专利名称：一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH及其基因和应用。
背景技术：
myo-肌醇六磷酸(IP6，myo-inositol hexakisphosphate)又叫做植酸(phytic acid)，是自然界中肌醇磷酸的最常见的形式。植酸的分子式是C6H18O24P6，分子量是660. 09。植酸主要以植酸钙镁钾盐的形式广泛存在于植物种子内，也存在于动物有核红细胞内，在土壤、植物以及微生物分泌到胞外的酶中都发现有植酸酶的存在。可想而知，植酸酶对于自然环境中磷的代谢循环有着重要的作用。另外，植酸对绝大多数金属离子都有极强络合能力，络合力与EDTA相似，但比EDTA的应用范围更广。在通常条件下，植酸中的磷酸酯键是非常稳定的，对于植酸的降解一般有两种方法，一是化学方法，但利用化学方法来降解植酸是极其困难的；另一种方法是酶解法，目前我们已知的能够有效降解植酸的只有植酸酶。目前植酸酶已经广泛的应用于饲料行业，特别是来源于真菌和细菌的组氨酸酸性磷酸酶类(HAP)植酸酶，因其最适pH偏酸和比活高等特点，可以显著的提高它们在鸡和猪的生产性能。如大肠杆菌和曲霉来源地植酸酶已经广泛地应用在动物养殖业。但因为在水产养殖业中的鱼类生长环境和体内温度较低，PH偏中性，导致HAP类植酸酶的应用受到了限制，所以具有中性PH特征的BPP类植酸酶越来越受到关注。但是目前已知BPP类植酸的最大缺点是催化效率低，很难满足实际生产需求。所以获得新型优质BPP植酸酶，提高BPP 类植酸酶的催化效率，都将可以大大扩展其实际应用空间，也正是目前急需解决的问题和执占。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有双结构域的低温中性植酸酶。本发明的另一目的是提供编码上述双结构域低温中性植酸酶的基因。本发明的另一目的是提供上述植酸酶N端及C端结构域及其编码基因，其中，N端结构域可以协同提高其他植酸酶的催化效率。本发明的另一目的是提供包含上述具有双结构域的低温中性植酸酶基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述具有双结构域的低温中性植酸酶基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供上述具有双结构域的低温中性植酸酶的应用。本发明从芽孢杆菌(Bacillus sp. HJB17)(微生物保藏号是CGMCC No. 4868 ；保藏时间是2011年05月18号；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。100101)中分离得到一种新的具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH。本发明提供了一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1 MLVAKKLATKNMFLLGAVSLTLLAMLSGCQAGKFATPISAAVQPLSVNASHFHKVQLAGQDYQLFTTTT ALQIRQGNRELAQQAGQFSRLVLQPLDTDALLLAAMDINSNTLFLWRFSTKQTPSLQLLQRRLISSRVVDDLCFYHS TENQQLSLFLLGGRGGADQLLLQQQQQWLAQPVVIRELNIPYDSTACVVDQTAGALYIAEADRAIWRYQAEPEADEG RSLVQVNKPFGQLQGEVKALQTLSDGSLLALEEAPARLLHINSDGQLRSAIAVPALAEASGLAVSMQGNTATAYIST EDAGAVQQLAWPQAKPERQPKAPWQLLPTLQTEPASQRGDVMDDPAVWHHPARPELSLILGTDKRAGLDVY 匪 QG TRVQQLSVGRLNNVDVRYGLNWQGSAHDIAVASLRDDNSLQLFAIDSSGTLHNAGKVATSMSEIYGLCMYHSAQ SN KHYVFVNDKAGLIQQYRIDTD⑶HWQGSLVRALQVPSQPEGCVADDIRGLLFVGEEDAAIWRFAAEAEATTTGEAII RVDGERLVDDIEGITLAEHNGSSYLLVSSQGNDSYLVFDAAPPYTERPHFRIGTNPLLGIDGASETDGVDVTTRSLG PGFEQGAFIVQDGRNRMPEQGQNLKLVPffADILQQLN其中，该酶包含644个氨基酸和一个终止密码子，前40个氨基酸是信号肽，因此， 成熟的植酸酶PhyH的理论分子量为67kDa。本发明的植酸酶PhyH同时具有双结构域，并有低温活性。本发明从筛选到Bacillus sp. HJB17中获得的中性植酸酶PhyH，其最适pH值为 7. 0，在碱性范围内pH 7. 0-12. 0，活性基本保持不变；最适温度为35°C，并在低温范围内 (20-350C )仍具有60%左右的酶活力。本发明中性植酸酶PhyH包括两个植酸酶结构域N 端的不完整的结构域PhyH-DI和C端的具有完整的典型BPP植酸酶结构域PhyH-DII。其中 PhyH-DII和PhyH均具有植酸酶活性。本发明提供了编码上述双结构域植酸酶PhyH的基因。具体地，该基因的序列如 SEQ ID NO. 2 所示SEQ ID NO. 2atgttagtagctaaaaagttagccacaaaaaatatgtttttactcggtgcagtcagtctgacgctgctg gccatgctaagcggctgtcaggctggcaagtttgccacacctatatcagctgcagtccaacctttatcggtcaatgc cagccacttccataaggtgcagctggccgggcaggattatcagctattcaccacaaccacggccttgcagatccgcc agggcaatcgcgagctggcgcagcaagctggccagtttagccgcctggtgctgcagccactggataccgatgcgctg ttattggcagcgatggatataaacagtaatactttgtttttatggcgtttttcaacaaagcaaacgcccagcctgca attgctgcaacgccggttgatcagcagccgggtggtagacgatctgtgcttttaccacagtactgaaaaccagcagc tcagcctgtttttactcggtggccgcggaggcgctgatcagctgctgttgcaacagcagcaacagtggctggcgcaa ccggtggtaatacgcgagttaaatatcccttatgacagcacggcttgtgtagtggatcagaccgctggtgcgctgta tatcgccgaagctgatcgcgctatctggcgctatcaggccgaacccgaagccgatgagggccgcagtttagttcagg taaataagccgtttggccagttgcagggcgaagtaaaagcgctgcaaacgttgtctgacggcagcctgctggcgctg gaggaagcaccggccagattgttacatattaacagcgacggccagctgcgcagcgccatagctgtcccggcgttggc cgaggccagcggtttagcggtcagtatgcagggcaacacggcaacagcctatatcagcactgaggatgccggtgcag tacagcagctagcggtggtgccgcaggcgaagccggagcgtcagcccaaagcgccggtagtccagctgttgccgacc ttacagactgagcccgccagtcagcgtggcgatgtgatggatgaccccgcggtgtggcatcatccggcgcggcctgagcttagcctgatcctcggcactgacaaacgcgccggactggatgtgtacaatatgcagggtacgcgcgtgcagcagc ttagcgtgggccggttaaataatgtcgatgtgcgctacggcctgaactggcagggtagtgcgcacgatattgccgta gccagtttgcgcgacgacaacagcctgcaactttttgctattgatagcagtggcacgctgcataatgccggtaaggt cgcaaccagcatgagcgagatttacggcctgtgtatgtatcacagtgcacaaagcaataagcattatgtgtttgtta atgataaagccggtttaattcagcagtatcgcatcgacacagacggcgaccactggcagggcagcttagtgcgcgct ttgcaggtaccgtcgcaaccggaaggctgtgtggccgatgatatacgcggcctgttatttgtcggcgaagaagatgc tgccatctggcgttttgccgctgaagccgaagcgacaaccacaggtgaagcgatcatccgcgttgatggtgagcggc tggtcgacgatattgaaggcataacattggcagagcataacggcagcagttatctgttggtatcaagccagggtaat gacagttacctggtgtttgacgccgcgccaccttatacagagcggccgcattttcgtattggcactaacccattact gggcatagatggcgcctctgagactgatggcgttgatgttaccacccgttcgctggggcctggctttgagcagggcg cctttatcgtacaggacggccgtaaccgtatgccggaacagggccaaaaccttaaactggtaccctgggcagatata ttgcagcaattaaac本发明提供了一种具有双结构域的低温中性植酸酶，其N端不完整结构域 (41-318aa)PhyH-DI的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，该不完整结构域PhyH-DI的理论分子量是31kDa。οSEQ ID NO. 3 AVQPLSVNASHFHKVQLAGQDYQLFTTTTALQIRQGNRELAQQAGQFSRLVLQPLDTDALLLAAMDINS NTLFLWRFSTKQTPSLQLLQRRLISSRVVDDLCFYHSTENQQLSLFLLGGRGGADQLLLQQQQQWLAQPVVIRELNI PYDSTACVVDQTAGALYIAEADRAIWRYQAEPEADEGRSLVQVNKPFGQLQGEVKALQTLSDGSLLALEEAPARLLH INSDGQLRSAIAVPALAEASGLAVSMQGNTATAYISTEDAGAVQQLAVVPQAKPE本发明的中性植酸酶PhyH的N端的不完整的结构域PhyH-DI不能降解植酸(IP6)。 进一步的研究发现，PhyH-DI可以降解低磷底物IP4,并且可以与PhyH-DII及其他植酸酶协同作用，来提高植酸酶的催化效率。本发明提供了编码上述不完整结构域值酸酶PhyH-DI的基因。具体地，该基因的序列如SEQ ID NQ. 4所示SEQ ID NO. 4GCAGTCCAACCTTTATCGGTCAATGCCAGCCACTTCCATAAGGTGCAGCTGGCCGGGCAGGATTATCAG CTATTCACCACAACCACGGCCTTGCAGATCCGCCAGGGCAATCGCGAGCTGGCGCAGCAAGCTGGCCAGTTTAGCCG CCTGGTGCTGCAGCCACTGGATACCGATGCGCTGTTATTGGCAGCGATGGATATAAACAGTAATACTTTGTTTTTAT GGCGTTTTTCAACAAAGCAAACGCCCAGCCTGCAATTGCTGCAACGCCGGTTGATCAGCAGCCGGGTGGTAGACGAT CTGTGCTTTTACCACAGTACTGAAAACCAGCAGCTCAGCCTGTTTTTACTCGGTGGCCGCGGAGGCGCTGATCAGCT GCTGTTGCAACAGCAGCAACAGTGGCTGGCGCAACCGGTGGTAATACGCGAGTTAAATATCCCTTATGACAGCACGG CTTGTGTAGTGGATCAGACCGCTGGTGCGCTGTATATCGCCGAAGCTGATCGCGCTATCTGGCGCTATCAGGCCGAA CCCGAAGCCGATGAGGGCCGCAGTTTAGTTCAGGTAAATAAGCCGTTTGGCCAGTTGCAGGGCGAAGTAAAAGCGCT GCAAACGTTGTCTGACGGCAGCCTGCTGGCGCTGGAGGAAGCACCGGCCAGATTGTTACATATTAACAGCGACGGCC AGCTGCGCAGCGCCATAGCTGTCCCGGCGTTGGCCGAGGCCAGCGGTTTAGCGGTCAGTATGCAGGGCAACACGGCA ACAGCCTATATCAGCACTGAGGATGCCGGTGCAGTACAGCAGCTAGCGGTGGTGCCGCAGGCGAAGCCGGAG本发明提供了上述植酸酶结构域PhyH-DI用于提高植酸酶活性的应用。本发明提供了 PhyH-DII的氨基酸序列，具体地，该基因的序列如SEQ ID NO. 5所示，其理论分子量是36kDa，PhyH-DII可以有效的降解植酸。SEQ ID NO. 5RQPKAPVVQLLPTLQTEPASQRGDVMDDPAVWHHPARPELSLILGTDKRAGLDVYNMQGTRVQQLSVG RLNNVDVRYGLNWQGSAHDIAVASLRDDNSLQLFAIDSSGTLHNAGKVATSMSEIYGLCMYHSAQSNKHYVFVNDK AGLIQQYRIDTD⑶HWQGSLVRALQVPSQPEGCVADDIRGLLFVGEEDAAIWRFAAEAEATTTGEAIIRVDGERL VDDIEGITLAEHNGSSYLLVSSQGNDSYLVFDAAPPYTERPHFRIGTNPLLGIDGASETDGVDVTTRSLGPGFEQ GAFIVQDGRNRMPEQGQNLKLVPWADILQQLN本发明提供了 PhyH-DII的核苷酸序列，具体地，该基因的序列如SEQ ID NO. 6所示SEQ ID NO. 6cgtcagcccaaagcgccggtagtccagctgttgccgaccttacagactgagcccgccagtcagcgtggc gatgtgatggatgaccccgcggtgtggcatcatccggcgcggcctgagettagcctgatcctcggcactgacaaacg cgccggactggatgtgtacaatatgcagggtacgcgcgtgcagcagcttagcgtgggccggttaaataatgtcgatg tgcgctacggcctgaactggcagggtagtgcgcacgatattgccgtagccagtttgcgcgacgacaacagcctgcaa ctttttgctattgatagcagtggcacgctgcataatgccggtaaggtcgcaaccagcatgagcgagatttacggcct gtgtatgtatcacagtgcacaaagcaataagcattatgtgtttgttaatgataaagccggtttaattcagcagtatc gcatcgacacagacggcgaccactggcagggcagcttagtgcgcgctttgcaggtaccgtcgcaaccggaaggctgt gtggccgatgatatacgcggcctgttatttgtcggcgaagaagatgctgccatctggcgttttgccgctgaagccga agcgacaaccacaggtgaagcgatcatccgcgttgatggtgagcggctggtcgacgatattgaaggcataacattgg cagagcataacggcagcagttatctgttggtatcaagccagggtaatgacagttacctggtgtttgacgccgcgcca ccttatacagagcggccgcattttcgtattggcactaacccattactgggcatagatggcgcctctgagactgatgg cgttgatgttaccacccgttcgctggggcctggctttgagcagggcgcctttatcgtacaggacggccgtaaccgta tgccggaacagggccaaaaccttaaactggtaccctgggcagatatattgcagcaattaaac本发明通过PCR的方法分离克隆了植酸酶基因phyH，DNA全序列分析结果表明，该基因全长1224bp。将phyH的氨基酸序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，PhyH与来源于Idiomarina loihiensis L2TR的假定植酸酶的具有最高一致性(51%)， PhyH-DI 与来源于 B. amyloliquefaciens TS-Phy 的植酸酶一致性为 25%，PhyH-DII 与 TS-Phy的一致性为49%，与来源于B. subtil is PhyC的一致性为40%，说明phyH是一种新的植酸酶。本发明还提供了包含上述植酸酶基因phyH的重组载体，命名为pET22b(+)_phyH。 将本发明的植酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的植酸酶基因插入到质粒pET22b⑴上的EcoR I和Xho I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET22b (+)-phyH。本发明还提供了包含上述植酸酶基因PhyH的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明还提供了一种制备中性植酸酶PhyH的方法，包括以下步骤1)用上述的载体转化宿主细胞，得到活性菌株；2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；
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3)回收并纯化所表达的植酸酶PhyH。本发明还提供了上述植酸酶PhyH的应用。本发明发现了一种具有双结构域的BPP植酸酶，它由N端的不完整的结构域 PhyH-DI和C端的具有完整的典型BPP植酸酶结构域PhyH-DII组成。研究发现，一方面，不完整的结构域PhyH-DI不能降解植酸酶底物IP6,但是可以降解植酸水解过程中的中间产物 IP4，从而促进植酸底物的完全降解；另一方面，该结构域可以与PhyH-DII等其他植酸酶协同作用，从而提高其他单结构域质酸酶的比活和催化效率，为提高BPP类植酸酶的催化效率提供了一种思路。同时，该酶具有低温活性和良好的碱性稳定性，具有实际应用的潜力。本发明首先所要解决的技术问题是针对BPP类植酸酶催化效率低的现状，提供一种性质优良的、适合于在鱼类饲料中应用新的植酸酶。本发明的植酸酶最适PH为7.0，在pH 7. 0 12. 0都的稳定性好；最适温度35°C，在20-35°C保持60%以上的酶活，并且在0°C还有20%的酶活。其低温和pH中性的特性，可使其在鱼类饲料中应用。本发明发现了不完整的结构域PhyH-DI可以降解IP4，并可以与完整的结构域PhyH-DII协同作用，来提高双结构域植酸的催化效率。通过融合表达，发现这种协同作用同样适用于其它的植酸酶。
图1重组植酸酶的表达和纯化，其中，1 PhyH未纯化2 PhyH-DII未纯化3 PhyH-DI 未纯化 4 PhyH(67kDa) 5 PhyH-DII (36kDa) 6 PhyH-DI (31 kDa)图2重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的钙离子浓度影响。图3重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的最适pH。图4重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的pH稳定性。图5重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的最适温度。图6重组植酸酶PhyH的热稳定性。
图7重组植酸酶PhyH-DII的热稳定性。图8融合表达载体构建图。芽孢杆菌(Bacillus sp. HJB17)(微生物保藏号是=CGMCC No. 4868 ；保藏时间是 2011年05月18号；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；100101)
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体本发明从芽孢杆菌(Bacillus sp. HJB17)(微生物保藏号是 CGMCC No. 4868 ；保藏时间是2011年05月18号；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；100101)中分离得到一种新的具有双结构域的低温中性植酸酶，大肠杆菌表达载体 pET22b (+)及菌株BL21(DE3)为实验室保存。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。 购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。细菌基因组提取试剂盒购自天根公司。
3、培养基大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH 7.0)。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1芽孢杆菌Bacillus sp. HJB17产酶特性新疆天上一号冰川冻土样品经植酸酶筛选培养基培养(低磷培养基LPM)后， 按常规稀释平板，分别在4，20，37°C进行培养。然后将生长出的具有透明圈单菌落划平板分纯，并将有活性菌株进行鉴定，经16S鉴定后该菌株为芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp.HJB17。低磷培养基LPM的配方如下酪蛋白胨Ig ；大豆蛋白胨0. 45g ；葡萄糖4g ；谷氨酸盐0. 5g ；氯化钠5g ； MgCl2L 7mM ；MgSO4L 4mM ；KC1，0. 47mM ；CaCl2O. 3mM ；溶于 900mL 50mMpH 7. 5Tris-HCl 中，定容至lOOOmL，分装，灭菌15min待用。Bacillus sp. HJB17的最适生长条件是37°C，pH 7. 0。在37°C检测到该菌具有植酸酶活性(0. 33 士 0. 05U · mr1)。实施例2芽孢杆菌Bacillus sp. HJB17植酸酶编码基因phyH的克隆提取芽孢杆菌Bacillus sp. HJB17基因组DNA，采用细菌基因组提取试剂盒(天根公司)，具体操作间说明书。根据BPP植酸酶基因的保守区序列设计合成了简并引物 BPP-F 和 BPP-R BPP-F 5 ‘ -GACGCAGCCGAYGAYCCNGCNITNTGG-3 ‘和 BPP-R 5' -CAGGSCGCANRTCIACRTTRTT-3‘。以 Bacillus sp. HJB 17 总 DNA 为模板进行 PCR扩增。 得到一约ISObp片段，将该片段回收后与PEASY-T3载体相连测序。根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22 30nt，退火温度在60 65°C。并将它们分别命名为uspl，卿2，usp3(上游特异性引物)，dspl, dsp2, dsp3(下游特异性引物)见表1。表1植酸酶PhyH的TAIL-PCR特异性引物
权利要求
1.一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH的基因，其特征在于，编码权利要求1所述的具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH。
3.如权利要求2所述的双结构域的低温中性植酸酶PhyH的基因，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.一种植酸酶结构域PhyH-DI，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
5.权利要求4所述的结构域PhyH-DI的基因，其特征在于，其核酸序列如SEQID NO. 4 所示。
6.权利要求4所述植酸酶结构域PhyH-DI用于提高植酸酶的活性的应用。
7.一种具有植酸酶活性的植酸酶结构域PhyH-DII，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示.
8.权利要求7所述的结构域PhyH-DII的基因，其特征在于，其核酸序列如SEQIDNO. 6 所示。
9.权利要求1所述具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH的应用。
10.芽孢杆菌(Bacillussp. HJB17)，其保藏号是CGMCC No. 4868。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH及其基因和应用。本发明提供了一种来源于芽孢杆菌属Bacillus sp.HJB17的中性植酸酶PhyH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述中性植酸酶的编码基因PhyH。本发明的植酸酶具有良好的pH稳定性，在碱性范围内依然保持较高酶活；在低温范围具有较高的相对酶活；具有双结构域，N端为一个不完整的BPP植酸酶结构域；C端是一个完整的植酸酶的结构域。总之，本发明获得的PhyH作为一种低温中性植酸酶可以应用于渔业养殖生产；其PhyH-DI结构域可以提高其他植酸酶的催化效率，有助于其改进其他植酸酶的生产和应用。
文档编号C12N15/55GK102250853SQ20111017173
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者姚斌, 孟昆, 李中媛, 杨培龙, 柏映国, 石鹏君, 罗会颖, 袁铁铮, 黄火清 申请人:中国农业科学院饲料研究所