专利名称：一个与具有57h前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明公开了一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记，根据具有57H前体聚增的低谷蛋白水稻地方品种冷水糯的WopJ基因的突变位点，设计了用于特异检测具有57H前体聚增的低谷蛋白性状的CAPS标记(DG-2)，可以直接区分杂合和纯合基因型。在育种和资源创新过程中，可以直接利用DG-2选择自己所需的基因型， 减少种育种盲目性和田间工作量，属于生物技术领域。背景技术：
近年来，随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变，出现了肾脏病患者和糖尿病肾病患者不断增加的倾向。据最新统计，全球有超过5亿人患肾病，在中国，慢性肾病的患病率约为10%，大约有1.2亿人。上述人群由于肾功能出现障碍，必需进行适当的蛋白摄入限制，不能食用可吸收蛋白含量高的稻米，患者只能进食代用品或改变饮食结构以降低吸收蛋白的摄入量(Mochizukiet al. , 2000) 0因此，培育适应蛋白摄入被限制的肾脏病人需要的谷蛋白含量低的水稻品种已成为一个新的水稻育种目标。水稻是我国第一大粮食作物。作为水稻种子主要贮藏蛋白的谷蛋白(约占胚乳总蛋白的60% 80%)是大米中能为人体消化吸收的主要蛋白成分。水稻谷蛋白以蛋白体的形式贮存于胚乳中(Mimtz K, 1998)。谷蛋白的合成首先合成分子量约为57KD的前体，经过穿膜、剪切和酶解等一系列目前还不甚清楚的复杂过程最终形成成熟谷蛋白，包括37 39KD的酸性亚基(具酸性等电点)和22 23KD的碱性亚基(具碱性等电点)(牛洪斌等，2007;Qu LQ et al.)。低谷蛋白水稻包括两种类型，一类是以水稻品种LGC-I为代表的无57KD前体聚增类型，另外一类是具有57KD前体聚增(57H)伴有成熟亚基减少的类型(Kusaba et al. , 2003 ； Fukuoka et al. , 1996； Kumamaru et al.,1988； Satoh et al., 1994; Satoh et al., 1995;江绍玫等，2003)。水稻谷蛋白基因属于多基因家族，到目前为止，至少已克隆到10个谷蛋白基因。根据这些基因序列的相似性可将其分为GluA和 GluB两个亚家族，亚族内基因间碱基相似性达到80%以上，亚族间同源性在60%左右。日本在第一类水稻低谷蛋白的理论及应用方面的研究处于世界领先。日本科学家通过化学诱变结合全蛋白SDS-PAGE电泳筛选，获得了低谷蛋白突变体材料NM67。 它与原始亲本“日本优”回交，获得改良农艺性状的LGC-1，并对该品种低谷蛋白性状的突变机理进行研究，明确该性状是由于功能基因GluB4和GluB5之间缺失一段染色体片段。 LGC-I作为肾脏病、糖尿病人专用的水稻品种于1994年起试种，次年应用于临床，效果显著。该品种受到日本各大医院以及肾脏病和糖尿病患者的普遍欢迎，并获日本育种学会奖。利用NM67还育成了 Mikai 231 (西海231)等低谷蛋白品种。万建民等用LGC-I与日本主栽水稻品种越光杂交、回交，在国内首次也是唯一成功育成了含有低谷蛋白基因的水稻新品种W3660。对于第二类水稻低谷蛋白的研究还处于理论研究及资源的筛选和创造方面。 Kumamaru等从MNU诱导的突变株系材料中，筛选到了 6个57H突变体，其中有3个57H突变体分别受互不等位的单基因位点M/^ ,glupl和WopJ 的控制。除了诱变材料之外，在天然材料中同样发现了不少57H突变体。Satoh等从来自俄罗斯、中国北部和朝鲜的1400 个材料中发现了 19个57H天然突变株系，经SDS-PAGE电泳显示，其57kDa条带量增加而成熟亚基量减少。江绍玫等从来自中国云南、贵州等16个地区的160余份资源中筛选得到57H突变体材料W379。理论研究方面，至少有8个控制57H表型的基因被报道，包括 esp2,glupl {esp5) ,glup2 (esp6) ,glup3 {esp7) ,glup4 {esp8) ’glup5,glup6 禾口其中 WopJ的主要功能是裂解谷蛋白的前聚体为两类成熟亚基(Kumamaru et al.,2007; Wang et al.，2009)。三、发明内容技术问题
本发明的目的是为了加速已经筛选出的具有57H前体聚增低谷蛋白水稻地方资源在育种中的有效利用，设计与低谷蛋白性状连锁的分子标记，通过检测分子标记，可以预测杂交后代的低谷蛋白性状，在苗期就可鉴定出低谷蛋白水稻单株，避免了繁琐的谷蛋白含量测定，提高鉴定效率，节约成本。技术方案
一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记方法，其特征在于使用分子标记DG-1，其引物序列为 DG-IF :ACTGTGCTTGTGCTGTGGTC DG-IR GGCTATCGGAGCAGCACTAC
以水稻基因组DNA为模板，该标记如果能扩增出4795bp的条带，则该水稻基因组DNA 中含有与水稻57H蛋白前体裂解有关基因GluP3，该4795bp条带含有与水稻57H蛋白前体裂解有关基因全长。一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记方法，其特征在于使用分子标记DG-2，其标记引物为
DG-2F TGGGGAACATACTGCCCTGGGG DG-2R :AGGCATACCTGTGACACACCGA
以水稻基因组DNA为模板扩增，产物运用TscAI酶进行酶切，来自于具有57H前体聚增的低谷蛋白品种冷水糯的片段为17!3bp的条带，该条带具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白基因部分序列；来自于常规水稻品种的片段被切成105bp和68bp的两条片段。使用所述分子标记DG-2扩增以冷水糯为亲本的后代植株DNA，产物运用TscAI酶进行酶切，如果出现17;3bp、105bp和68bp的三条片段，则该以冷水糯为亲本的后代植株中 WopJ基因为杂合型。有益效果
1.本发明获得与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记。在前期研究中获得一个低谷蛋白隐性突变体冷水糯，该突变体籽粒的谷蛋白具有 57KD前体聚增(57H)伴有成熟亚基减少。由于基因与57H前体裂解相关，本研究对冷水糯的测序、比对后，发现冷水糯的WopJ基因的编码区第拟4个碱基由G突变为 A(图1)，导致翻译产物第275个氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺。根据突变位点两侧的序列设计了 CAPS标记DG-2，该标记能扩增出173bp的条带，运用TscAI酶对该片段进行酶切，来自于冷水糯的片段不能被该酶切开，来自于9311的片段可被切成105bp和68bp的两条片段，而来自于9311/冷水糯的杂交1代PCR产物经酶切后，出现双亲的带型(图2)。该标记对9311/冷水糯的高代品系(F7代)的100个家系进行鉴定，结合SDS-PAGE蛋白电泳结果， 证实该标记可以准确地区分具有57H前体聚增的低谷蛋白水稻材料(图3)，同时，该标记可以区分^Aza 基因的杂合型，可以用于分子标记辅助选择育种。2、鉴定方便、准确，节约成本，提高选择鉴定效率。在传统的低谷蛋白性状选育中，首先要将具有低谷蛋白性状基因的亲本与优良的栽培品种进行杂交，在分离世代中选择大量的农艺性状优良的单株，进行单株籽粒谷蛋白含量测定，工作量大，繁琐。而运用该标记检测，仅需提取单株DNA，PCR扩增，酶切后就知道结果，并知道单株的杂合性。通过标记检测可以淘汰不具有低谷蛋白性状的单株，将工作量减少到最低限度，并且在整个生育期均可鉴定，可以选择较为清闲时进行这项工作，避免工作集中。另外，表型鉴定易受环境的影响，有一定的误差，利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对表型的影响。四
图1冷水糯的基因序列与9311的差异
运用DG-1F/1R引物，对来自冷水糯和9311基因组DNA进行扩增，两个水稻品种均能被扩增出一条4795bp的条带。经invitrogen公司(上海)测序，序列用DNAMar比对后发现，冷水糯的基因的第五外显子上第180个碱基(编码区第拟4个碱基)由G突变为 A (图1)，导致翻译产物第275个氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺。图2 DG-2标记及SDS-PAGE对亲本及杂交Fl代检测
在突变位点两侧设计了一对CAPS标记DG-2。用DG-2标记对亲本冷水糯、9311及杂交&代(9311 /冷水糯)的基因组DNA进行检测，结果表明冷水糯的PCR产物经酶切后， 仍然保留17!3bp的条带，即酶不能将这条带切开；而9311的PCR产物经酶切后，出现105bp 和68bp的两条带；杂交F1代的PCR产物经酶切后，出现双亲的带型。SDS-PAGE电泳结果表明，冷水糯为具有57H前体聚增，而成熟谷蛋白亚基减少的类型；9311表现为，谷蛋白亚基正常，没有57H前体聚增；而9311/冷水糯杂交F1代与9311的胚乳带型一致，表明突变体冷水糯的Glnp3基因发生了隐性突变。图3 DG-2标记及SDS-PAGE对9311/冷水糯的高代品系(F7代)检测
用CAPS标记DG-2及SDS-PAGE电泳对9311/冷水糯100个F7代品系分别进行检测， 结果发现不能被TscAI酶切开的均为具有57H前体聚增而成熟谷蛋白亚基减少的低谷蛋白材料，而被TscAI酶切成105bp和68bp的两条带的均为正常谷蛋白材料，表明该标记可用于以冷水糯为亲本的杂交后代辅助选择。五具体实施方式
1、供试材料
2006年，本研究小组运用SDS-PAGE技术，从1000份太湖流域水稻地方品种中筛选出了 2个谷蛋白前体聚增而成熟亚基量减少的突变体细老鼠牙和冷水糯，并对这两个材料的谷蛋白含量进行连续3年测定，结果表明，这两个材料的谷蛋白含量均低于对照品种。低谷蛋白隐性突变体冷水糯(冷水糯参考文献来源王艳平，田孟祥，汤陵华，方先文，王才林， 水稻57H谷蛋白突变体的谷蛋白含量分析，江苏农业科学，2009 (4) 34-35)，该突变体籽粒的谷蛋白具有57KD前体聚增(57H)伴有成熟亚基减少。
2007年配置了低谷蛋白品种冷水糯与大面积推广品种9311 (审定编号国审稻 2001002)的杂交组合，经过南繁和南京正季种植，已经获得了性状基本稳定的高代品系(F7 代)。为了加速低谷蛋白性状在品种改良中运用，根据前人研究报道，认为57H前体聚增与 glup3的裂解谷蛋白的前聚体的功能变化有关，查找已经公布的功能基因的序列，设计引物，通过引物在杂交后代中的验证，筛选与低谷蛋白连锁的标记，并用于低谷蛋白性状的辅助选择。2010年种植亲本、杂交F1代及创新高代品系。供试材料各选取一粒种子，横向切成两半，有胚的半粒种子发芽成苗后用于提取DNA，相应的无胚半粒种子用于提取蛋白。2、引物设计
为了鉴定冷水糯低谷蛋白性状是否由突变引起，本研究首先对冷水糯中基因进行测序分析。从NCBI网站(www. ncbi.nlm. nih. gov)下载所在的BAC克隆 0SJNBa0091D06，用primer premier 3. 0在ORF两侧设计扩增完整ORF特异引物。设计分子标记DG-I，正向引物和反向引物分别为 DG-IF :ACTGTGCTTGTGCTGTGGTC DG-IR :GGCTATCGGAGCAGCACTAC。扩增含57H前体聚增功能基因GluP3的序列带，PCR产物测序，比对后，找出亲本间基因序列的差异。为了进一步验证冷水糯低谷蛋白蛋白性状是否由GluP3突变引起，用primer premier 3. 0在突变位点两侧设计了一对CAPS引物，对突变位点进行鉴定。序列为
DG-2F TGGGGAACATACTGCCCTGGGG DG-2R :AGGCATACCTGTGACACACCGA。3、DNA 提取
待水稻苗高约6-8cm时，取整苗提取基因组DNA，提取方法采用CTAB法。4、PCR扩增和电泳
Glup3 ORF 用 Takara 的 I^rimeSTAR HS DNA Polymerase 扩增，反应体系如下DNA 5μ L,5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μ L, dNTP Mixture (各 2. 5 mM) 4μ L, DG-IF (10 μ Μ) 1 μ L，DG-IR (10 μ Μ) 1 μ L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μ L) 0. 5 μ L, ddH20 28. 5 μ L0 在 Biometra PCR 仪上进行扩增，反应条件为98 °C 15 S, 68 oC 7 min，共30个循环。PCR产物1%琼脂糖电泳后，用GELRED染色后，用凝胶成像系统拍照。突变位点检测采用10 μ L的反应体系包括BU-Taq 2 X Master PCR Mix 5μ L， Primer (4pmol/L) 2. 0 μ L,模板 DNA2 μ L, ddH20 1 μ L。在 Biometra PCR 仪上进行扩增， 反应条件为:(1)95。c 预变性!Brnin ;(2)94 oC 30S ；55 oC 30S ；72 oC 60S ；共 35 个循环；(3) 72°G再延伸lOmin。PCR产物洲琼脂糖电泳后，用GELRED染色后，用凝胶成像系统拍照。3. 2. 4 PCR产物的酶切
PCR产物用Fermentas公司的TscAI醇切。醇切体系如下PCR reaction mixture 10 μ L，ddH20 10 μ L，10X Buffer Tango 2 μ L，TscAI 2yL。用涡旋震荡器轻轻混勻后， 65 °C酶切6 h后，用聚丙烯酰胺凝胶检测。5、胚乳蛋白提取及SDS-PAGE电泳
按照江绍玫等的方法，略作修改，将半粒糙米用碾钵碾成极细的粉末，准确称取0. Olg米粉，转入一干净的1.5mL eppendorf管，加入25 μ L β -巯基乙醇浸润20min，然后加入 475 μ L 温育的蛋白抽提液(4mol/L 尿素，2%SDS，20% 甘油，100mmol/L Tris-HCl，pH=6. 8)， 充分涡旋数秒钟，室温静置过夜。电泳上样前离心101^11(1000011)111)，取1(^1^上清进行 SDS-PAGE (分离胶15%，浓缩胶7. 5 %)。电泳后用考马斯亮蓝R-250 (CBB-R250)染色。6、结果
使用分子标记DG-1，扩增出含57H前体聚增功能基因GluP3序列的4795bp条带，该 4795bp条带含有与水稻57H蛋白前体裂解有关基因全长。由于基因与57H前体裂解相关，本发明研究对冷水糯的glup3测序、比对后，发现冷水糯的gluP3基因的编码区第拟4个碱基由G突变为A(图1)，导致翻译产物第275个氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺。根据突变位点两侧的序列设计了 CAPS标记DG-2，该标记能扩增出173bp的条带， 运用TscAI酶对该片段进行酶切，来自于冷水糯的片段不能被该酶切开，来自于9311的片段可被切成105bp和68bp的两条片段，而来自于9311/冷水糯的杂交1代PCR产物经酶切后，出现双亲的带型为173bp、105bp和68bp (图2)。使用该标记对9311/冷水糯的高代品系(F7代)的100个家系进行鉴定，结果发现具有57H前体聚增而成熟谷蛋白亚基减少的低谷蛋白后代个体不能被TscAI酶切开，而表型正常的个体可被切成105bp和68bp的两条片段，F1杂合植株表现出173bp、105bp和 68bp三条片段。以上结果证实该标记可以准确地区分具有57H前体聚增的低谷蛋白水稻材料(图3)，同时，该标记可以区分^Aza 基因的杂合型，可以用于分子标记辅助选择育种。
权利要求
1.一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记方法，其特征在于 使用分子标记DG-1，其引物序列为DG-IF :ACTGTGCTTGTGCTGTGGTCDG-IR GGCTATCGGAGCAGCACTAC以水稻基因组DNA为模板，该标记如果能扩增出4795bp的条带，则该水稻基因组DNA 中含有与水稻57H蛋白前体裂解有关基因GluP3，该4795bp条带含有与水稻57H蛋白前体裂解有关基因全长。
2.一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记方法，其特征在于 使用分子标记DG-2，其标记引物为DG-2F TGGGGAACATACTGCCCTGGGGDG-2R :AGGCATACCTGTGACACACCGA以水稻基因组DNA为模板扩增，产物运用TscAI酶进行酶切，来自于具有57H前体聚增的低谷蛋白品种冷水糯的片段为17!3bp的条带，该条带具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白基因部分序列；来自于常规水稻品种的片段被切成105bp和68bp的两条片段。
3.根据权利要求2所述方法，一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记方法，其特征在于使用权利要求2所述分子标记DG-2扩增以冷水糯为亲本的后代植株DNA，产物运用TscAI酶进行酶切，如果出现17;3bp、105bp和68bp的三条片段，则该以冷水糯为亲本的后代植株中gA/A 基因为杂合型。
全文摘要
一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记，属于作物育种学领域。前期研究中获得一个具有57H前体聚增的低谷蛋白隐性突变体冷水糯，根据突变位点两侧的序列设计了CAPS标记DG-2，通过检测两个亲本、杂交F1代及性状稳定的高代品系，结合SDS-PAGE蛋白电泳结果，证实该标记可以准确地区分具有57H前体聚增的低谷蛋白水稻材料，同时，该标记可以区分突变基因的杂合型，可以用于分子标记辅助选择育种。这项发明对于筛选和培育低谷蛋白水稻品种，满足特殊人群的需求具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102268481SQ201110210420
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者张所兵, 方先文, 林静, 罗楚平 申请人:江苏省农业科学院