专利名称：一种利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用反义核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法。
背景技术：
MicroRNA (miRNA)是一类约22nt的内源非编码小分子RNA。在真核生物中，miRNA通过与靶mRNA互补配对结合，以抑制基因翻译或剪切mRNA的方式，起到转录后负数调控的作用。对拟南芥、水稻等模式植物的研究显示，植物miRNA不仅调控根系发生、开花时序等多种生长发育过程，而且在氧自由基、干旱、盐分、严寒和无机营养缺失等胁迫响应中也起重要作用。miRNA作为广泛分布的转录后调节因子，已日益成为功能基因组研究中不可缺少的组分，但绝大部分miRNA的功能尚不清楚。目前，在拟南芥中对miRNA进行功能研究的手段主要有两种1)通过靶基因模拟(target mimics)的策略,利用过表达目标miRNA祀基因的类似物，间接实现knockdown目标miRNA的活性；2)通过人工miRNA (artificial miRNA, amiRNA)技术,利用过表达目标miRNA的前体，实现增强miRNA的活性。上述方法均以构建靶基因或miRNA前体的表达载体为前提，并需要利用转基因技术获得稳定遗传的转基因植株或者利用病毒转染进行瞬时表达。反义miRNA 寡核苷酸(Anti-miRNA Oligodeoxyribonucleotide, AMO)是经化学修饰并与miRNA成熟体互补的单链RNA，其通过Waston-Crick碱基配对与细胞内源miRNA特异结合形成杂交分子，通过空间位阻效应抑制特定目标miRNA的功能。未修饰的RNA很容易被细胞内的核酸酶降解而失效，因此AMO —般都经化学修饰以增加其稳定性。常用修饰有 2’ - O-甲基化(2，-Ο-methyl)、2’ -O-甲氧乙基化(2，-O-methoxyethyl, 2’ -Μ0Ε)、锁核酸(Lock nucleotide acid, LNA)等。由于寡核苷酸和细胞膜均带负电荷，因此在没有介导的情况下寡核苷酸不容易直接进入细胞。动物中，通过将AMO显微注射入胚胎或者转染细胞系，可以实现快速抑制miRNA活性。植物具有细胞壁，因此尽管动物中脂质体可以有效帮助寡核苷酸跨膜运输，但在植物中脂质体却不容易穿过细胞壁。由于寡核苷酸跨膜运输的局限性，反义寡核苷酸技术在植物中并未得到广泛应用。有研究表明，对反义寡核苷酸进行肽核(Peptide nucleic acid, PNA)化学修饰后不需要转染或电击就可以直接进入人类或大鼠细胞(Fabani M, Gait MJ (2008)miR-122 targeting with LNA/2’ -0-methyl oligonucleotide mixmers, PNA andPNA-peptide conjugates. RNA 14, 336-346),但其他化学修饰的反义miRNA寡核苷酸可以直接跨植物细胞膜运输的研究尚未见报道。曾有报道利用蔗糖-寡核苷酸溶液将未加修饰的18-mer反义ODN运输进大麦的离体叶片或花序，以抑制目标基因的mRNA表达(Sun C，Hoglund AS, Olsson H, Mangelsen E, Jansson C (2005). Antisenseoligodeoxynucleotide inhibition as a potent strategy in plant biology:identification of SUSIBA2 as a transcriptional activator in plant sugarsignalling. Plant Journal 44:128-38 ;Sun C, Ridderstrale K, Hoglund AS, LarssonLG, Jansson C. (2007) Sweet delivery - sugar translocators as ports of entryfor antisense oligodeoxynucleotides in plant cells. Plant Journal 52:1192-8·)。最近，我们提出通过蔗糖介导AMO快速抑制水稻内源活性，主要是利用蔗糖转运蛋白主动运输AMO进入植物细胞，达到沉默miRNA的效果。但是，蔗糖介导AMO进入拟南芥细胞会造成拟南芥的干旱胁迫，应用受到限制。目前，利用AMO在拟南芥活体内沉默内源miRNA的研究尚未见有其他报道。
发明内容
目前拟南芥miRNA功能研究受限于以人工microRNA或靶基因表达载体构建为基础的技术，存在实验周期长、费时费力。最近，我们提出通过蔗糖介导AMO快速抑制水稻内源活性，主要是利用蔗糖转运蛋白主动运输AMO进入植物细胞(Sun C，Hoglund AS, Olsson H, Mangelsen E, JanssonC (2005). Antisense oligodeoxynucleotide inhibition as a potent strategy inplant biology: identification of SUSIBA2 as a transcriptional activator in plant sugar signalling. Plant Journal 44:128-38 ;Sun C, Ridderstrale K, HoglundAS, Larsson LG, Jansson C. (2007) Sweet delivery - sugar translocators as portsof entry for antisense oligodeoxynucleotides in plant cells. Plant Journal52:1192-8.)，达到沉默miRNA的效果。但是蔗糖溶液的AMO在处理拟南芥时，会造成植株的干旱胁迫，影响植株正常生长，因此应用受到限制。本发明提供了一种利用反义寡核酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，可以很好地解决上述问题。一种利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，是用miRNA反义寡核苷酸的水溶液浸泡拟南芥根系，使miRNA反义寡核苷酸导入植物细胞。具体步骤为一、根据目标miRNA成熟体序列设计并合成反义寡核苷酸；二、利用核苷酸水溶液浸泡拟南芥根系，将核苷酸导入植物细胞，实现在活体内特异地沉默目标miRNA的显著效果；所述的核苷酸为目标miRNA的反义寡核苷酸。其中的反义寡核苷酸是采用2’ -Ο-methyl修饰并与miRNA成熟体序列完全互补的反义寡核苷酸。所用拟南芥植株可以是植物活体的幼苗或成体，寡核苷酸溶液浸泡可采用一次浸泡或者间歇多次浸泡的方式。每次浸泡时间为24小时,使用的寡核苷酸溶液中核苷酸的浓度为2. 5 μ M，若多次浸泡则每两次浸泡之间的间隔期为1-3天，间歇期间拟南芥植株正常培养生长；多次浸泡次数可以为2次或以上。在沉默miR169家族的miRNA，反义寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，对该家族的miRNA都有很好的沉默效果，如ath-miR169h-n(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)和/或ath_miR169c (核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)。本发明经过多次摸索试验发现，采用本发明方案可以在不影响拟南芥正常生长的情况下，将miRNA的反义寡核苷酸转运至植物细胞，实现沉默拟南芥内源miRNA，并获得miRNA功能丢失突变体的显著效果。与现有技术相比，本发明的有益效果如下
I.本发明操作简便快捷，干扰效果显著、稳定持久，避免了现有拟南芥功能研究由于依赖过表达载体构建及遗传转化或病毒转染技术，因而实验周期长、费时费力的缺点；2.通过寡核苷酸的水溶液浸泡拟南芥根系，避免了现有方法利用糖溶液介导寡核苷酸进入植物细胞所可能产生的细胞干旱胁迫，为研究拟南芥miRNA的生物学功能提供了新手段。
图I.是实施例2中以ath-miR169h_n为例，不同反义寡核苷酸溶液对拟南芥内源miRNA 的沉默效力。2.5 μ M anti-ath-miR169h_n 或 anti-mock (对照)与高纯水、5mM 鹿糖、IOmM蔗糖、5mM氯化钠、IOmM氯化钠的五种组合溶液，分别处理拟南芥幼苗24小时后内源ath-miR169h_n的相对表达量。图2是实施例3中以ath-miR169h_n为例，高纯水-反义寡核苷酸对拟南芥内源miRNA沉默作用的持续时效。拟南芥幼苗经2. 5 μ M anti-ath-miR169h_n或anti-mock处理24小时，a)ath-miR169h-n和b) ath_miR169c在处理后不同时间点(O小时，24小时、3天和5天)的相对表达量。 具体实施方
以下结合实施例和附图进一步对本发明进行详细说明，但是具体实施例并不在任何意义上构成对本发明保护范围的限制。实施例I实验材料与方法 I.反义寡核苷酸的设计与合成
从miRbase中获得目标miRNA的成熟体序列，根据序列互补原理设计与成熟体序列完全互补的反义寡核苷酸序列，反义寡核苷酸采用2’ -Ο-methyl修饰。同时利用BLAST软件分析，确定miRNA反义寡核苷酸随机对照序列。miRNA反义寡核苷酸由上海吉玛公司合成。2.植物材料及栽培条件
拟南芥CiraAiiZoASi1S thaliana、的种子用70%乙醇漂洗I分钟,吸净乙醇溶液后,力口入5%次氯酸钠溶液漂洗15分钟，期间不时震荡使种子悬浮，增大种子与溶液接触面积。吸净次氯酸钠溶液，用灭菌水漂洗4次，吸净灭菌水，加入1%琼脂水使种子悬浮。将种子接种至6%MS培养基，每一培养基约接种50粒种子。将培养皿封口后，在25°C下培养7天。3. miRNA 沉默
选取健康的生长状况一致的培养7天的拟南芥，小心将其从培养基内连根轻轻取出后用水清洗干净。将整株植物放入反义寡核苷酸溶液，根部完全浸泡至溶液中，处理24小时。每种处理进行三个生物学重复，处理后的样品经超纯水漂洗用于后续的RNA提取。4.总 RNA 提取
(I)用1%。的DEPC溶液浸泡需要使用的离心管、钢珠过夜，然后包装，并于121°C高压蒸汽灭菌50分钟。所有使用的去离子水均为经过高压灭菌的1%。DEPC水。(2)在1.5ml的离心管内加入一粒钢珠，以及200 μ I的TrizolReagent (Invitrogen 公司)。(3)在上述管子中加入新鲜组织样品，然后用TissueLyser II (QIAGEN)仪震荡粉碎，Frequancy 29. 9, time 2min。粉碎后的样品从 TissueLyser II (QIAGEN)仪上取出后马上用离心机高速甩去气泡，然后立即加入50 μ I的Trizol Reagent (Invitrogen),混匀后冰上静置10分钟。
(4)短暂离心后将上清转移到一新管，加入约50 μ I氯仿，剧烈震荡混匀30秒。4°C下，IOOOOrpm 离心 15min。(5)小心吸出上层清夜移至新管，再加500 μ I无水乙醇，_20°C沉淀过夜。(6) 4°C, IOOOOrpm 离心 IOmin,弃上清。(7)加入 500μ1 75% 的乙醇，混勻，4°C，7500rpm 离心 5min。(8)吸去乙醇，将沉淀室温晾至半干。加入22 μ I DEPC水溶解沉淀，取I μ I电泳检测，Ιμ 用Thermo NanoDrop 2000测浓度，其余样品_80°C保存。
5. miRNA的荧光实时定量PCR检测
miRNA的荧光实时定量PCR采用文献(Varkonyi-Gasic E, Wu R, Wood M, Walton EF,Hellens RP (2007) Protocol a highly sensitive RT-PCR method for detection andquantification of microRNAs. Plant Methods 3:12.)的 UPL 探针方法。首先，根据成熟体序列设计 miRNA 特异的 Stem-loop RT-PCR 引物(Chen C，Ridzon DA, Broomer AJ,Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ,Livak KJ, Guegler KJ (2005) Real-time quantification of microRNAs by stem-loopRT-PCR. Nucleotide Acids Research 33:el79.),利用 TaqMan MicroRNA ReverseTranscription Kit (AB),在7. 5 μ I体系中加入200ng总RNA进行反转录,反应程序为160C 30min, 42°C 30min, 85°C 5min, 4°C 20min。然后，取 I μ I 反转录产物作为模板，在含Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen公司)的10 μ I反应体系中加入O. I μ I浓度为 10 μ M 的 Universal PorbeLibrary Probe #21 (Roche)探针,进行 miRNA 突光实时定量PCR0 使用仪器为 Roche LightCycler480，反应程序为94°C IOmin; (94°C 15sec, 60°Clmin) 45个循环,60°C收集信号。运行结束后利用LightCycler480 Softwarel. 5分析数据。每种样品进行三个生物学重复，以5. 8s rRNA作为内参基因，miRNA的相对表达水平采用厂计算。6. mRNA的荧光实时定量PCR检测
总RNA用TURBO DNA-free kit (Ambion)处理去除残留的DNA。反转录反应参照SuperScript III First-Stand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen 公司)提供的说明书操作。实时定量参照Platinum SYBR Green qPCR SuperMix (Invitrogen公司)提供的说明书操作。反应程序94°C 2min, 94°C 15sec, 60°C 20sec, 72°C 20sec。45 个循环，72 °C收集信号，使用仪器为Roche LightCycler480。每种样品进行三个生物学重复及两次技术重复，以Actin作为内参基因，mRNA的相对表达水平采用2_-ΛΛετ计算。实施例2高纯水-反义寡核苷酸对拟南芥内源miRNA的沉默效力
如实施例1，其中步骤3的反义寡核苷酸溶液，分别为2. 5μΜ anti-ath-miR169h-n(SEQ ID N0:1 :5’-CAGGCAAGUCAUCCUUGGCUA-3’)与高纯水、蔗糖溶液(5mM、10mM)、氯化钠溶液(5mM、IOmM)的五种组合溶液。anti-ath-miR169h_n 用来沉默 ath-miR169h_n (SEQID N0:3:5’-UAGCCAAGGAUGACUUGCCUG-3’)。对照组采用 anti-mock (SEQ ID N0:2:5’_GGCGCCCUAGGUAGGACAACC -3’ )处理，处理条件同上。处理结果见附图I。图I表明在2. 5 μ M反义寡核苷酸浓度时，高纯水-反义寡核苷酸溶液处理组ath-miR169h-n的表达量下降到对照组的约1%左右；在5mM浓度组合下NaCl-反义寡核苷酸溶液处理组ath-miR169h-n的表达量下降到对照组的22%左右；而蔗糖一反义寡核苷酸溶液处理组ath-miR169h-n的表达量下降到对照组的23%左右；而在IOmM浓度组合下，NaCl-反义寡核苷酸溶液处理组ath-miR169h_n的表达量下降到对照组的11%左右；而蔗糖一反义寡核苷酸溶液处理组ath-miR169h-n的表达量下降到对照组的2%左右。由此可见，高纯水-反义寡核苷酸溶液处理组对目标miRNA的沉默效果优于NaCl-反义寡核苷酸溶液处理组和蔗糖一反义寡核苷酸溶液处理组，且miRNA沉默效果非常显著(Student，s t-test, /*〈0.001)。实施例3高纯水-反义寡核苷酸对拟南芥内源miRNA沉默作用的持续时效
如实施例I，但步骤3中的拟南芥幼苗经2. 5 μ M anti-ath-miR169h_n或anti-mock处理，分别在O小时，24小时、3天和5天收集材料提取RNA。其他步骤与实施例I相同。实验结果见图2。如图2a所示,拟南芥幼苗经anti-ath-miR169h_n处理完毕后ath-miR169h-n的瞬时表达下降至对照组的1%，处理完毕后24小时，ath-miR169h_n的表 达量为对照组的40%左右，ath-miR169h-n的表达量随时间逐步回升,在第三天时可恢复至对照组的60%,至第五天则已经回升至对照组的80%。如图2b所示，与ath-miR169h_n同家族的 ath-miR169c (SEQ ID NO:4 :5’-CAGCCAAGGAUGACUUGCCGG-3’)的表达量变化与ath-miR169h_n 基本一致,经 anti-ath-miR169h_n 处理完毕后，ath_miR169c 的瞬时表达量降至对照组的1%，ath-miR169c的表达量在处理完毕后24小时回升至对照组的50%左右，随后至第三天ath-miR169c的表达量恢复至对照组的约60%,至第五天则已经回升至对照组的80%。以上结果说明反义寡核苷酸的水溶液处理可以有效地在拟南芥幼苗活体内抑制内源miRNA的活性，其抑制效应对同一 miRNA基因家族的成员均有效，而且作用时间可以持续至少3天。
权利要求
1.一种利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于是用miRNA反义寡核苷酸的水溶液浸泡拟南芥根系，使miRNA反义寡核苷酸导入植物细胞。
2.根据权利要求I所述利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于所述拟南芥为植物活体的幼苗或成体。
3.根据权利要求I所述利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于所述浸泡为一次性浸泡或间隔多次浸泡，每次浸泡时间为24小时，每两次浸泡之间的间隔时间为1-3天，间隔期间拟南芥植株正常培养生长。
4.根据权利要求I所述利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于所述miRNA反义寡核苷酸的水溶液中miRNA反义寡核苷酸的浓度为2. 5 μ M。
5.根据权利要求I所述利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于所述miRNA反义寡核苷酸是采用2’ -O-methyl修饰并与相应的miRNA成熟体序列完全互补的序列。
6.根据权利要求Γ5任意一项所述利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于所述反义寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
7.根据权利要求6所述利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于所述拟南芥内源miRNA为miR169家族的miRNA。
8.根据权利要求7所述利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于所述拟南芥内源 miRNA 为 ath-miR169h_n 和 / 或 ath_miR169c。
9.根据权利要求8所述利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，其特征在于ath-miR169h_n的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所不，ath_miR169c的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。
全文摘要
本发明公开了一种利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法，属于反义寡核苷酸的应用技术领域。本发明的方法是用miRNA反义寡核苷酸的水溶液浸泡拟南芥根系，使miRNA反义寡核苷酸导入植物细胞，从而实现在植物活体中特异性地沉默目标miRNA。该方法具有操作简便快捷，干扰效果显著、稳定持久的优点，避免了现有方法由于依赖转基因技术因而实验周期长、费时费力的缺点；同时也打破了利用糖溶液介导实现反义寡核苷酸跨膜运输的局限性，为拟南芥miRNA功能研究提供了新的技术手段。
文档编号C12N15/87GK102899352SQ201110210230
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者唐恬, 谢睦南, 施苏华, 吴仲义, 张添元 申请人:中山大学