接着将糜蛋白酶原A II溶液转移到第一 96孔坐滴板的每个坐滴孔2中，其中，每个坐滴孔2内糜蛋白酶原A II溶液的体积为0.7μ1，与蛋白质结晶试剂混合，用透明胶带 1密封第一 96孔坐滴板，制得糜蛋白酶原A II结晶溶液，即每个坐滴孔2中糜蛋白酶原A II结晶溶液的体积是1.4μ1;4、结晶处理。1)将密封的第一96孔坐滴板放入控温箱，恒温静置，糜蛋白酶原A II进行第一次结晶处理，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为72小时，在显微镜下观察，统计出获得糜蛋白酶原A II晶体的数目，计算糜蛋白酶原A II第一次结晶成功率为10.4%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的糜蛋白酶原A II晶体的分辨率，平均分辨率为2.8人；2)另取与第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每个深孔3中分别加入Img的干燥剂分子筛，用透明胶带1密封第二 96孔坐滴板，倒置第
二96孔坐滴板，使干燥剂分子筛黏贴到相应的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明胶带 1上；幻用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的第
9一 96孔坐滴板的透明胶带1，新的分子筛干燥剂将继续浓缩结晶液滴；4)将添加了新的干燥剂的第一 96孔坐滴板再次放入控温箱中，恒温静置，糜蛋白酶原A II结晶析出，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为72小时，在显微镜下观察，统计出获得糜蛋白酶原A II晶体的数目，计算糜蛋白酶原A II第二次结晶成功率为 20.8%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的糜蛋白酶原A II晶体的分辨率，平均分辨率为2.8 A；5)重复步骤2)、3)、4)，第三次浓缩糜蛋白酶原A II结晶液滴，全部糜蛋白酶原A II结晶溶液蒸干，在显微镜下观察，统计出获得糜蛋白酶原A II晶体的数目，计算糜蛋白酶原A II第三次结晶成功率为36. 5%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的糜蛋白酶原A II晶体的分辨率，平均分辨率为2.9 A。实施例5 肌血球素结晶条件的筛选。1、制备肌血球素溶液。将肌血球素(美国Sigma公司，货号为M0630)溶于pH为7. 00，0. 025mol/L HEPES-Na缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤去杂质，制得浓度分别为10mg/ml的肌血球素溶液。2、添加干燥剂。向第一 96孔坐滴板的每个深孔3中加入2mg的干燥剂石灰；3、配制结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别转移到每个深孔3中均添加了 2mg干燥剂石灰的第一 96孔坐滴板的相应坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2内的结晶筛选试剂的体积为0. 5 μ 1/孔；接着将肌血球素溶液转移到第一 96孔坐滴板的每个坐滴孔2中，其中，每个坐滴孔2内溶菌酶溶液的体积为0. 5 μ 1，与蛋白质结晶筛选试剂混合，用透明胶带1密封第一 96孔坐滴板，制得肌血球素结晶溶液，即每个坐滴孔2内肌血球素结晶溶液的体积为 1μ 1 ；4、结晶处理。1)将密封的第一 96孔坐滴板放入控温箱，恒温静置，肌血球素进行第一次结晶处理，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为96小时，在显微镜下观察，统计出获得肌血球素晶体的数目，计算肌血球素第一次结晶成功率为1 %，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的肌血球素晶体的分辨率，平均分辨率为1.55 A;2)另取与第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每个深孔3中分别加入0. 5mg的干燥剂石灰，用透明胶带1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥剂石灰黏贴到相应的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明胶带1上；幻用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的第一 96孔坐滴板的透明胶带1，新的石灰干燥剂将继续浓缩结晶液滴；4)将添加了新的干燥剂的第一 96孔坐滴板再次放入控温箱中，恒温静置，肌血球素结晶析出，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为96小时，在显微镜下观察，统计出获得肌血球素晶体的数目，计算肌血球素第二次结晶成功率为5.2%，同时回收晶体，用X 射线衍射法测定获得的肌血球素晶体的分辨率，平均分辨率为1.55 A；
5)重复步骤幻,3)、4)，第三次浓缩肌血球素结晶液滴，全部肌血球素结晶溶液蒸干，在显微镜下观察，统计出获得肌血球素晶体的数目，计算肌血球素第三次结晶成功率为 7. 3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的肌血球素晶体的分辨率，平均分辨率为
1.6 A。实施例6 刀豆球蛋白A VI结晶条件的筛选。1、制备刀豆球蛋白A VI溶液。将刀豆球蛋白A VI (美国Sigma公司，货号为L7647)溶于pH为7. 00，0. 025mol/ L HEPES-Na缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤去杂质，制得浓度分别为ang/ml的刀豆球蛋白A VI溶液。2、添加干燥剂。向第一 96孔坐滴板的每个深孔3中加入2mg的干燥剂氯化钙；3、配制结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别转移到每个深孔3中均添加了 2mg干燥剂氯化钙的第一 96孔坐滴板的相应坐滴孔2中，其中，添加到每个坐滴孔2内的蛋白质结晶筛选试剂的体积分别为 0. 7μ 1 ；接着将刀豆球蛋白A VI溶液转移到第一 96孔坐滴板的每个坐滴孔2中，其中，每个坐滴孔2内豆球蛋白A VI溶液的体积为0.7μ1，与蛋白质结晶筛选试剂混合，用透明胶带1密封第一 96孔坐滴板，制得刀豆球蛋白A VI结晶溶液，即每个坐滴孔2内刀豆球蛋白 A VI结晶溶液的体积为1. 4μ 1 ；4、结晶处理。1)将密封的第一 96孔坐滴板放入控温箱，恒温静置，刀豆球蛋白A VI进行第一次结晶处理，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为48小时，在显微镜下观察，统计出获得刀豆球蛋白A VI素晶体的数目，计算刀豆球蛋白A VI第一次结晶成功率为31.3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的刀豆球蛋白A VI晶体的分辨率，平均分辨率为2 A;2)另取与第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每个深孔3中分别加入Img的干燥剂氯化钙，用透明胶带1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥剂氯化钙黏贴到相应的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明胶带 1上；幻用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的第一 96孔坐滴板的透明胶带1，新的氯化钙干燥剂将继续浓缩结晶液滴；4)将添加了新的干燥剂的第一 96孔坐滴板再次放入控温箱中，恒温静置，刀豆球蛋白A VI结晶析出，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为48小时，在显微镜下观察，统计出获得刀豆球蛋白A VI晶体的数目，计算刀豆球蛋白A VI第二次结晶成功率为 37. 5%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的刀豆球蛋白A VI晶体的分辨率，平均分辨率为2.1 A;5)重复步骤幻、3)、4)，第三次浓缩刀豆球蛋白々VI结晶液滴，全部刀豆球蛋白A VI结晶溶液蒸干，在显微镜下观察，统计出获得刀豆球蛋白A VI晶体的数目，计算刀豆球蛋白A VI第三次结晶成功率为42. 7%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的刀豆球蛋白A VI晶体的分辨率，平均分辨率为2.1 A。实施例7 核糖核酸酶A I结晶条件的筛选。1、制备核糖核酸酶A I溶液。将核糖核酸酶A 1(美国Sigma公司，货号为R4875)溶于pH为7. 00，0. 025mol/L HEPES-Na缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤去杂质，制得浓度为10mg/ml的核糖核酸酶A I溶液。2、添加干燥剂。向第一 96孔坐滴板的每个深孔3中加入2mg的干燥剂氯化钙；3、配制结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别转移到每个深孔3中均添加了 2mg干燥剂氯化钙的第一 96孔坐滴板的相应坐滴孔2中，其中，添加到每个坐滴孔2内的蛋白质结晶筛选试剂的体积分别为 0. 5μ 1 ；接着将核糖核酸酶A I溶液转移到第一 96孔坐滴板的每个坐滴孔2中，其中，每个坐滴孔2内核糖核酸酶A I溶液的体积为1 μ 1，与蛋白质结晶筛选试剂混合，用透明胶带 1密封第一 96孔坐滴板，制得核糖核酸酶A I结晶溶液，即每个坐滴孔2内核糖核酸酶A I 结晶溶液的体积为1.5μ1;4、结晶处理。1)将密封的第一 96孔坐滴板放入控温箱，恒温静置，核糖核酸酶A I进行第一次结晶处理，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为48小时，在显微镜下观察，统计出获得核糖核酸酶A I晶体的数目，计算核糖核酸酶A I第一次结晶成功率为1%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的核糖核酸酶A I晶体的分辨率，平均分辨率为2)另取与第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每个深孔3中分别加入Img的干燥剂氯化钙，用透明胶带1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥剂氯化钙黏贴到相应的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明胶带 1上；幻用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的第一 96孔坐滴板的透明胶带1，新的氯化钙干燥剂将继续浓缩结晶液滴；4)将添加了新的干燥剂的第一 96孔坐滴板再次放入控温箱中，恒温静置，核糖核酸酶A I结晶析出，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为48小时，在显微镜下观察，统计出获得核糖核酸酶A I晶体的数目，计算核糖核酸酶A I第二次结晶成功率为3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的核糖核酸酶A I晶体的分辨率，平均分辨率为1.5 A;5)重复步骤幻,3)、4)，第三次浓缩核糖核酸酶A I结晶液滴，全部核糖核酸酶A I 结晶溶液蒸干，在显微镜下观察，统计出获得核糖核酸酶A I晶体的数目，计算核糖核酸酶 A I第三次结晶成功率为7.3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的核糖核酸酶A I 晶体的分辨率，平均分辨率为1.6 A。实施例8 枯草杆菌蛋白酶A VIII结晶条件的筛选。1、制备枯草杆菌蛋白酶A VIII溶液。将枯草杆菌蛋白酶A VIII (美国Sigma公司，货号为P5380)溶于pH为7. 00，0. 025mol/L HEPES-Na缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤去杂质，制得浓度为IOmg/ ml的枯草杆菌蛋白酶A VIII溶液。2、添加干燥剂。向第一 96孔坐滴板的每个深孔3中加入2mg的干燥剂氯化钙；3、配制结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司货号为HR2-144的hdex 96结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别转移到每个深孔3中均添加了 2mg干燥剂氯化钙的第一 96孔坐滴板的相应坐滴孔2中，其中，添加到每个坐滴孔2内的蛋白质结晶筛选试剂的体积分别为1μ 1 ；接着将枯草杆菌蛋白酶A VIII溶液转移到第一 96孔坐滴板的每个坐滴孔2中， 其中，每个坐滴孔2内枯草杆菌蛋白酶A VIII溶液的体积为0.5 μ 1，与蛋白质结晶筛选试剂混合，用透明胶带1密封第一 96孔坐滴板，制得枯草杆菌蛋白酶A VIII结晶溶液，即每个坐滴孔2内枯草杆菌蛋白酶A VIII结晶溶液的体积为1. 5μ 1 ；4、结晶处理。1)将密封的第一96孔坐滴板放入控温箱，恒温静置，枯草杆菌蛋白酶A VIII进行第一次结晶处理，其中，恒温静置的温度为20°C，静置时间为48小时，在显微镜下观察，统计出获得枯草杆菌蛋白酶A VIII晶体的数目，计算枯草杆菌蛋白酶A VIII第一次结晶成功率为0% ；2)另取与第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每个深孔3中分别加入Img的干燥剂氯化钙，用透明胶带1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥剂氯化钙黏贴到相应的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明胶带 1上；幻用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的第一 96孔坐滴板的透明胶带1，新的氯化钙干燥剂将继续浓缩结晶液滴；4)将添加了新的干燥剂的第一 96孔坐滴板再次放入控温箱中，恒温静置，枯草杆菌蛋白酶AVIII结晶析出，其中，恒温静置的温度为20 °C，静置时间为48小时，在显微镜下观察，统计出获得枯草杆菌蛋白酶A VIII晶体的数目，计算枯草杆菌蛋白酶A VIII第二次结晶成功率为2%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的枯草杆菌蛋白酶A VIII晶体的分辨率，平均分辨率为2.3 A；5)重复步骤幻、3)、4)，第三次浓缩枯草杆菌蛋白酶々VIII结晶液滴，全部枯草杆菌蛋白酶A VIII结晶溶液蒸干，在显微镜下观察，统计出获得枯草杆菌蛋白酶A VIII晶体的数目，计算枯草杆菌蛋白酶A VIII第三次结晶成功率为3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的枯草杆菌蛋白酶A VIII晶体的分辨率，平均分辨率为2.35 A。对照例1、溶菌酶单次干燥结晶筛选。除了将干燥剂硅胶一次性放入到96孔坐滴板的每个深孔3中，其中每个深孔3 中干燥剂硅胶的量为6. 5mg，控温箱中恒温静置是时间为216小时之外，其余与实施例1第一次结晶过程相同，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，溶菌酶结晶筛选成功率为沈％，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为 1.9 A。对照例2、蛋白酶K单次干燥结晶筛选。
除了将干燥剂硅胶一次性放入到96孔坐滴板的每个深孔3中，其中每个深孔3 中干燥剂硅胶的量为:3mg，控温箱中恒温静置是时间为288小时之外，其余与实施例2第一次结晶过程相同，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，溶菌酶结晶筛选成功率为36. 5%同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为1.7A。对照例3、甜味蛋白单次干燥结晶筛选。除了将干燥剂蒙脱石一次性放入到96孔坐滴板的每个深孔3中，其中每个深孔3 中干燥剂硅胶的量为llmg，控温箱中恒温静置是时间为236小时之外，其余与实施例3第一次结晶过程相同，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，溶菌酶结晶筛选成功率为3. 同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为1.8Ao对照例4、糜蛋白酶原A II单次干燥结晶筛选。除了将干燥剂分子筛一次性放入到96孔坐滴板的每个深孔3中，其中每个深孔3 中干燥剂硅胶的量为細g，控温箱中恒温静置是时间为216小时之外，其余与实施例4第一次结晶过程相同，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，溶菌酶结晶筛选成功率为17. 7%同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为 3.2 A0对照例5、肌血球素单次干燥结晶筛选。除了将干燥剂石灰一次性放入到96孔坐滴板的每个深孔3中，其中每个深孔3中干燥剂硅胶的量为:3mg，控温箱中恒温静置是时间为288小时之外，其余与实施例5第一次结晶过程相同，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，溶菌酶结晶筛选成功率为
同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为1.8 A。对照例6、刀豆球蛋白A VI单次干燥结晶筛选。除了将干燥剂氯化钙一次性放入到96孔坐滴板的每个深孔3中，其中每个深孔3 中干燥剂硅胶的量为細g，控温箱中恒温静置是时间为288小时之外，其余与实施例6第一次结晶过程相同，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目，溶菌酶结晶筛选成功率为31. 3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的溶菌酶晶体的分辨率，平均分辨率为 2.4 A。对照例7、核糖核酸酶A I单次干燥结晶筛选。除了将干燥剂氯化钙一次性放入到96孔坐滴板的每个深孔3中，其中每个深孔3 中干燥剂氯化钙的量为細g，控温箱中恒温静置是时间为288小时之外，其余与实施例7第一次结晶过程相同，在显微镜下观察，统计出获得核糖核酸酶A I晶体的数目，核糖核酸酶 A I结晶筛选成功率为3%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的核糖核酸酶A I晶体的分辨率，平均分辨率为1.9 A。对照例8、枯草杆菌蛋白酶A VIII单次干燥结晶筛选。除了将干燥剂氯化钙一次性放入到96孔坐滴板的每个深孔3中，其中每个深孔3 中干燥剂氯化钙的量为細g，控温箱中恒温静置是时间为288小时之外，其余与实施例8第一次结晶过程相同，在显微镜下观察，统计出获得枯草杆菌蛋白酶A VIII晶体的数目，枯草杆菌蛋白酶A VIII结晶筛选成功率为1%，同时回收晶体，用X射线衍射法测定获得的枯草杆菌蛋白酶A VIII晶体的分辨率，平均分辨率为2.5 A。试验例1 溶菌酶结晶条件的可重复性实验。1、制备溶菌酶溶液。将六次重结晶的溶菌酶(日本kikagaku公司，货号为100940)分别溶于pH为 4. 6,0. lmol/L NaAc缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤去杂质，制得四种浓度分别为 20mg/ml，30mg/ml，40mg/ml，50mg/ml 的溶菌酶溶液。2、配制 NaCl 溶液。将NaCl溶于pH为4. 6，0. IM NaAc缓冲液中，使得NaCl的浓度为40mg/ml。3、配制溶菌酶结晶溶液。分别将四种浓度的溶菌酶溶液和NaCl溶液等体积混合，制得初始浓度分别为 10mg/ml, 15mg/ml,20mg/ml,25mg/ml的溶菌酶结晶溶液，四种溶菌酶结晶溶液中NaCl的浓度为 20mg/ml。4、溶菌酶结晶处理。1)向4个96孔坐滴板的每个深孔3中加入2. 5mg的干燥剂硅胶，用自动移液系统分别向4个96孔坐滴板的每个坐滴孔2中加入1.4μ 1的四种溶菌酶结晶溶液，然后用透明胶带1密封4个96孔坐滴板，即1个96孔坐滴板对应一种溶菌酶结晶溶液，也即是4 个96孔坐滴板中一个96孔坐滴板的坐滴孔2内加入的是浓度为10mg/ml的溶菌酶结晶溶液，第二个96孔坐滴板的坐滴孔2内加入的是浓度为15mg/ml的溶菌酶结晶溶液，第三个 96孔坐滴板的坐滴孔2内加入的是浓度为20mg/ml的溶菌酶结晶溶液，第四个96孔坐滴板的坐滴孔2内加入的是浓度为25mg/ml的溶菌酶结晶溶液；2)将密封后的96孔坐滴板放入控温箱内，静置，溶菌酶结晶析出，其中控温箱内温度控制为20°C，静置72小时后，在显微镜下观察，分别统计获得溶菌酶晶体的数目，计算第一次结晶成功率，其中浓度为10mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第一次结晶成功率为13. 5%； 浓度为15mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第一次结晶成功率为64. 6% ；浓度为20mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第一次结晶成功率为69. 8% ；浓度为25mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第一次结晶成功率为96.9% ；3)另外取与步骤1)中所述96孔坐滴板孔位相同的另外4个新的96孔坐滴板，向 4个新的96孔坐滴板的每个深孔3中加入Img的硅胶干燥剂，用透明胶带1分别密封4个新的96孔坐滴板，倒置4个新的96孔坐滴板，使干燥剂黏贴到相应坐滴板的深孔3位置的透明胶带1上；4)用每个深孔3对应部位都粘有干燥剂的透明胶带1替换经过第一次结晶后的每个96孔坐滴板的透明胶带1，新的硅胶干燥剂将继续浓缩结晶液滴；5)将添加了新的硅胶干燥剂的4个96孔坐滴板再次放入控温箱内，静置，溶菌酶结晶析出，其中控温箱内温度控制为20°C，静置72小时后，在显微镜下观察，分别统计出获得溶菌酶晶体的数目，计算第二次结晶成功率，其中浓度为10mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第二次结晶成功率为59.4% ；浓度为15mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第二次结晶成功率为 83. 3%;浓度为20mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第二次结晶成功率为96. 9%;浓度为25mg/ml 的溶菌酶结晶溶液的第二次结晶成功率为100% ；6)重复进行第幻-幻步，逐渐浓缩溶菌酶结晶溶液，直至全部溶菌酶结晶溶液蒸干，每重复一次，就在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的数目；本试验例中，溶菌酶经过3次结晶，溶菌酶结晶溶液即全部蒸干，统计出获得溶菌酶晶体的数目，计算第三次结晶成功率，其中浓度为10mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第三次结晶成功率为92. 7% ；浓度为15mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第三次结晶成功率为96. 9% ； 浓度为20mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第三次结晶成功率为100% ；浓度为25mg/ml的溶菌酶结晶溶液的第三次结晶成功率为100%经过统计得到如下结果可重复性实验中初始浓度为10mg/ml溶菌酶溶液的第一次，第二次和第三次的成功率分别为13.5^,59.4^,92.7%,最终的成功率即第三次结晶成功率与文献报道的干燥剂法相比，成功率提高至原水平的4. 5倍。初始浓度为15mg/ml 溶菌酶溶液的第一次，第二次和第三次的成功率分别为64. 6 %，83. 3 %，96. 9 %，最终的成功率与文献报道的干燥剂法相比，成功率提高至原水平的1. 6倍。初始浓度为20mg/ml溶菌酶溶液的第一次，第二次和第三次的成功率分别为69. 8%，96. 9%，100%，最终的成功率与文献报道的干燥剂法相比，成功率提高至原水平的1. 5倍。初始浓度为25mg/ml溶菌酶溶液的第一次，第二次和第三次的成功率分别为96. 9%，100%,100%,最终的成功率与文献报道的干燥剂法相比，成功率相同。
权利要求
1.一种提高蛋白质结晶率的方法，包括1)制备蛋白质溶液将蛋白质加入到缓冲溶液中，溶解，制成蛋白质溶液；幻制备蛋白质结晶溶液将蛋白质结晶试剂与蛋白质溶液混合，制得蛋白质结晶溶液；3)蛋白质结晶将干燥剂和蛋白质结晶溶液置于同一密闭容器中，恒温静置进行结晶；其中，干燥剂和蛋白质结晶溶液不直接接触；其特征在于步骤3) 中将干燥剂分批次加入到容器中，在密闭条件下重复进行结晶过程，直至蛋白质结晶溶液完全干燥为至。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中根据蛋白质结晶溶液的体积确定每批次所加入的干燥剂的用量当蛋白质结晶溶液的体积为1 2μ 1时，第一次所加入的干燥剂的用量为2 5mg。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中根据蛋白质结晶溶液的体积确定每批次所加入的干燥剂的用量当蛋白质结晶溶液的体积为1 2μ 1时，以后每次所加入的干燥剂用量各为0. 5-2mgo
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述蛋白质溶液的浓度>0，并且 ^ 50mg/mlo
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中蛋白质结晶试剂与蛋白质溶液的体积之比为0.125-8 1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述干燥剂选自酸性干燥剂、中性干燥剂或碱性干燥剂中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的干燥剂选自硅胶、分子筛、蒙脱石、石灰、氯化钙中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述密闭容器选自蛋白质晶体板、坐滴板或悬滴板中的任一种。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的恒温选自0-60°C温度范围中的任何一种温度；所述静置时间为48 96小时。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白质包括溶菌酶、蛋白酶K、甜味蛋白、糜蛋白酶原A II、肌血球素、刀豆球蛋白、核糖核酸酶A I或枯草杆菌蛋白酶A VIII。
全文摘要
本发明公开了一种提高蛋白质结晶率的方法，用于解决现有的生物大分子结晶条件筛选方法结晶成功率低的技术问题。技术方案包括将蛋白质加入到缓冲溶液中，溶解，制成蛋白质溶液；将蛋白质溶液与不同的蛋白质结晶试剂混合，制得蛋白质结晶溶液；将干燥剂分多次加入到密闭容器中，且使干燥剂与蛋白质结晶溶液相互分离，与蛋白质结晶溶液进行多次结晶处理，统计出获得蛋白质大分子晶体数，计算筛选成功率。本发明使用逐级干燥的方法，干燥剂用量逐渐增加，先使一些过饱和度较高的溶液生长出晶体，随着干燥剂量的增加，一些过饱和度低的溶液也有机会长出晶体，最大限度地提高了蛋白质结晶条件的筛选成功率，而且经过多次结晶后得到的晶体的分辨率提高，结晶蛋白质的晶体质量提高。
文档编号C12N9/22GK102190702SQ20111005296
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者刘永明, 卢慧甍, 商澎, 尹大川, 郭卫红, 鹿芹芹 申请人:西北工业大学