专利名称：一种白土苓基原植物dna分子鉴别方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及白土苓DNA分子鉴别方法。
背景技术：
白土苓为百合科肖菝葜属植物短柱肖菝葜Heterosmilax yunnanensis Gagnep., 华肖菝葜H. chinensis Wang或肖菝葜H. japonica. Kunth的干燥块茎。其混用比较严重， 尤其是与菝葜属植物存在混用，二者植物形态差别不大，鉴别不易。肖菝葜，无刺灌木，攀缘，少有直立。叶纸质，少有近革质，有3-5条主脉和网状支脉；叶柄具或不具卷须，在上部有一脱落点，因而在叶片脱落时总是带着一段短的叶柄(纤柄肖菝葜几乎不带叶柄)。伞形花序生于叶腋或鳞片腋内；总花梗常多少扁平，在总花梗着生点和叶柄之间多半有一腋生芽；花小，雌雄异株；花被片合生成筒状，称花被筒，筒口一般有3 (2-6)小齿；雄花有3-12枚雄蕊，花丝或多或少合生成一柱状体，少有完全分离；花药基着，2室，内向，近药隔边缘开裂，无退化子房；雌花有3-6退化雄蕊，生于子房基部或筒上，丝状或条形；子房3室，每室有2胚珠，柱头3裂。浆果球形，有1-3颗种子。肖菝葜含有多种化学成分，主要含有皂苷类、蒽醌类、留醇类、黄酮类、有机酸类、 酚苷类、烷烃类、多糖类、鞣质类等成分。它具有清热、除湿、解毒、通利关节的功效，临床用于湿热淋浊，带下，疥癣，杨梅毒疱，筋骨挛痛，瘰疬痈肿及钩端螺旋体等病。本属区别于菝葜属的唯一性状是花被片合生成筒状，而本属植物的种间主要鉴别点也是在花。白土苓的花期较短，并受生长环境影响，生长分散，较难采集具有代表性数量的带花植物，为白土苓药材的基原鉴别增加了难度。
发明内容
本发明目的在于公开一种白土苓DNA分子鉴别方法，特别是白土苓中短柱肖菝葜、华菝葜和肖菝葜中DNA分子鉴别方法。本发明目的是通过如下方案实现的一种短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜的DNA分子鉴别方法，其特征在于通过如下步骤实现(1)总DNA的提取取待测短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜植物叶片，提取获得总DNA。(2) PCR 扩增选取叶绿体DNA基因间序列引物引物 1 Forward-Primer :5，-TTGAGCTCCATCTACAAATGG-3，引物 2 =Reverse-Primer :5，-CCCTTATCTAGCTAAAGGATT-3，进行PCR扩增，扩增结果用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。(3)总DNA的序列测定PCR扩增产物直接送北京擎科新业生物技术有限公司测序。
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(4) DNA序列分析及植物鉴别测序结果先用Contig Express (Informax 2000)序列比对软件校序，再用 BioEdit序列编辑软件对序列进行编辑，寻找种间变异位点，结果为其中190bp的C/A替代和366-402bp37个碱基插入/缺失是短柱肖菝葜的鉴别特征位点；262_302bp40个碱基和342-350bp9个碱基的插入/缺失是华肖菝葜和肖菝葜的鉴别特征位点。其中(1)所述的总DNA的提取的具体步骤为1)用研磨仪将用硅胶干燥的叶片在2ml离心管中研磨至粉末状。2)加入900μ 1预热的2XCTAB提取液(十六烷基三甲基溴化铵4g ;NaCl 16. 364g ； 1MPH8. 0 的 Tris-HCl 20ml ；0. 5M EDTA 8ml)和 6 μ 1 β -巯基乙醇，60°C _70°C水浴温浴1.5-2小时。3)将温浴的材料冷却至室温，加入等体积的M 1的氯仿-异戊醇混合溶液，摇勻5-10分钟，然后离心5-10分钟，取上清液。4)将上清液转移到一新的2ml离心管中，再加入等体积的M 1的氯仿-异戊醇混合溶液，摇勻5-10分钟，然后离心5-10分钟，取上清液。5)将上清液转移到一新的1. 5ml离心管中，加入相当上清液体积70%的异丙醇， 沉降DNA，颠倒离心管2-3次，可见白色絮状沉淀，-20°C冰箱中静置30分钟，离心5_10分钟，弃上清液，得固体沉淀。6)固体沉淀用500 μ 1 75%乙醇和无水乙醇各洗1次，离心20_30s后弃上清，然后将离心管吹干使乙醇完全挥发，得到短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜植物的总DNA。7)将上述的总DNA干燥后加入0. 1 X TE缓冲液100 μ 1和1_2 μ 1的RNase (核糖核酸酶)于室温下消化RNA11-13小时，混勻后用0.5-1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。其中 O) PCR扩增条件为PCR扩增反应采用20 μ 1体系，其组分及终浓度反应程序在92 °C -96 °C下反应2_6分钟后，在92 °C -96 °C反应30秒-45秒， 550C -600C 25 秒 _；35 秒，70°C -74°C 1.分钟 _2 分钟，28-32 个循环后，再在 70°C _74°C下反应5分钟-10分钟。扩增结果用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，均出现清楚的扩增条带。其中O) PCR扩增条件优选为PCR扩增反应采用20μ 1体系，其组分及终浓度
10倍PCR缓冲液脱氧核糖核酸(dNTP) 引物1 引物2
DNA聚合酶提取的DNA溶液重蒸水加至
1.00~5.00μ1 1.00~2.30μ1 0.30~0.70μ1 0.30 0.70μ1 0.10~0.50μ1 0.30 0.70μ110倍缓冲液2.00μ1
脱氧核糖核酸(dNTP)1.60μ1
引物 10.50μ1
引物 20.50μ1
DNA聚合酶0.20μ1 提取的DNA溶液 0.50μ1
重蒸水14.7μ1反应程序94°C 4分钟后，94 V 45秒，58 V 30秒，72 °C 1分30秒，30个循环后，再反应72°C 7分钟。扩增结果用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。本发明提供了短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜的基因序列及鉴别方法。该种白土苓DNA分子鉴别方法具有高度的准确性，在近年来，DNA测序成本不断降低，利用测序方法进行鉴别已成为一种趋势。本发明所提供的方法为白土苓的鉴别提供了快速、实用的方法。下述实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。实验例1对采摘不同地点的如下表的9种菝葜样品(均通过专家鉴定)首先按照实施例1的方法提取基因组DNA和PCR扩增反应后，扩增结果用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。 PCR扩增产物直接送基因公司(如擎科生物技术公司)测序。得到测序结果先用Contig Express (Informax2000)序列比对软件校序，再用BioEdit序列编辑软件对序列进行编辑， 寻找种间变异位点，序列分析结果(见序列表)所示表中的9种菝葜样品共有14个变异位点，其中编号为1和2号的DNA序列在190bp的C/A替代并在366_402bp37个碱基插入/缺失，证明该两种编号为短柱肖菝葜；编号3-9的样品第 2-302bp的40个碱基和342_350bp 的9个碱基的插入/缺失，证明编号3-9是华肖菝葜和肖菝葜。其余位点是种内或种内种间同时存在的变异位点。表1 用于测定的9种来源不同的菝葜样品
权利要求
1.一种短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜的DNA分子鉴别方法，其特征在于通过如下步骤实现(1)总DNA的提取取待测短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜植物叶片，提取获得总DNA；(2)PCR扩增选取叶绿体DNA基因间序列引物引物 1 :Forward-Primer :5，-TTGAGCTCCATCTACAAATGG-3，引物 2 =Reverse-Primer :5’ -CCCTTATCTAGCTAAAGGATT-3’进行PCR扩增，扩增结果用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测；(3)总DNA的序列测定PCR扩增产物直接测序；G) DNA序列分析及植物鉴别测序结果先用Contig Express序列比对软件校序，再用 BioEdit序列编辑软件对序列进行编辑，寻找种间变异位点，结果为其中190bp的C/A替代和366-402bp37个碱基插入/缺失是短柱肖菝葜的鉴别特征位点；262_302bp40个碱基和342-350bp9个碱基的插入/缺失是华肖菝葜和肖菝葜的鉴别特征位点。
2.如权利要求1所述的DNA分子鉴别方法，其特征在于其中(1)所述的总DNA的提取的具体步骤为(1)用研磨仪将用硅胶干燥的叶片在2ml离心管中研磨至粉末状；(2)加入900μ 1预热的2XCTAB提取液和6μ 1β-巯基乙醇，60°C _70°C水浴温浴 1. 5-2小时；(3)将温浴的材料冷却至室温，加入等体积的M 1的氯仿-异戊醇混合溶液，摇勻 5-10分钟，然后离心5-10分钟，取上清液；(4)将上清液转移到一新的2ml离心管中，再加入等体积的M 1的氯仿-异戊醇混合溶液，摇勻5-10分钟，然后离心5-10分钟，取上清液；(5)将上清液转移到一新的1.5ml离心管中，加入相当上清液体积70%的异丙醇，沉降 DNA，颠倒离心管2-3次，可见白色絮状沉淀，-20°C冰箱中静置30分钟，离心5_10分钟，弃上清液，得固体沉淀；(6)固体沉淀用500μ 1 75%乙醇和无水乙醇各洗1次，离心20-30s后弃上清，然后将离心管吹干使乙醇完全挥发，得到短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜植物的总DNA;将上述的总DNA干燥后加入0. 1 XTE缓冲液100 μ 1和1_2 μ 1的RNase于室温下消化RNAl 1_13小时，混勻后用0. 5-1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测；其中O) PCR扩增条件为PCR扩增反应采用20 μ 1体系，其组分及终浓度10倍PCR缓冲液1.00 5·00μ1脱氧核糖核酸(dNTP)1.00 2.30μ1引物10.30~0.70μ1引物20.30 0.70μ1DNA聚合酶0.10~0.50μ1提取的DNA溶液0.30~0.70μ1重蒸水加至20μ1反应程序在92°C -96°C下反应2-6分钟后，在92°C -96。C反应30秒-45秒，55°C -60 V 25秒_；35秒，700C -740C 1.分钟_2分钟，28-32个循环后，再在70°C _74°C下反应5分钟-10 分钟。扩增结果用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，均出现清楚的扩增条带。
3.如权利要求1或2所述的DNA分子鉴别方法，其特征在于其中Q)PCR扩增条件为PCR扩增反应采用20 Pl体系，其组分及终浓度10倍缓冲液2.00μ1 脱氧核糖核酸1.60μ1 引物10.50μ1 引物20.50μ1 DNA聚合酶0.20μ1 提取的DNA溶液0.50μ1 重蒸水14.7μ1反应程序94°C 4分钟后，94°C 45秒，58°C 30秒，72°C 1分30秒，30个循环后，再反应 720C 7分钟；扩增结果用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
4.如权利要求1或2所述的DNA分子鉴别方法，其特征在于其中(1)所述的总DNA的 提取的具体步骤为取待测短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜植物叶片，(1)用研磨仪将用硅胶干燥的叶片在2ml的离心管中研磨至粉末状；(2)加入900u 1预热的2 X CTAB提取液，65°C水浴温浴1. 5小时；(3)将温浴的材料冷却至室温，加入等体积的M 1的氯仿-异戊醇混合溶液，摇勻5 分钟，然后离心5分钟，取上清液；(4)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，再加入等体积的M 1氯仿-异戊醇，摇勻 5分钟，然后离心5分钟，取上清液；(5)将上清液转移到一新的1.5ml离心管中，加入相当上清液体积70%的异丙醇，沉降 DNA，颠倒离心管2-3次，白色絮状沉淀，-20°C冰箱中静置30分钟，离心5分钟，弃上清液， 得固体沉淀；(6)固体沉淀用200ill 70%的乙醇和200 ill无水乙醇各洗1次，离心30s后弃上清， 然后将离心管吹干使乙醇完全挥发，得到短柱肖菝葜、华肖菝葜和肖菝葜植物的总DNA ；(7)将上述的总DNA干燥后加入0.1 X TE缓冲液和1_2 u 1 RNase核糖核酸酶于室温下 消化RNA过夜，混勻后用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
全文摘要
一种白土苓基原植物DNA分子鉴别方法。本发明公开一种白土苓DNA分子鉴别方法，特别是白土苓中短柱肖菝葜、华菝葜和肖菝葜中DNA分子鉴别方法。本发明是通过总DNA的提取、PCR扩增、总DNA的序列测定、DNA序列分析及植物鉴别而实现的，其中190bp的C/A替代和366-402bp37个碱基插入/缺失是短柱肖菝葜的鉴别特征位点；262-302bp40个碱基和342-350bp9个碱基的插入/缺失是华肖菝葜和肖菝葜的鉴别特征位点。本发明白土苓DNA分子鉴别方法具有高度的准确性，为白土苓的鉴别提供了快速、实用的方法。
文档编号C12Q1/68GK102337330SQ201110200358
公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者仰振球, 张思巨, 李进冉, 海丽娜, 胡红宇, 范圣此, 袁庆军 申请人:北京振东光明药物研究院有限公司, 山西振东道地药材开发有限公司