专利名称：一种快速提取红松胚基因组dna的方法
技术领域：
本发明涉及分子标记技术，具体的说是一种快速提取红松胚基因组DNA的方法。
背景技术：
近年来，分子标记技术已经被广泛用于红松遗传多样性、交配系统分析、亲本鉴定、遗传图谱构建及标记辅助育种等研究领域。该技术可用少量的DNA对许多样品进行快速的分析。但采用该技术开展科研工作的前提是首先建立起大规模快速提取个体DNA的方法。而基因组DNA的质量好坏直接影响分子生物学实验的成败。例如，在PCR过程中多糖、 色素、脂质和多酚等物质都会严重影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板的结合，导致实验失败。以往大多数实验以红松的叶片为材料，采用CTAB法和SDS法，这些方法操作步骤繁琐，耗时长，所用药品多，花费大。为了缩短时间，减少工作量，很多人开始探索直接用种子提取DNA的方法。
发明内容
本发明目的在于，提供一种快速提取红松胚基因组DNA的方法。为实现上述目的，本发明采用技术方案为一种快速提取红松胚基因组DNA的方法按如下方法操作，1)将研磨后红松胚投加于氯仿中，于60_65°C水浴10-15min，待用；即每一个红松胚研磨后加入200-500 μ L氯仿中；2)将上述水浴处理后红松胚加入CTAB提取缓冲液中，于60-65°C水浴10-15min， 而后以10000-12000r · rniiT1离心2_5min，取上清液待用；3)将步骤2)所得上清液中加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇，而后在 10000-12000r · mirr1 离心 2_5min，取上清液待用；4)将步骤幻所得上清液中加入上清液2/3体积的异丙醇，混勻后于-20--40°C下静止5-lOmin，而后以10000_12000r · mirT1离心l-5min，收集沉淀，洗涤后，即得到红松胚基因组DNA。所述步骤1)中研磨后红松胚为将红松胚加入液氮中研磨成粉末。所述步骤1)和 2)中水浴时需振荡2-3次。所述步骤幻中氯仿-异戊醇混合比例为按体积比为M 1混合。所述步骤4)中上清液与异丙醇混合后上下倒置混合均勻。所述步骤幻中离心得到沉淀用70 %乙醇洗沉淀2次，而后于室温干燥，将干燥后所得DNA沉淀溶于50 μ LTE中溶解保存。本发明所具有的优点本发明与传统的CTAB法相比，提取效果比较好，时间短，容易操作。由于本发明提取方法先加入氯仿除去DNA酶、多糖等杂质，后加入CTAB提取液的做法，使得DNA降解少， 完整性好。另外在沉淀过程中，将温度由室温改为冰箱-20°C内，也可以防止DNA在沉淀过程中不被降解。另外缩短离心时间，离心速度(统的方法为12000r · mirT1，IOmin,降为10000r · HiirT1，Imin)，也可以减少多糖等杂质与DNA —起被沉淀。
图1为本发明实施例提供的图1提取红松胚基因组DNA电泳图(未加RNAse处理)。图2为常规CTAB法提取红松胚基因组DNA电泳图(未加RNAse处理)。
具体实施例方式实施例1提取红松胚基因组DNA的方法1)取一个红松胚置于2mL离心管中，加入液氮充分研磨研磨成呈现白色粉末，加入500 μ L氯仿，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，待用。2)水浴后将其加入500 μ LCTAB提取缓冲液中，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，而后以12000r · HiirT1离心2min，收集上清液转至新管中。CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2 %的CTAB，即为CTAB 提取缓冲液，其中提取缓冲液为 IOOmmol · L^Tris-HCl (ρΗ8· 0)，1. 4mol · L^1NaCl, 20mmol · L-1EDTA, 20mmol · L-1Na2S2O503)将上述收集上清液中加入上清液等体积的体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，而后以12000r · HiirT1离心2min，收集上清液转至新管中。4)将上述收集上清液中加入上清液2/3体积的预冷到0-4°C的异丙醇，轻轻上下倒置，而后置于_20°C的冰箱内静止5min，再以IOOOOr · mirT1离心lmin，离心后小心倒掉上清液，用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底。5)将上述沉淀用70 %乙醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，以5000r · mirT1 离心aiiin去上清液。重复洗涤沉淀1次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入 50 μ LTE溶解沉淀的DNA，保存(参见图1)。一般来讲，RNA不影响DNA的分析，如果需要高质量的DNA，则可以进行纯化。加入 RNase 2ul，将 RNA 除去。实施例2与实施例1不同之处在于1)取一个红松胚置于2mL离心管中，加入液氮充分研磨研磨成呈现白色粉末，加入400 μ L氯仿，于65°C下水浴15min，其间轻轻振荡3次，待用。2)水浴后将其加入500 μ LCTAB提取缓冲液中，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2%的CTAB，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为 IOOmmol 'L-1Tris-HCl (ρΗ8. 0)，1. 4mol ·I^NaCl，20mmol 'L-1EDTA, 20mmol · L-1Ne^2O503)将上述收集上清液中加入上清液等体积的体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。4)将上述收集上清液中加入上清液2/3体积的预冷到0-4°C的异丙醇，轻轻上下倒置，而后置于_20°C的冰箱内静止5min，再以IOOOOr · mirT1离心lmin，离心后小心倒掉
上清液，用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底。5)将上述沉淀用70%乙醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，以5000r · mirT1 离心aiiin去上清液。重复洗涤沉淀1次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入 50 μ LTE溶解沉淀的DNA，保存。按照本实施方式可以可使反应均勻且充分，同时提高植物DNA的提取质量。实施例3与实施例1不同之处在于1)取一个红松胚置于2mL离心管中，加入液氮充分研磨研磨成呈现白色粉末，加入400 μ L氯仿，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，待用。2)水浴后将其加入500 μ LCTAB提取缓冲液中，于65°C下水浴15min，其间轻轻振荡3次，而后以12000r · mirT1离心5min，收集上清液转至新管中。CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2%的CTAB，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为 IOOmmol 'L-1Tris-HCl (ρΗ8. 0)，1. 4mol ·I^NaCl，20mmol 'L-1EDTA, 20mmol · L-1Ne^2O503)将上述收集上清液中加入上清液等体积的体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。4)将上述收集上清液中加入上清液2/3体积的预冷到0-4°C的异丙醇，轻轻上下倒置，而后置于_20°C的冰箱内静止5min，再以IOOOOr · mirT1离心lmin，离心后小心倒掉上清液，用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底。5)将上述沉淀用70 %乙醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，以5000r · mirT1 离心aiiin去上清液。重复洗涤沉淀1次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入 50 μ LTE溶解沉淀的DNA，保存。按照本实施方式操作可使反应均勻且充分，溶液中物质充分分层，有效去除胚中蛋白和多糖等杂质。实施例4与实施例1不同之处在于1)取一个红松胚置于2mL离心管中，加入液氮充分研磨研磨成呈现白色粉末，加入400 μ L氯仿，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，待用。2)水浴后将其加入500 μ LCTAB提取缓冲液中，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2 %的CTAB，即为CTAB 提取缓冲液，其中提取缓冲液为 IOOmmol · L^Tris-HCl (ρΗ8· 0)，1. 4mol · L^1NaCl, 20mmol · L-1EDTA, 20mmol · L-1Na2S2O503)将上述收集上清液中加入上清液等体积的体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，而后以12000r · mirT1离心5min，收集上清液转至新管中。4)将上述收集上清液中加入上清液2/3体积的预冷到0-4°C的异丙醇，轻轻上下倒置，而后置于_20°C的冰箱内静止5min，再以IOOOOr · mirT1离心lmin，离心后小心倒掉上清液，用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底。
5)将上述沉淀用70 %乙醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，以5000r · mirT1 离心aiiin去上清液。重复洗涤沉淀1次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入 50 μ LTE溶解沉淀的DNA，保存。按照本实施方式操作可使溶液中物质充分分层，进一步去除胚中蛋白和多糖等杂质。实施例5与实施例1不同之处在于1)取一个红松胚置于2mL离心管中，加入液氮充分研磨研磨成呈现白色粉末，加入400 μ L氯仿，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，待用。2)水浴后将其加入500 μ LCTAB提取缓冲液中，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2%的CTAB，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为 IOOmmol 'L-1Tris-HCl (ρΗ8. 0)，1. 4mol ·I^NaCl，20mmol 'L-1EDTA, 20mmol · L-1Ne^2O503)将上述收集上清液中加入上清液等体积的体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。4)将上述收集上清液中加入上清液2/3体积的预冷到0-4°C的异丙醇，轻轻上下倒置，而后置于_40°C的冰箱内静止lOmin，再以IOOOOr · mirT1离心lmin，离心后小心倒掉上清液，用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底。5)将上述沉淀用70 %乙醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，以5000r · mirT1 离心aiiin去上清液。重复洗涤沉淀1次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入 50 μ LTE溶解沉淀的DNA，保存。按照本实施方式可有效的沉淀DNA，提高胚DNA的得率。对比试验 常规CTAB法提取红松胚基因组DNA1、将红松胚放入2mL离心管中，用液氮研磨成粉末。2、向装有材料的离心管加入预热的750 μ LCTAB提取液，置于60°C水浴0.证。3、加等体积的氯仿-异戊醇，轻轻混勻。4、室温lOOOOrpm，离心lOmin，将上清液移至新的离心管。5、重复步骤2、3。6、每个样品中加2/3体积的异丙醇，轻轻摇勻，等待沉淀，甚至可以过夜。7、取出样品，8000rpm离心lOmin，弃去上清。8、用洗涤缓冲液洗涤两次，至少20min。9、2000rpm 离心 lOmin，弃去上清。10、自然风干或真空抽干DNA样品。11、将DNA重悬在适量IXTE中，_20°C保存(参见图2)。将对比试验和本发明上述实施例相比较可知采用传统CTAB法提取DNA时，是先加入DNA提取液后加氯仿-异戊醇，这样做的后果是存在的DNA酶会使部分DNA降解。本发明实施例先加入氯仿除去DNA酶，而后加入CTAB提取液的做法，使得DNA降解少，完整性好(参见图1)。同时本发明实施例将水浴时间缩短为lOmin，离心时间缩短为2min，不但提高了提取速度而且提取出来的DNA质量也很高(参见图1)。且加入预冷的异丙醇之后，置于-20°C静止5min，可以有效的防止DNA在沉淀过程中降解(参见图1)。另外与传统的CTAB法提取胚基因组相比，快速CTAB法具有安全、经济、快捷、方便的特点。本发明实施例所用的药品要比传统的CTAB法用量要少，水浴时间和离心时间等都较短，但取得了很好的效果，从而节约了成本。目前提取种子DNA的方法有很多，但很多方法需要特殊的仪器设备或者购买昂贵的试剂盒，而这些仪器设备和试剂盒并非每个实验室都具备，而本实验所用到的均为普通的仪器设备，操作比较方便，具有大众化的优势。综上参见图1和图2电泳的结果进行比较，可以清楚的看出本发明实施例提取的 DNA条带整齐，其带型无降解拖尾现象，DNA的得率较高，说明本方法所提取的DNA比目前采用的传统CTAB法提取的DNA质量更为优异。
权利要求
1.一种快速提取红松胚基因组DNA的方法，其特征在于按如下方法操作，1)将研磨后红松胚投加于氯仿中，于60-65°C水浴10-15min，待用；2)将上述水浴处理后红松胚加入CTAB提取缓冲液中，于60-65°C水浴10-15min，而后以10000-12000r · rniiT1离心2_5min，取上清液待用；3)将步骤幻所得上清液中加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇，而后在 10000-12000r · mirr1 离心 2_5min，取上清液待用；4)将步骤幻所得上清液中加入上清液2/3体积的异丙醇，混勻后于-20--40°C下静止 5-lOmin，而后以10000_12000r · mirT1离心l-5min，收集沉淀，洗涤后，即得到红松胚基因组 DNA。
2.按权利要求1所述的快速提取红松胚基因组DNA的方法，其特征在于所述步骤1) 中研磨后红松胚为将红松胚加入液氮中研磨成粉末。
3.按权利要求1所述的快速提取红松胚基因组DNA的方法，其特征在于所述步骤1) 和2)中水浴时需振荡2-3次。
4.按权利要求1所述的快速提取红松胚基因组DNA的方法，其特征在于所述步骤3) 中氯仿-异戊醇混合比例为按体积比为M 1混合。
5.按权利要求1所述的快速提取红松胚基因组DNA的方法，其特征在于所述步骤4) 中上清液与异丙醇混合后上下倒置混合均勻。
6.按权利要求1所述的快速提取红松胚基因组DNA的方法，其特征在于所述步骤 5)中离心得到沉淀用70%乙醇洗沉淀2次，而后于室温干燥，将干燥后所得DNA沉淀溶于 50 μ LTE中溶解保存。
全文摘要
本发明涉及分子标记技术，具体的说是一种快速提取红松胚基因组DNA的方法。将研磨后红松胚投加于氯仿中，于60-65℃水浴10-15min，待用；将上述水浴处理后红松胚加入CTAB提取缓冲液中，于60-65℃水浴10-15min，而后以10000-12000r·min-1离心2-5min，取上清液待用；所得上清液中加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇，而后在10000-12000r·min-1离心2-5min，取上清液待用；所得上清液中加入上清液2/3体积的异丙醇，混匀后于-20-40℃下静止5-15min，而后以10000-12000r·min-1离心1-5min，收集沉淀，洗涤后，即得到松胚基因组DNA。本发明与传统的CTAB法相比，提取效果比较好，时间短，容易操作。
文档编号C12N15/10GK102168082SQ20111005275
公开日2011年8月31日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者冯富娟, 隋心, 韩士杰 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所