专利名称：一种改造氧化葡萄糖酸杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种高产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其构建方法，采用分子手段引入SDH、SNDH,从而实现代谢山梨醇生产2-KLG，属于遗传工程领域。
背景技术：
维生素C (Vitamin C，VC)，又称为抗坏血酸(Ascorbic acid)，是一种人体必需的维生素和抗氧化剂，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等工业。目前国内维生素C工业化生产采用二步发酵法，在第二步混合菌发酵体系中，执行糖酸转化的微生物只有小菌，小菌单独生长很困难，需要与大菌共同培养才能正常生长。两种菌的发酵控制为生产工艺增加了很大困难，且小菌产酸性状不稳定，因而导致生产不稳定，经常因菌种退化造成倒罐， 导致生产上屡屡遭受重大损失。我国维生素C发酵技术从山梨醇到2-KLG的发酵过程由3 种细菌参与，势必在微生物代谢过程中造成底物和培养基的大量浪费，发酵过程分为两步不但延长了生产周期还造成能源和人力的大量浪费。因此，现有维生素C两步发酵工艺尚存在巨大技术进步的潜力。如何简化发酵工艺是一个迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产2-KLG的G. oxydans工程菌。所述工程菌可表达sdh、sndh基因。所述sdh、sndh基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。所述sdh、sndh基因克隆于G. oxydans-E. coli穿梭质粒载体pGUCl上。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高产2-KLG的G. oxydans基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，本发明的具体方案为1)根据本实验室对K. vulgare DSM 4205的全基因组测序结果中注释的sdh、sndh 基因序列设计引物克隆sdh、sndh基因；2)将sdh、sndh基因与载体连接得到重组表达载体；3)将得到的重组表达载体转化氧化葡萄糖酸杆菌(GluconcAacter oxydans,ATCC 621H)后得到重组菌株。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产2-KLG的方法，工程菌种子培养后，按15 %比例接种5L发酵罐，发酵1 后，流加量碳源2. 5g/L. h，发酵参数转速 500rpm, pH 5. 1 5. 4，通气量 1. 5vvm,控制罐温 34°C，罐压 0. 05MPa。种子和斜面培养基(g/L)山梨醇15，酵母膏0.6，碳酸钙0.4，pH 4. 8 5. 1，琼脂 20(斜面培养基)，pH 7.0，121°C灭菌15min，氨苄青霉素终浓度lOOyg/mL。发酵培养基(g/L)山梨醇25，酵母膏0.2，碳酸钙0.2，初始pH 5. 1 5. 4，121°C 灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μ g/mL。
山梨醇、2-KLG含量测定液相色谱(LC)发酵样品用流动相十倍稀释，0.45 μ m滤膜过滤。Agilent llOOsystem，RioRad公司Aminex HPX-87H色谱柱；流动相2. 75 μ mol/L浓硫酸；柱温35°C;流速0. 6mL/min ；进样量5 μ L ；检测器示差折光检测器。本发明通过基因工程改造，将来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的sdh、sndh基因表达于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)中，获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的G. oxydans工程菌。采用G. oxydans工程菌利用山梨醇一步发酵生产2-KLG，解除了小菌对伴生菌依赖的问题，简化了维生素C生产工艺。2-KLG的产量可达83g/L，具有很好的应用前景。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。
具体实施例方式实施例1表达载体的构建设计引物Pl :5，GGAATTCCATATGATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC3，；P2 :5，CGCGGAT CCTTATTGCGGCAGGGCGAAGACGTAGA3，，克隆 K. vulgare DSM4205 的 sdh 基因序列扩增后克隆到G. oxydans-E. coli穿梭质粒载体ρ⑶Cl上，构建表达载体ρ⑶Cl_sdh，将构建好的表达载体转化大肠杆菌JM109后，挑选转化子，提取质粒并经NdeI及BamHI酶切后，出现1740bp 的条带，证明已经成功构建表达载体ρ⑶Cl-sdh。设计引物P3 :5，CGCGGATCCATGTTACCCAAA TCATTGAAACATAAGA3，；P4 :5，CGAGCTCTCAGCGGG TGGCAGCGG3，，再将本实验室对 K. vulgare DSM4205的全基因组测序结果中注释的sndh基因序列扩增后克隆到穿梭质粒载体pGUCl 上，构建表达载体ρ⑶Cl-sdh-sndh，将构建好的表达载体转化大肠杆菌JM109后，挑选转化子，提取质粒并经BamHI及McI酶切后，出现1830bp的条带，证明已经成功构建表达载体 pGUCl-sdh-sldh。实施例2G. oxydans工程菌的构建将构建好的表达载体转化E. coli JM109o由于重组质粒上带有氨苄青霉素抗性基因，转化E. coli JM109感受态，涂布到含有氨苄青霉素的LB(酵母膏5g/L，蛋白胨IOg/ L，NaCl 10g/L，固体培养基加20g/L琼脂，调节pH 7. 0，121 °C灭菌15min)，挑取转化后平板上正常生长的转化子，提取质粒PCR验证，分别出现1740bp、1830bp的条带，对照未能PCR出同样条带，证明已成功转化到E. coli中，再将提取的质粒转化G. oxydans,得到 G. oxydans-pGUCl-sdh-sndh 工禾呈菌。实施例3发酵生产2-KLG种子和斜面培养基(g/L)山梨醇20，酵母膏2，碳酸钙0. 4，pH 4. 8 5. 1，琼脂 20(斜面培养基)，pH 7.0，121°C灭菌15min，氨苄青霉素终浓度lOOyg/mL。发酵培养基(g/L)山梨醇80，酵母膏5，碳酸钙0.2，初始pH 5. 1 5. 4，121°C灭菌15min，氨苄青霉素终浓度ΙΟΟμ g/mL。培养条件从斜面中接种重组菌于20mL的种子培养基中，30°C、200rpm培养3 后接15%于发酵培养基，于34°C、220rpm进行摇瓶发酵，发酵周期48h。2-KLG产量为52g/ L0实施例4发酵生产2-KLG工程菌种子培养后，按15 %比例接种5L发酵罐，发酵1 后流加量碳源2. 5g/L. h，发酵参数转速500rpm, pH 5. 1 5. 4，通气量1. 5vvm,控制罐温34°C，罐压0. 05MPa, 发酵结束后2-KLG产量达到83g/L。 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种高产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌(GluconcAacter oxydans)基因工程菌，其特征在于表达外源sdh、sndh基因。
2.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sdh基因核苷酸序列如SEQIDN0. 1 所示。
3.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sndh基因核苷酸序列如SEQIDNO. 2 所示。
4.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sdh、sndh基因克隆于 G. oxydans-E. coli 穿梭质粒载体 pGUCl 上。
5.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于包括如下步骤1)设计引物克隆sdh、sndh基因核苷酸序列；2)将sdh、sndh基因克隆到重组表达载体；3)将得到的重组表达载体转化氧化葡萄糖酸杆菌(GluconcAacteroxydans)后得到重组菌株。
6.应用权利要求1所述基因工程菌生产2-KLG的方法，其特征在于工程菌种子培养后， 按15 %比例接种5L发酵罐，发酵1 后流加量碳源2. 5g/L. h，发酵参数转速500rpm，pH 5. 1 5. 4，通气量1. 5vvm，控制罐温34°C，罐压0. 05MPa。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于所述碳源为山梨醇。
全文摘要
本发明公开了一种改造氧化葡萄糖酸杆菌产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法，属于遗传工程领域。本发明通过基因工程技术，将来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的山梨糖脱氢酶(SDH)、山梨酮脱氢酶(SNDH)基因表达于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)中，获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的G.oxydans工程菌。G.oxydans是二步发酵法生产2-KLG中第一步发酵过程常用菌种，将sdh、sndh基因表达于G.oxydans中，可以解除小菌对伴生菌依赖的问题，实现了从D-山梨醇到2-KLG的直接转化，简化了维生素C生产工艺，2-KLG的产量可达83g/L，具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/01GK102250822SQ20111014607
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者周景文, 堵国成, 陈坚, 高丽丽 申请人:江南大学