专利名称：一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种高产2-KLG的大肠杆菌工程菌及其构建方法，采用分子手段引入 SLDH、SDH/SNDH和辅酶PQQ，从而实现代谢山梨糖生产2-KLG，属于遗传工程领域。
背景技术：
维生素C是一种重要的有机酸，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中，2-KLG是合成维生素C的重要前体。目前国内维生素C工业化生产采用二步发酵法， 以D-山梨醇为底物的二步发酵法是研究得最早、也是研究得最多最深入的生产方法。在这一过程中，氧化葡萄糖酸杆菌(GluconcAacter oxydans)转化D-山梨醇为L-山梨糖，L-山梨糖转变为2-酮基-L-古龙酸Q-keto-L-gulonic acid, 2-KLG)的过程是由一个混菌系统完成的，这一混菌发酵系统由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare，俗称小菌)组成，其中K. vulgare为产酸菌， 单独培养时生长微弱，产酸较少；B. megaterium为伴生菌，不产酸，但促进K. vulgare生长或产酸。尽管目前国内维生素C工业化生产所采用的二步发酵工艺具有生产周期短、成本低廉等优点，但同时也存在一些问题，如(1)能耗物耗较高、成本高；( 废气、废水和废渣三废排放量大；C3)工艺复杂、产品创新品种较少等，制约了维生素C产业的进一步发展。如何简化发酵工艺是一个迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产2-KLG的E. coli工程菌。所述工程菌含有sldh、sdh/sndh、pqq基因。所述sldh、sdh/sndh、pqq 基因核苷酸序列分别如 SEQ ID NO. 1,SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 所示。所述sldh、sdh/sndh、pqq基因克隆于pET28a(+)表达质粒上。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高产2-KLG的E. coli基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，本发明的具体方案为1)分别设计引物克隆 Gluconobacter oxydans ATCC 621H 的 sldh 基因和 pqq 基因；根据本实验室对K. vulgare DSM4205的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因；2)将sldh、sdh/sndh、pqq基因与载体连接得到重组表达载体；3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)后得到重组菌株。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产2-KLG的方法，工程菌种子培养后，按10 %比例接种5L发酵罐，发酵1 后，流加量碳源2. 5g/L. h，发酵参数转速 500rpm, pH 5. 1 5. 4，通气量1. 5vvm，控制罐温30°C，罐压0. 05MPa，发酵罐溶氧反弹到20% -30%时添加IPTG至终浓度0. 5mM。种子和斜面培养基(g/L)酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10 ；琼脂20 (斜面培养基)， pH 7. 0，121 °C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 μ g/mL。发酵培养基(g/L):山梨糖80，蛋白胨12，酵母提取物M，甘油細1，磷酸二氢钾 2. 31，磷酸氢二钾12. 54，pH 7. 0，121°C灭菌15min，卡那霉素终浓度50 μ g/mL, IPTG终浓度 0. 5mM。山梨醇、2-KLG含量测定液相色谱(LC)发酵样品用流动相十倍稀释，0.45 μ m滤膜过滤。Agilent 1100 system, RioRad 公司Aminex HPX-87H色谱柱；流动相2. 75 μ mol/L浓硫酸；柱温35°C;流速0. 6mL/min ； 进样量5 μ L ；检测器示差折光检测器。本发明通过基因工程改造，将来源于氧化葡萄糖酸杆菌(GluconcAacter oxydans)的sldh和pqq基因簇及来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的sdh/sndh基因表达于大肠杆菌(Escherichia coli)中，获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的E. coli工程菌。采用E. coli工程菌利用山梨醇发酵生产2-KLG工艺简单， 2-KLG的产量可达87g/L，具有很好的应用前景。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。
具体实施例方式实施例1表达载体的构建设计引物Pl :5，GGAATTCCATATGATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC3，；P2 :5，CCCAAGC TTTTATTGCGGCAGGGCGAAGACGTAGA3，，克隆 K. vulgare DSM4205 的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列扩增后克隆到质粒pET28a(+)上，构建表达载体pET28a-Sdh/Sndh， 将构建好的表达载体转化转化E. coli JM109后，挑选转化子，提取质粒并经HindIII及 NdeI酶切后，出现1740bp的条带，证明已经成功构建表达载体pET28a-Sdh/Sndh ；设计引物 P3 :5’ CCCAAGCTTATGCCGAATACTTATGGCAGCAGAACCC3，P4 :5’ ATAAGAATGCGGCCGCTCAGCCCTTGT GATCAGGCAGTGC3，，克隆 Gluconobacter oxydans ATCC 621H sldh 基因序列扩增后克隆到 pET28a(+) -sdh/sndh上，转化E. coli JM109,挑选转化子，提取质粒并经HindIII及NotI 酶切后，出现2612bp的条带，证明已经成功构建表达载体pET28a-Sdh/sndh-sldh ；设计引物 P5 :5’ ATAAGAATGCGGCCGCATGGCCTGGAACACACCG3‘ ；P6 :5’ CCGCTCGAGTTACGTATAACGCCTGTA GAAC3，，克隆Gluconobacter oxydans ATCC 621H pqq基因序列扩增后克隆到 pET28a_sdh/ sndh-sldh上，转化E. coli JM109,挑选转化子，提取质粒并经NotI及SioI酶切后，出现 3187bp的条带，证明已经成功构建表达载体pET28a(+)-sdh/sndh-sldh-pqq。实施例2E. coli工程菌的构建将最后构建好的表达载体pEI^8a(+)-sdh/sndh-sldh-pqq转化E.coli JM109。由于重组质粒上带有卡那霉素抗性基因，转化E. coli JM109感受态，涂布到含有卡那霉素的 LB (酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,固体培养基加20g/L琼脂，调节pH 7. 0，121 °C 灭菌15min)，挑取转化后平板上正常生长的转化子，提取质粒PCR验证，分别出现1740bp， 2612bp,3187bp的条带，对照未能PCR同样条带，证明成功转化到E. coli中，再将提取的质粒转化 E. coli BL21，得到 E. coli-pET28a-sdh/sndh-sldh-pqq 工程菌。实施例3发酵生产2-KLG
种子和斜面培养基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 10 ；琼脂20 (斜面培养基)， pH 7. 0，121 °C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 μ g/mL。发酵培养基(g/L):山梨糖80，蛋白胨12，酵母提取物M，甘油細1，磷酸二氢钾 2. 31，磷酸氢二钾12. 54，pH 7. 0，121°C灭菌15min，卡那霉素终浓度50 μ g/mL, IPTG终浓度 0. 5mM。培养条件从斜面中接种重组菌于20mL的种子培养基中，接种菌龄12h，接种量 10%，装液量10%;诱导前菌体0D600值0. 6，添加IPTG至终浓度0. 5mM，于30°C、220rpm进行摇瓶发酵，发酵周期48h。摇瓶2-KLG产量为56g/L。实施例4发酵生产2-KLG5L发酵罐发酵16h后流加山梨醇2. 5g/L. h，发酵参数转速500rpm，pH7. 0，通气量1. 5vvm,控制罐温30°C，罐压0. 05MPa,发酵罐溶氧反弹到20% -30%时添加IPTG至终浓度0. 5mM。发酵结束后2-KLG产量达到87g/L。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种高产2-KLG的大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌，其特征在于表达外源 sldh、sdh/sndh、pqq 基因。
2.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sldh基因核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
3.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sdh/sndh基因核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述pqq基因核苷酸序列如SEQID NO. 3 所示。
5.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sldh、sdh/sndh、pqq基因克隆于 pET28a(+)质粒中。
6.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于包括如下步骤1)分别设计引物克隆Gluconobacteroxydans 621H中sldh基因和pqq基因；根据本实验室对K. vulgare DSM4205的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因；2)将sldh、sdh/sndh、pqq基因与载体连接得到重组表达载体；3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichiacoli)后得到重组菌株。
7.应用权利要求1所述基因工程菌生产2-KLG的方法，其特征在于工程菌种子培养后， 按10 %比例接种5L发酵罐，发酵1 !后流加量碳源2. 5g/L. h，发酵参数转速500rpm，pH 5. 1 5. 4，通气量1. 5vvm，控制罐温30°C，罐压0. 05MPa，发酵罐溶氧反弹到20% -30%时添加IPTG至终浓度0. 5mM。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于所述碳源为山梨醇。
全文摘要
本发明公开了一种改造大肠杆菌产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法，属于遗传工程领域。本发明通过基因工程技术，将来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的山梨醇脱氢酶(SLDH)、辅酶吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)基因簇和来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的山梨糖脱氢酶(SDH)/山梨酮脱氢酶(SNDH)基因表达于大肠杆菌(Escherichia coli)中，获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的E.coli工程菌。目前国内维生素C工业化生产所采用的二步发酵过程工艺复杂，影响因素较多，难以精确控制，同时3种微生物生长消耗了大量的原材料和能源，采用E.coli工程菌利用山梨醇进行发酵生产2-KLG，简化了生产工艺，节约了原材料和能源，2-KLG的产量可达87g/L，具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/19GK102250821SQ201110146020
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者周景文, 堵国成, 陈坚, 高丽丽 申请人:江南大学