专利名称：一种hk97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学基因工程领域，具体涉及一种HK97噬菌体病毒样颗粒蛋白的嵌合体的构建及其纯化，以及在生物免疫靶向治疗中的作用。
背景技术：
针对慢性疾病的治疗性疫苗是目前疫苗研究的热点之一，这些疾病包括慢性病毒感染、过敏性疾病、肿瘤、糖尿病、高血压和阿尔茨海默病等。与普通预防性疫苗不同的是治疗性疫苗针对的是自身抗原或外来免疫耐受抗原，因此，治疗性疫苗要发挥治疗作用必须首先打破免疫耐受，产生针对特定抗原的自身抗体或自身反应T细胞。由于治疗性疫苗所针对的靶抗原一般是短肽，抗原性较弱，必须与合适的载体结合后，在免疫佐剂的帮助下才能发挥作用，因此，选择合适的载体及佐剂往往是治疗性疫苗成功的关键。目前常用的载体如KLH、破伤风类毒素等，效力一般不强，必须使用佐剂，而常用的佐剂如弗氏佐剂虽然效能较强，但不能应用于人体，铝制佐剂虽然可应用于人体，但免疫效能很弱，而且也存在如脑动脉硬化、铝盐局部堆积等不良反应。因此，理想的治疗性疫苗载体，应该在与靶抗原结合后，在不应用免疫佐剂的情况下，就能有效打破机体的免疫耐受， 产生高滴度抗体，发挥治疗作用。病毒样颗粒就是这样一类理想的疫苗载体。病毒样颗粒(VLP)是由病毒衣壳蛋白装配成的不含病毒核酸的空壳结构，具有病毒的外形和免疫原性，可诱导机体产生以体液免疫为主的反应，从而产生针对与之结合的抗体，由于不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒复制增殖的风险。病毒样颗粒由大量重复结构的衣壳蛋白单体聚合而成，进入体内后可以与特异性B细胞表面的B细胞受体结合并激活B细胞，同时，VLP还可提供外源性T细胞表位而激活辅助性T细胞，从而突破自身免疫耐受。另外每个衣壳蛋白单体一般具有碱性多肽域，如赖氨酸的-NH2，这些碱性多肽域朝向颗粒的外表面，短肽等小分子只要带有合适的氨基酸基团，如-SH，通过异双功能交联剂就能结合并展示于VLPs表面，刺激机体产生抗体。目前国内外已制备出多种噬菌体病毒样颗粒，如Qi3噬菌体病毒样颗粒、人乳头瘤病毒样颗粒(朋力、1^2病毒样颗粒等。瑞士 Cytos公司将Qi3噬菌体病毒样颗粒为载体研制了一系列治疗性疫苗，包括阿尔茨海默病AD疫苗(CAD106)、尼古丁疫苗(NIC002)、过敏性哮喘疫苗(CYT003-QbG10)等，其中其研制的针对血管紧张素II的降压疫苗(CYTOOe-AngQb)，已完成IIa期临床实验，针对过敏性鼻结膜炎研制的疫苗 (CYT003-QbG10)已完成nb期临床实验。而比利时葛兰素史克公司(GSK)研制的已经上市的子宫颈癌疫苗Cervarix (TM)的主要疫苗成分就是HPV-16和HPV-18。这些病毒样颗粒显示了强大的免疫原性和人使用之后的安全性。迄今为止，HK97噬菌体病毒样颗粒的研究虽有文献报道，但是对其嵌合体的研究少见，且作为生物免疫靶向治疗载体的用途未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体。
本发明的第二个目的是HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体在生物免疫靶向治疗中的作用。本发明通过以下技术方案实现HK97噬菌体病毒样颗粒蛋白嵌合体HII-HK97-P的制备(1)将编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因插入pETDuet-Ι质粒(购自Novagen公司)的多克隆位点上；(2)在编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP5基因的C端添加表达AFHYESQ 短肽的碱基序列，将该GP5基因插入pETDuet-Ι质粒的多克隆位点上，构建嵌合体表达质粒 pETDuet-HK97-P ；(3)将质粒pETDuet-HK97-P转化至BL21(DE!3)感受态细菌，IPTG诱导表达病毒样颗粒嵌合体前体P II-HK97-P ；(4)6% PEG80004°C沉降病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P ；(5)强阴离子交换层析纯化所述病毒样颗粒嵌合体前体ΡΙΙ-ΗΚ97-Ρ ；(6)酸化诱导所述病毒样颗粒嵌合体前体ΡΙΙ-ΗΚ97-Ρ成熟膨胀为成熟病毒样颗粒嵌合体ΗΙΙ-ΗΚ97-Ρ ；(7)凝胶层析纯化成熟病毒样颗粒嵌合体ΗΙΙ-ΗΚ97-Ρ。本发明保藏培养物命名为Escherichia coli BL21 (DE3)/pETDuet-HK97_P，于 2011年6月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :M2011206。本发明的优点UHK97噬菌体病毒样颗粒GP5蛋白羧基末端可以添加融合1_12个氨基酸而不影响病毒样颗粒的自我组装，从而以嵌合体形式将短肽表位直接展示在病毒样颗粒表面。2、本发明制备的HK97噬菌体病毒样颗粒蛋白嵌合体HII-HK97-P可以用于生物免疫靶向治疗中。
序列表SEQ ID
因的核苷酸序列。序列表SEQ ID 因的核苷酸序列。序列表SEQ ID 因编码的氨基酸序列。序列表SEQ ID 因编码的氨基酸序列。图1 琼脂糖凝胶电泳鉴定嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P。图2 :HII-HK97-P病毒样颗粒的成熟和纯化过程。取酸化诱导后的样品(Omin)、 中和后样品(5min，10min，30min，60min，airs)进行SDS-PAGE电泳鉴定和纯度分析，随着中和时间的延长，五聚体和六聚体所占比例越来越大。图3 :HK97-P病毒样颗粒嵌合体前体ΡΙΙ_ΗΚ97_Ρ和成熟体ΗΙΙ-ΗΚ97-Ρ电镜图。 左图为ΡΙΙ-ΗΚ97-Ρ电镜图，右图为ΗΙΙ-ΗΚ97-Ρ电镜，后者在形态结构上相比前体具有更薄
NO 1是本发明构建ΗΚ97噬菌体病毒样颗粒嵌合体所用的GP4基 NO 2是本发明构建ΗΚ97噬菌体病毒样颗粒嵌合体所用的GP5基 NO 3是本发明构建ΗΚ97噬菌体病毒样颗粒嵌合体所用的GP4基 NO 4是本发明构建ΗΚ97噬菌体病毒样颗粒嵌合体所用的GP5基的外壳，直径由^nm扩大至约66nm。图4 :HII-HK97-P疫苗免疫正常SD雄性大鼠后抗Pl短肽抗体滴度。第7、21、35、 45天免疫大鼠的抗Pl短肽抗体滴度的测定(血清均以1 1000稀释)。
具体实施例方式以下实施案例在于进一步说明本发明，但不限制其范围。实施案例1嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P的构建用引物5，-CCATGGCTGAAATCGTAAAAACGCTGT-3，；5，-CCGGAATTCTTATTTACCTAAGTT AGAAGGG-3’，通过PCR扩增得到编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因，大小为 678bp。用引物 5，-CCATATGTCTGAACTCGCTCTCATTC-3，； 5，-CTCGAGTCAACGAGATTCGTAGTGG-3 ’， 通过PCR扩增得到编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP5基因，大小为1158bp。将上述得到的GP5基因片段和GP4基因片段插入pETDuet-Ι质粒(购自Novagen 公司)的两个多克隆位点，构建嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P，酶切鉴定其分子量大小 (图 1)。实施案例2 HII-HK97-P病毒样颗粒的成熟及其纯化(1)将质粒pETDuet-HK97-P转化至BL21 (DE3)感受态细菌，挑取单个菌落于20ml 液体培养基中37°C扩增16小时，取该菌液Iml加入IL液体培养基中，37°C扩增数小时至培养基的OD6tltlnm约为0. 6，加入IPTG QOul，0. 2g/ml)诱导表达病毒样颗粒嵌合体前体 PII-HK97-P。0)4小时后裂解细菌离心取上清于6% PEG80004°C沉降病毒样颗粒嵌合体前体 PII-HK97-P过夜，PII-HK97-P经UnoQ强阴离子交换层析 QOmM Tris-HCl, IM NaCl)纯化。(3)阴离子交换纯化后对PII-HK97-P进行诱导成熟将30mg/ml ΡΙΙ_ΗΚ97_Ρ病毒样颗粒嵌合体前体1. 5ml稀释于150ml酸化缓冲液(pH3. 8，250mM KCl,50mM Citrate)中1 小时，随后加入1/6体积的中和缓冲液(ρΗ8· 3，IM Tris-HCl)至总体系的pH在7. 0以上， 室温放置2小时或者更长时间。SDS-PAGE电泳鉴定病毒样颗粒嵌合体前体、中间体和成熟体(见实施案例3，图2)。(4)酸化诱导成熟的病毒样颗粒嵌合体HII-HK97-P经凝胶过滤层析纯化以达到更高的纯度。实施案例3 HII-HK97-P病毒样颗粒的鉴定取HK97-P病毒样颗粒嵌合体前体、中间体和成熟体各20ug进行6 % SDS-PAGE电泳(图幻，并取HK97-P病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P和成熟体HII-HK97-P进行透射电镜(镍网，4%醋酸双氧铀负染)下的形态和大小观测(图3)。电镜观测发现，HK97-P 病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P是自行组装的棱形病毒样颗粒结构，直径大约Mnm，而成熟体HII-HK97-P在形态结构上相比前体具有更薄的外壳，直径稍微扩大，约为66nm。实施案例4 HII-HK97-P嵌合体疫苗免疫大鼠后抗P短肽抗体的产生清洁级SD大鼠10只随机分为两组，每组5只，饲养于清洁级动物房，采用iai/iai 光照及非限制性普通饮食。取HII-HK97-P疫苗免疫大鼠采用背部皮下3-4点注射疫苗的方案，400ul/只，疫苗剂量约300ug/只，于初次免疫后间隔两周加强2次。0. 3%戊二醛交联剂耦联牛血清白蛋白(BSA)与短肽P，以此耦联物(IOug/孔)包被96孔ELISA板。于7、21、35、45天取大鼠鼠尾静脉血使用ELISA进行抗P短肽抗体滴度的测定(血清均以1 1000稀释)(图4)。
权利要求
1.一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其特征在于该病毒样颗粒的嵌合体是由构建的嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P经过诱导表达、纯化和酸化成熟而得到的。
2.如权利要求1所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其中所述嵌合体表达质粒 pETDuet-HK97-P中含有HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因。
3.如权利要求1所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其中所述嵌合体表达质粒 pETDuet-HK97-P中含有HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP5基因，该GP5基因的C端添加了表达AFHYESQ短肽的碱基序列。
4.如权利要求3所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其中所述AFHYESQ短肽的碱基序列是 5，-GCGTTCCACTACGAATCTCGT-3，。
5.如权利要求1所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其作为生物靶向治疗载体的用途。
6.如权利要求1所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其中所述嵌合体表达质粒 pETDuet-HK97-P保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO :M2011206，保藏命名为 Escherichia coli BL21 (DE3)/pETDuet-HK97_P。
全文摘要
本发明提供了一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，以及该嵌合体在生物免疫靶向治疗中的作用。通过在HK97噬菌体病毒样颗粒的GP5基因的C端添加表达AFHYESQ短肽的碱基序列，将该GP5基因和编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因插入到pETDuet-1质粒上，构建了HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体表达质粒，将表达质粒诱导表达后的前体进行纯化、酸化诱导成成熟的HK97噬菌体病毒样颗粒嵌合体。并将HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体作为生物靶向治疗载体，制备成疫苗，发挥生物免疫靶向治疗作用。
文档编号C12N7/02GK102337251SQ201110171730
公开日2012年2月1日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者周子华, 廖玉华, 杨仕俊, 王敏, 邱志华, 陈芬, 陈霄 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院