专利名称：一种玉米wrky基因在提高植物耐逆性能上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学和分子遗传学领域，具体的说，涉及一个玉米WRKY转录因子及其编码基因在培育耐逆性植物中的应用。
背景技术：
玉米属禾本科玉米属。全世界玉米播种面积仅次于小麦、水稻而居第三位。玉米不仅是重要的粮食作物，同时也是工业原料和发展畜牧业首选的饲料作物，在国民经济中占有重要的地位。现有品种不能够满足该区域玉米生产的需要，主要表现在推广后品种的抗逆性逐年减弱。因此发掘和创建抗逆性强，高产，优质专用型玉米新种质和选育新品种巳成为实现玉米生产持续发展的关键所在。转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，对所控制的基因起转录激活或抑制作用。典型的植物转录因子具有DNA结合域、转录调控域、寡聚化位点和核定位信号。转录因子广泛参与生物的多种生命活动，因而转录因子也具有显著的多样性，它们在高等植物的生长、发育和形态建成，以及生物和非生物胁迫等环境反应中起着重要的调控作用。WRKY转录因子家族就是众多植物转录因子家族中的一类，主要存在于高等植物中，在一些低等生物中包括低等藻类及原生动物中也有少量发现。它含有一个或两个保守 WRKY结构域，WRKY结构域含有大约60个氨基酸残基即在WRKYGQK七个氨基酸残基核心序列之后接一个锌指结构。WRKY域能特异的与靶基因启动子区的W-box结合来调控靶基因的表达。目前通过对拟南芥、水稻等植物中对WRKY家族成员的功能分析，我们发现WRKY家族成员功能广泛，WRKY家族成员基因不仅多种生物逆境因子包括病毒、细菌、真菌等的诱导和调控植物生长发育、形态建成和代谢调控及其信号传导，还受多种非生物逆境因子如低温、高温、干旱、高盐、光(辐射)、高湿、以及损伤等诱导参与非生物胁迫反应。但到目前为止，玉米中的WRKY家族基因的研究还很少，没有直接的数据和实验证据证明相关的功能。 所以克隆玉米WRKY家族成员基因，通过构建过量表达载体得到转基因植株，看其对胁迫条件是否有反应，所研究的基因是否能够有效地改善植物对外界胁迫的能力。
发明内容
本发明的目的是对玉米WRKY家族成员进行功能研究，从而获得与耐逆性相关的玉米WRKY转录因子及其基因，以用于提高植物的耐逆性能。本发明利用MAUEGEN0ME和NCBI数据库中的基因序列，对玉米WRKY家族成员进行细致的比较和分析，筛选、克隆了一个基因為MXTJJ，并证明它具有增强水稻耐逆性的功能。本发明的具体技术方案如下
一种玉米/ 了基因在提高植物耐逆性能上的应用，所述腸《了基因编码下述蛋白质氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :1。将所述ZfMT基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐逆性提高的转基因植株。所述/ 了基因为下述核苷酸序列之一序列表中SEQ ID NO :2或3的DNA序列； 或者为与SEQ ID NO :2或3序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。所述MXT基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。所述植物为双子叶植物或单子叶植物。本发明提供了一种玉米/ 了基因在提高植物耐逆性能上的应用。实验证明，实施发明的基因转化水稻可提高水稻对干旱、高盐和低温逆境胁迫的耐受性，且对水稻正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明中玉米WRKY33转录因子基因的过表达转基因株系的Tl代植株耐逆性实验表明，在逆境下转基因存活率基本在60%以上，说明玉米WRKY33基因可显著提高转基因株系对低温、高盐和干旱胁迫的抗性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关形状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
图1为ZmWRKY的亚细胞定位照片。A禾Π B为PRTL2-mGFP载体瞬时表达照片，C和D为PRTL2- ZmffRKY-mGFP载体瞬时表达照片。A和C为无激发光照射下的洋葱细胞，B和D为445-490nm激发光源照射下的洋葱细胞。图2为经干旱胁迫的ZmWRKY Tl转基因植株与野生型植株照片。图3为经盐溶液胁迫的ZmWRKY Tl转基因植株与野生型植株照片。图4为经低温胁迫的ZmWRKY Tl转基因植株与野生型植株照片。图2、3、4中A为各胁迫处理前苗生长状态的照片，B为各胁迫处理后恢复正常生长前苗生长状态的照片，C恢复正常生长7天后苗生长状态的照片，D为统计各转基因株系与对照野生型植株经胁迫处理后的存活率。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由hvitrogen公司进行，PCR试剂盒、连接试剂盒和载体构建过程中的核酸内切酶均购自于自宝生物工程有限公司，反转录试剂盒购于Promega公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司，方法均参照说明书进行。一、玉米WRKY家族基因ZmWRKY33的获得
检索MAIZEGEN0ME和NCBI数据库，获得ZmWRKY33的推测编码序列，设计扩增编码序列的引物，上游加NcoI (CCATGG)酶切位点，下游加Bst EII (GGTGACC)酶切位点。引物序列如下
引物 1 (上游引物)5’ -TGCTAACAATGAGGTATTAC -3， 引物 2 (下游引物):5，- TTACCTCGGGTGGGGATTC -3，
4提取三叶期经干旱处理的玉米B73自交系的总RNA，通过反转录得到cDNA，RT-PCR 方法，以上面的引物扩增得到全长基因，基因大小为924bp，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。具体反应为取 IPg (2μ1)的总 RNA，加入 4μ1 Mgclj25mM)，2Pl Reverse Transcription IOX Buffer, 2M-I dNTP Mixture (IOmM), 0. 5M-1 Ribonuclease inhibitor (lu/μ ), μ Oligo (dT)15 Primer (0., μ MMLV Reverse Transcriptase (15u/ μ ), 7. 5μ1 Nuclease-Free Water,小心混勻，42°C温浴 40min，然后 95°C加热 5min，冰上放置5min，即获得相应的反转录产物cDNA。将得到的cDNA稀释10倍，取2μ1作为PCR反应的模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增。反应体系为上下游引物(IOmM)各 μ , LA Taq 酶(5ιι/μ1) 0· 5μ1，dNTP (IOmM) μ ，2 X GC bufferI 25μ1, ddH20 19·5μ1。 PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，55°C退火40s，72°C延伸lmin30s，35个循环，最后72°C 10 min0反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化94^p的目的片段，将其克隆到载体PMD18-T Vector (宝生物公司)，再转化到TranS5 α 化学感受态细胞(全式金生物技术有限公司)中，PCR筛选阳性克隆，进行测序，测序结果表明Z丽RIW33具有序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列，序列表中的SEQ ID NO 2由924bp 个碱基组成，将含有ZmWRKY33 DNA序列的重组质粒载体命名为pMD18- ZmWRKY33。测序结果表明获得了序列正确的ZmWRKY33基因。二、ZmWRKY33的亚细胞定位
用 5' - CGGAGATCTATGAGGTATTACATTTATG-3‘和 5' -TTCTCTAGATTACCTCGGGTG GGGATTC-3，为引物，以pMD18- ZmWRKY33质粒为模板，扩增ZmWRKY33的完整编码序列，用BglIIJbaI双酶切后插入到相同酶切的PRTL2-mGFP上的GFP下游，将测序验证正确的重组载体命名为PRTL2- ZmWRKY33-mGFP。PRTL2- ZmWRKY33_mGFP 用于洋 MXAllium cepa)表皮的基因枪转化，以 PRTL2-mGFP作对照。具体步骤如下所述
1)质粒的准备用试剂盒提取纯化PRTL2- Z丽RKY33-mGFP和PRTL2_mGFP (对照)质粒，浓度为lmg/ml,溶于H20。2)洋葱的准备将洋葱切成西瓜片状，选择内层较为平整的茎片，用镊子剥取内表皮细胞层，翻转，光面向下，平铺在MS (100mg/L Amp)平板上，待用。3)钨粉悬浮液制备称取60mg金粉(直径1. Oum)于1. 5mL离心管；加Iml无水乙醇，震荡1-2分钟，IOOOOrpm离心几秒钟；弃上清，重复一次；用Iml无菌水悬浮，震荡1_2 分钟，IOOOOrpm离心几秒钟；弃上清，重复一次；用Iml无菌水悬浮，震荡1_2分钟，先用或储存于_20°C待用。4)钨粉与DNA的包埋取均勻的钨粉悬浮液50ul，加入质粒12ul (lmg/ml)，并混勻；加20ul 0. IM亚精胺，混勻；轻轻地一滴一滴地加入50ul 2. 5M CaCl2，
并不时轻轻摇晃；震荡器上温和震荡几分钟后，室温放置10分钟，IOOOOrpm，离心10 秒，弃上清，无水乙醇漂洗3次；再将颗粒再将颗粒悬浮于30-15ul无水乙醇中，用枪吸打混勻。5)轰击受体材料取IOul悬浮均勻的钨粉置于micro carrier上。待micro carrier上的颗粒干后，可装载基因枪的载盘上，注意DNA面向下，以便发射于铺有洋葱表皮的MS平板上(可裂膜1100-1300Pa)。利用Biorad公司的PDS-1000基因枪将附有质粒 DNA的钨粉轰击进入洋葱表皮。轰击操作将钢瓶上阀门打开，调整压力表前黑色旋钮至适当压力(至少较所需压力高200psi)(—般打洋葱表皮选用llOOpsi，所以钢瓶压力选择 1500psi左右)。放置仪器的超净台提前开紫外消毒。用75%的酒精擦拭chamber四壁及其内物件。Micro carrier、可裂膜、钢丝网提前泡在75%的酒精中消毒。用前，置于干净无菌的平皿中吹干。组装将钢丝网和可裂膜依次装在chamber顶部的旋钮中，其下层的装置中放入涂有钨粉且已干燥的macro carrier, DNA面向下。打开封盖的平皿放在下层的托盘上。关上壁门。抽真空至所需真空度(一般为沈-28)，轰击。待chamber恢复压力，取出 sample及所有零件。使用完毕后，关上钢瓶阀门，抽真空，轰击至钢瓶上压力表降至零，回复 chamber压力后即可关闭电源。将压力表前黑色旋钮逆时针方向旋松。将plate封好，在白光或所需光线下，22°C培养30-40小时后，在荧光显微镜下观察，将洋葱表皮切成适当大小置于载玻片上先滴一滴水，然后将盖玻片盖好，注意不要有气泡.然后置于荧光显微镜下观察拍照，确定外源融合蛋白在细胞内的位置。结果如图所示，用荧光显微镜在445-490nm激发光源照射下，转GFP空载体的细胞在整个细胞中都发绿色荧光，而转PRTL2- ZmffRKY33-mGFP融合表达质粒的细胞只在细胞核中发绿色荧光。表明ZmWRKY33与GFP载体的融合蛋白定位于细胞核中，证实KT496 蛋白具有核定位信号。图中A和B为PRTL2-mGFP载体瞬时表达照片，C和D为PRTL2-ZmWRKY33-mGFP载体瞬时表达照片。A和C为无激发光照射下的洋葱细胞，B和D为 445-490nm激发光源照射下的洋葱细胞。三、ZmffRKY33转基因水稻的获得
用农杆菌介导法将按具体实施方式
一获得的与耐逆性相关的基因转化水稻，具体方法如下
1)转化农杆菌
将用RT-PCR扩增得到并克隆于PMD18-T载体上的ZmWRKY33片段用NcoI和Bst EII 酶切下来，与用相同酶切PCAMBIA1301的载体连接，构建载体ρ- ZmWRKY33。利用热激法将上述重组载体P- ZmffRKY33转入农杆菌EH105菌株，利用农杆菌对水稻进行共转化。2)侵染水稻愈伤组织
挑取步骤1)获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含卡拉霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mL YEB液体培养基中，在观°C、150rpm下振荡培养2-3天，再于4 °C、 5000rpm离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含0. lmmol/L乙酰丁香酮的AA培养基 (Co (NO3) 2 · 6H20 0. 15mg/L, CaCl2 110mg/L, MgSO4 122mg/L, KI 3. 75mg/L，NaH2PO4 · H2O 150mg/L, Na2-EDTA 0. OlmM, FeSO4 · 7H20 139mg/L, KCl 2. 95g/L, MnSO4 · 4H20 84. 5mg/ L, ZnSO4 · 7H20 6. 25mg/L, H3BO3 5mg/L, Gly 37. 5mg/L, CuSO4 0. 005mg/L, Na2MoO4 · 2H20 1.25mg/L，盐酸硫胺素VB1 5mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇VB6 5mg/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物 0. 3g/L, L-Gln 87. 6mg/L，L-Asp 26. 6mg/L，蔗糖 20g/L)中，在下避光振荡培养1-2小时至0D_=0. 6-0. 9。挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻晚晴的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入上述转化有P- ZmffRKY33的重组农杆菌培养液中摇动 20分钟后，静置30分钟，取出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于N6共培养基 (N6培养基+10g/L葡萄糖+lmg/L乙酰丁香酮+2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 2mg/L)上培养，其中 N6 基本培养基的配方为(NH4)2SO4 0. 46g/L, KNO3 2. 83g/L, CaCl2 0. 2g/L, MgSO4 0. 092g/L, KH2PO4 0. 4g/L, Na2-EDTA 0. 15g/L, FeSO4 · 7H20 0. llg/L, MnSO4 · 4H20 0. 44g/ L, ZnSO4 · 7H20 0. 17g/L, H3BO3 0. 14g/L, CoCl2 · 6H20 0. 0005g/L, CuSO4 · 5H20 0. 0005g/ L，Na2MoO4 · 2H20 0. 005g/L,盐酸硫胺素 VB1 0. Olg/L,烟酸 0. OOlg/L,盐酸吡哆醇 VB6 0.001g/L，肌酸 0. lg/L，酪蛋白水解物 0.3g/L，L-Pro 0. 5g/L，蔗糖 30g/L，琼脂 lOg/L, pH5. 8。2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，然后在含 500mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再用无菌水冲洗1遍，置于无菌滤纸上晾干，最后转入筛选培养基(N6基本培养基+2，4-D 2mg/L+头孢霉素250mg/L)筛选。3)阳性转基因水稻植株的获得
将侵染后的水稻愈伤组织于N6共培养基中共培养3-5天后，转至含50mg/L潮霉素和 400mg/L头孢霉素的N6固体培养基(N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7_8g/L琼脂，pH 5. 8)上筛选3周，再转入含50mg/L潮霉素和200mg/L头孢霉素的N6固体培养基上筛选4周，随后将抗性愈伤组织转入预分化培养基(N6培养基+lmg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸)，光照培养3周，再转入分化培养基(N6培养基+lmg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤)上进行分化，将生长出的再生植株在壮苗培养基(1/2 MS无机盐+0. 5mg/L奈乙酸+0. 25mg/L多效唑)上进行生根培养后移至温室中，在、15小时/天的光照下培养1个月后取植株叶片，用CTAB法提取总 DNA,在正向引物 5，-ACTCACCGCGACGTCTGT-3，和反向引物 5，-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3， 的引导下PCR扩增潮霉素磷酸转移酶(Hyg)基因，经扩增获得1009 bp DNA片段的为阳性转基因植株。检测结果表明用上述方法获得了转化有P- ZmWRKY33的转基因水稻。四、ZmWRKY33转基因Tl代植株耐旱性鉴定
收获ZmWRKY33 Tl代转基因水稻种子，选取6个以上株系进行干旱胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻晚晴作对照。 筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3 1的株系进行旱筛。待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，培养至三叶期时(第3片叶完全舒展)，进行急性干旱处理。旱筛前将苗根部洗净，选生长状态(粗细、株高)一致的苗，用吸水纸将根部水吸干，放入干燥的新三角瓶中，每瓶10株，每株系筛选30株苗。每瓶详细记录干旱起始时间， 旱筛过程为12小时(视表型而定)，然后复水，三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。对照晚粳的存活率仅为15%左右，而转Z WRKY33的株系的存活率均在75% 以上。五、ZmWRKY33转基因Tl代植株耐盐性鉴定
筛选前步骤同上。用含有200mM NaCl的Hoagland溶液进行盐筛，约2天，期间隔天更换一次盐溶液。处理2天后，对照晚晴植株出现叶尖发黄泛白，叶片下垂或半卷甚至全卷等状态，洗去盐溶液，恢复正常培养。复水第二天再更换一次营养液，以去除剩余的盐分。三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。&WRKY33转基因水稻T1代阳性转基因株系恢复培养后能够继续生长，存活率达到75%以上，而晚晴粳稻对照(CK)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡，存活率不到20%。六、ZmffRKY33转基因Tl代植株耐冷性鉴定筛选前步骤同上。3°C冷筛，处理5天，当对照新叶、老叶全卷后，重新正常培养，期间三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。转基因株系的存活率均比对照要高，转基因株系能很快恢复生长，存活率都在60%以上，而对照植株的存活率在25%左右。
总之，玉米WRKY33转录因子基因的过表达转基因株系的Tl代植株耐逆性实验表明，在逆境下转基因存活率基本在60%以上，说明玉米ZfMTJJ基因可显著提高转基因株系对低温、高盐和干旱胁迫的抗性。
权利要求
1.一种玉米WRKY了基因在提高植物耐逆性能上的应用，所述腸《了基因编码下述蛋白质 氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将所述ZfMT基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐逆性提高的转基因植株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述ZfMT基因为下述核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO :2或3的DNA序列；或者为与SEQ ID NO :2或3序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于；所述MXT基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一种玉米WRKY基因在提高植物耐逆性能上的应用。该玉米WRKY基因的氨基酸序列为序列表中的SEQIDN01，将序列表中的SEQIDN01的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有植物WRKY转录因子功能。本发明的玉米WRKY转录因子的过表达转基因株系的T1代植株耐逆性实验表明，在逆境下转基因存活率基本在60%以上，说明本发明玉米WRKY基因可显著提高转基因株系对低温、高盐和干旱胁迫的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关形状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/29GK102268443SQ201110208640
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者刘雪, 朱苏文, 江海洋, 江腾, 程备久 申请人:安徽农业大学