指导b2:b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因的制作方法

专利名称：指导b2:b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因的制作方法
指导B2 B1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因本申请是申请日为2003年1月31日、中国申请号为03803741. 6、发明名称为“指导B2 Bl除虫菌素比例的除虫链霉菌基因”的发明申请的分案申请。
1.发明领域本发明涉及主要应用于动物健康领域的除虫菌素(avermectin)，例如 doramectin,的组合物及有效产生除虫菌素的方法。更具体地，本发明涉及含有编码 AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其可用于调节除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)培养物发酵所产生的除虫菌素2类1类的比例。本发明还涉及除虫链霉菌的载体，转化的宿主细胞，和新型突变株，它们的aveC基因已突变从而调节所产生的除虫菌素2类1类的比例。
2.
背景技术：
2. 1.除虫菌素链霉菌可产生各种各样的次级代谢产物，其中包括除虫菌素，其含有一系列八种相关的能产生有效的抗蠕虫和杀昆虫活性的大环内脂类化合物，有16个成员。这八种截然不同但又密切相关的化合物主要指:Ala, Alb, A2a, A2b，Bla, Bib, B2a及B2b。“a”系列化合物指的是天然除虫菌素，其在C25位的取代基为(S)-仲丁基，“b”系列化合物指的是C25 位的取代基为异丙基的那些化合物。代号“A”及“B”指的是C5位取代基分别为甲氧基和羟基的除虫菌素。数字“1”指的是在C22位及C23位为双键的除虫菌素；而数字“2”为C22 位有一个氢原子及在C23位有一个羟基的除虫菌素。在这些相关的除虫菌素中，Bl型的除虫菌素(如doramectin)被公认为具有最有效的抗寄生虫活性和杀虫活性，因而也是最具商业前景的除虫菌素。除虫菌素及其由除虫链霉菌菌株需氧发酵而生产的方法在美国专利4，310，519 及4，429，042中都已有描述。一般认为天然除虫菌素的生物合成可以通过异丁酸及 S-(+)-2-甲基丁酸的辅酶A硫酯类似物来内源启动。经过随机诱变进行菌株改进并联合使用外源提供的脂肪酸可以有效生产除虫菌素类似物。支链2-氧酸脱氢酶缺陷的除虫链霉菌突变体(bkd缺陷突变体)只有在发酵中补充有脂肪酸时才能产生除虫菌素。筛选和分离支链脱氢酶活性缺陷的突变体(如除虫链霉菌，ATCC 53567)在欧洲专利(EP) 276103中已有描述。在有外源提供脂肪酸的情况下发酵这些突变体，导致仅产生四种对应于所用的脂肪酸的除虫菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸补充除虫链霉菌(ATCC 53567)发酵，结果产生天然除虫菌素Ala，A2a，Bla及B2a ；用异丁酸补充发酵，结果产生天然除虫菌素Alb，A2b，Blb及B2b ；而用环戊烷羧酸补充发酵， 结果产生四种新型的环戊基除虫菌素Al，A2，Bl及B2。用其它脂肪酸补充发酵可以产生新的除虫菌素。通过筛选800多种潜在的前体， 已经鉴定出60多种其它新的除虫菌素(例见Dutton等，1991，J. Antibiot. ,44 :357-365 ； 和Banks等，1994，Roy. Soc. Chem. 147 :16-26)。此外，5_0_甲基转移酶活性缺陷的除虫链霉菌突变体基本上只产生B类除虫菌素，因而，同时缺少支链2-氧酸脱氢酶及5-0-甲基转移酶活性的除虫链霉菌突变体对应于补充发酵所用的脂肪酸仅生产出B类除虫菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸补充这类双重突变体发酵，结果仅产生天然除虫菌素Bla及B2a， 而用异丁酸或环戊烷羧酸补充发酵则可以分别产生天然除虫菌素Blb及B2b或新型环戊基Bl及B2除虫菌素。用环己烷羧酸补充该双重突变体菌株是产生商业上重要的新型除虫菌素环己基除虫菌素BKdoramectin)的优选方法。这类双重突变体如除虫链霉菌(ATCC 53692)的分离及特性描述在EP 276103中。2. 2.参与除虫菌素牛物合成的基因在很多情况下，涉及次级代谢产物生产的基因及编码一种具体抗菌素的基因在染色体上的位置常常是簇集在一起的。例如，链霉菌聚酮化合物合成酶基因簇(PKS)(见 Hopwood 和 Sherman，1990，Ann. Rev. Genet. ,24 :37-66)。因此，对生物合成途径中的基因进行克隆的一个策略是，分离抗药性基因及然后检测染色体上相邻区域中其它与该具体抗生素的生物合成相关的基因。另外一种克隆重要代谢产物生物合成之相关基因的策略是突变体互补。例如，将来自能产生具体代谢产物的生物的DNA文库部分引入不产生该代谢产物的突变体，并筛选产生该代谢产物的转化株。另外，利用来自其它链霉菌的探针进行文库杂交的方法已被用于鉴别及克隆生物合成途径中的基因。涉及除虫菌素生物合成的基因(ave基因)，象链霉菌其它次级代谢物(例如，PKS) 的生物合成所必需的基因一样，是簇集于染色体上的。目前已使用载体成功克隆了许多 ave基因来弥补除虫菌素生物合成受阻的除虫链霉菌突变体。这些基因的克隆在美国专利 5，252，474 中已有描述。此外，Ikeda 等，1995，J. Antibiot. 48 :532-534 描述了涉及 C22, C23脱水步骤的染色体区域(aveC)定位在除虫链霉菌的4. 82Kb BamHI片段上，并描述了产生单一组份B2a生产者的aveC基因突变。由于双氢除虫菌素(ivermectin，一种潜在的抗蠕虫化合物)能由除虫菌素Bh化学合成，故认为该除虫菌素B2a的单一组分生产者对于双氢除虫菌素的商业生产特别有用。2001年6月19日授予Mutzman-Engwall等的美国专利6，M8，579，描述了除虫链霉菌aveC基因的一些突变，它们导致环己基B2 环己基Bl的比例减少到约0. 75 1。2001年2月22日公开的辉瑞产品公司(Pfizer Products Inc.)的PCT申请 W001/U821，描述了除虫链霉菌aveC基因的另一些突变，它们导致环己基B2 环己基Bl 的比例减少到约0.40 1。鉴定出aveC基因中导致进一步减小除虫菌素生产的复杂度的突变或突变组合， 例如，进一步降低除虫菌素B2 Bl比率的突变，可以简化商业上重要的除虫菌素的生产及纯化。3.发明简述本发明提供了一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，与质粒pSE186(ATCC 209604)上编码除虫链霉菌AveC基因产物的序列相同的核苷酸序列，或与图1(SEQ ID N0:1)所示除虫链霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其简并变体，但所述核苷酸序列还包含编码氨基酸取代组合的突变，所述取代发生在对应于SEQ ID NO 2的氨基酸位置的氨基酸残基上，使除虫链霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC 等位基因、且表达含有突变核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞，相对于仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌ATCC 53692细胞而言，产生的除虫菌素2类1类的比例下降，其中当除虫菌素2类1类为环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，除虫菌素2类1类的比例为0.35 1或更低。在一优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.30 1或更低。在一更优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约
为0.25 1或更低。在一更优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为
0. 20 1或更低。在一个具体实施方案中，氨基酸取代组合包含选自下组的组合(a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L ；(b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D ；(c)D48E, L136P, R163Q, G179S ；(d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D ；(e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D ；(f) D48E, L136P, G179S, E238D ；(g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D ；(h) D48E, A61T, L136P, G179S ；(i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S ；(j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L ；(k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L ；(1) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L ；(m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L ；(n) D48E, L84P, G111V, S138T, Α139Τ, G179S, A198G, P289L ；(o)Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D ；(ρ) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L ；(q) D48E, L136P, G179S, R250W ；(r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S ；(s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L ；(t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S ；(u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L ；(v) D48E, Α89Τ, L136P, R163Q, G179S ；(w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L ；(x)D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S ；
(y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D ；(z)D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L ；(aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S ；(ab)D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L ；(ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ；(ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D ；(ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L ；(af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D ；
(ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D ；(ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S ；(ai)D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S ；(aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S ；(ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D ；(al) Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D ；(am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S ；(an) D48E, A89T, S138T, G179S ；(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D ；(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D ；(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L ；(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ；(as)D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L ；(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L ；(au) D48E, A89T, L136P, G179S ；(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S ；(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D ；(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ；(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ；(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D ；(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A ；(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L ；(bc)D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L ；(bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ；禾口(be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D。本发明还提供了一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，与质粒pSE186(ATCC 209604)上编码除虫链霉菌AveC基因产物的序列相同的核苷酸序列，或与图1 (SEQ ID N0:1)所示除虫链霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其简并变体，但所述核苷酸序列还包含编码氨基酸取代组合的突变，所述取代发生在对应于SEQ ID NO :2的氨基酸位置的氨基酸残基上，导致除虫链霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC 等位基因、且表达含有突变核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞，相对于仅表达野生型 aveC等位基因的除虫链霉菌ATCC 53692细胞而言，产生的除虫菌素2类1类的比例下降，其中当除虫菌素2类1类为环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，除虫菌素2类1类的比例约为0.40 1或更低，且其中氨基酸取代组合包含选自下组的组合(bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D ；禾口(bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D。本发明还提供了含有本发明多核苷酸分子的重组载体。本发明还提供了含有本发明的多核苷酸分子或重组载体的宿主细胞。在一优选实施方案中，所述宿主细胞是链霉菌细胞。在一个更优选的实施方案中，所述宿主细胞是除虫链霉菌细胞。本发明还提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞的aveC等位基因发生突变，该突变导致AveC基因产物中出现氨基酸取代组合， 或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的 aveC等位基因或其简并变体编码含有氨基酸取代组合的AveC基因产物，其中所述氨基酸取代组合选自上文中列出的(a)_(be)。本发明还提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞的aveC等位基因发生突变，该突变导致在AveC基因产物中的氨基酸取代组合， 或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的 aveC等位基因或其简并变体编码含有氨基酸取代组合的AveC基因产物，其中含有突变的 aveC等位基因或其简并变体的细胞能产生0.35 1或更低比例的环己基B2 环己基Bl 除虫菌素。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个优选实施方案中，所述环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为 0. 30 1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个更优选实施方案中，所述环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为 0. 25 1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个更优选实施方案中，所述环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为 0. 20 1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。本发明还提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞的aveC等位基因发生突变，该突变导致在AveC基因产物中的氨基酸取代组合， 或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的 aveC等位基因或其简并变体编码含有氨基酸取代组合的AveC基因产物，其中所述氨基酸取代组合选自上文(bf)和(bg)所列的组。在一个优选实施方案中，含有这样的突变aveC 等位基因或其简并变体的除虫链霉菌细胞能产生约0.40 1或更低比例的环己基B2 环己基Bl除虫菌素。本发明还提供了链霉菌的细胞，它包含突变的除虫链霉菌aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一优选实施方案中，所述链霉菌是除虫链霉菌。本发明还提供了能产生0.35 1或更低比例的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的除虫链霉菌细胞。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a) _(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个优选实施方案中，所述环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为 0. 30 1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个更优选实施方案中，所述环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为 0. 25 1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个更优选实施方案中，所述环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为 0. 20 1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。本发明还提供了链霉菌的细胞，它包含突变的除虫链霉菌aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一优选实施方案中，所述链霉菌是除虫链霉菌。在一个更优选实施方案中，所述细胞是能产生约0.40 1或更低比例的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的除虫链霉菌细胞。本发明还提供了产生除虫菌素的方法，包括在允许或诱导产生除虫菌素的条件下，在培养基中培养本发明除虫链霉菌菌株的细胞，并从培养中回收所述除虫菌素。本发明还提供了由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的组合物，包括已经培养了细胞的培养基中的环己基B2 环己基Bl除虫菌素，其中所述培养基中环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例为0.35 1或更低，优选约0.30 1或更低，更优选约0.25 1或更低，更优选约0.20 1或更低。在一个具体实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的组合物由表达突变的aveC等位基因或其简并变体的除虫链霉菌菌株的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的基因产物导致由所述细胞产生的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的2类1类比例，相对于不表达突变的aveC等位基因、仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞而言，比例减少。在一个优选实施方案中，当所述组合物为0. 35 1或更低比例的环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a) _(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个更优选实施方案中，当所述组合物为约0.30 1或更低比例的环己基 B2 环己基Bl除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个更优选实施方案中，当所述组合物为约0.25 1或更低比例的环己基 B2 环己基Bl除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一个更优选实施方案中，当所述组合物为约0.20 1或更低比例的环己基 B2 环己基Bl除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。本发明还提供了由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的组合物，其包括已经培养了细胞的培养基中的环己基B2 环己基Bl除虫菌素，其中所述培养基中环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.40 1或更低，本发明还提供了由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的组合物， 所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。本发明还涉及下述各项。1. 一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因，或质粒pSE186(ATCC 209604)上的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列，或图1 (SEQ ID NO :1)所示除虫链霉菌 aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其简并变体，但该核苷酸序列还包含突变，所述突变编码相应于SEQ ID NO :2氨基酸位置上的氨基酸残基的取代组合，所述突变使得除虫链霉菌ATCC 53692株中，野生型aveC等位基因已失活但能表达含所述突变型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞能产生除虫菌素，且所产生的除虫菌素中2类1类的比例相对于除虫链霉菌ATCC 53692株中仅表达野生型aveC等位基因的那些细胞所产生的比例而言降低，其中当所述2类1类除虫菌素为环己基B2 环己基B 1除虫菌素时，所述2 类1类除虫菌素的比例为0.35 1或更低。2.项1的多核苷酸分子，其中所述环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例为 0. 20 1或更低。3.项1的多核苷酸分子，其中所述氨基酸取代组合包括选自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。4. 一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因，质粒pSE186(ATCC 209604)上除虫链霉菌AveC基因产物编码序列，或图1(SEQID NO 1)所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其简并变体，但该核苷酸序列还包含突变，所述突变编码相应于SEQ ID NO :2氨基酸位置上的氨基酸残基的取代组合，所述突变使得除虫链霉菌ATCC53692株中野生型aveC等位基因已失活但能表达含所述突变型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞能产生除虫菌素，且所产生的除虫菌素中2类1类的比例相对于由除虫链霉菌ATCC 53692株中仅表达野生型aveC等位基因的那些细胞所产生的比例降低，其中当所述2类1类除虫菌素为环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，所述2类1类除虫菌素的比例降低到约0.40 1或更低，且其中所述氨基酸取代的组合包含选自上文 (bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合。5. 一种宿主细胞，其含有项1或4的多核苷酸分子。6. 一种产生除虫链霉菌菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的 aveC等位基因突变，所述突变导致AveC基因产物中的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码包含氨基酸取代组合的AveC基因产物，所述AveC基因产物中的氨基酸取代组合包含选自上文(a) _(be)所列的氨基酸取代组合。7. 一种产生除虫链霉菌菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的 aveC等位基因突变，所述突变导致AveC基因产物中的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码包含氨基酸取代组合的AveC基因产物，所述包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞能以0.35 1或更低的比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素。8.项7的方法，其中所述氨基酸取代组合包括选自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。9.项7的方法，其中所述环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例为约0.20 1或更低。10. 一种产生除虫链霉菌菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的 aveC等位基因突变，所述突变导致AveC基因产物中的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码包含氨基酸取代组合的AveC基因产物，且其中所述氨基酸取代组合包含选自上文(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合。11. 一种含有突变的除虫链霉菌aveC等位基因或其简并变体的链霉菌细胞，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a) _(be)所列的氨基酸取代组合的 AveC基因产物。12.项11的细胞，其为除虫链霉菌细胞。13. 一种链霉菌细胞，其含有突变的除虫链霉菌aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。14. 一种由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的组合物，所述组合物在培养了细胞的培养基中含有环己基B2 环己基Bl除虫菌素，且该培养基中的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例为0.35 1或更低。
4.


图1.含有除虫链霉菌aveC ORF的DNA序列(SEQ ID NO 1)及其公认的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。图2.含有除虫链霉菌aveC基因完整的ORF的质粒载体pSE186 (ATCC209604)。图3.含有插入除虫链霉菌aveC ORF中的红色糖多孢菌(Sacc. Erythraea) ermE 基因的基因取代载体pSE180(ATCC 209605)。图4.除虫链霉菌的除虫菌素聚酮化合物合成酶基因簇的BamHI限制性酶切图谱， 以及鉴定的五种重叠的粘粒克隆(即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，PSE69)。还指示了 pSEl 18 与PSE119的关系。图5A-5D.除虫链霉菌菌株的发酵产物的HPLC分析。通过与环己基Bl的标准量比较来进行峰定量。环己基B2的滞留时间是7. 4-7. 7分钟，环己基Bl的滞留时间是 11.9-12. 3分钟。图5A.携带失活的aveC ORF的除虫链霉菌SE180-11菌株。图5B.用 pSEI86 (ATCC 209604)转化的除虫链霉菌SE180-11菌株。图5C.用pSE187转化的除虫链霉菌SE180-11菌株。图5D.用pSE188转化的除虫链霉菌SE180-11菌株。图6A-6M.汇编列表，显示由第二轮“基因改组”鉴定的aveC等位基因突变所编码的氨基酸取代组合，以及它们对环己基B2 环己基Bl生产比例的影响。对于每一种质粒而言，在题为“突变”的栏中，上面一格列出了氨基酸取代，下面一格列出了导致这些氨基酸取代的核苷酸碱基改变。括号中的核苷酸碱基改变为沉默改变，即它们不改变氨基酸序列。5.发明详述本发明涉及鉴定及表征具有编码除虫链霉菌AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，构建可用于筛选突变的AveC基因产物对除虫菌素生产的影响的除虫链霉菌新菌株，并发现一些突变的AveC基因产物可以降低除虫链霉菌产生的除虫菌素B2 Bl的比例。例如，本发明下文中描述了一种多核苷酸分子，它具有与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同的核苷酸序列，或图1 (SEQ ID NO=D的ORF的核苷酸序列，下文中还描述了具有由上述序列衍生的突变核苷酸序列的多核苷酸分子及其简并变体。但本发明所述原理可以类似地应用于其它多核苷酸分子，包括来自其它链霉菌例如吸水链霉菌(S. hygroscopeicus)及灰产色链霉菌(S. griseochromogenes)等的aveC同源基因。5.1.编码除jili车霍菌AveC某因产物的多核苷酸分子本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其含有除虫链霉菌的完整aveC ORF或其实质性部分，该分离的多核苷酸分子缺少处于除虫链霉菌染色体中aveC ORF所处位置下游的下一个完整0RF。本发明所述分离的多核苷酸分子优选包括与质粒pSE186(ATCC209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同，或与图1 (SEQ IDNO=I)的ORF的核苷酸序列或其实质性部分相同的核苷酸序列。本文中，含有编码除虫链霉菌AveC基因产物的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子的“实质性部分”指的是一种分离的多核苷酸分子，其至少包括图1(SEQID NO 1)所示完整aveC ORF序列的约70%，并且编码功能等效AveC基因产物。这里，“功能等效”的AveC基因产物被定义为一种基因产物，当其在失活了天然aveC等位基因的除虫链霉菌菌株ATCC 53692中表达时，导致与仅表达除虫链霉菌菌株ATCC 53692的天然野生型功能性aveC等位基因的除虫链霉菌菌株ATCC 53692相比，产生基本上相同的比例和量的除虫菌素。除了 aveC ORF的核苷酸序列外，本发明所述分离的多核苷酸分子可以进一步包括天然侧翼于除虫链霉菌原位aveC基因的核苷酸序列，例如图1 (SEQ ID NO :1)所示的侧翼核苷酸序列。本发明还提供了一种分离的多核苷酸分子，其基于已知的遗传密码简并性包含 SEQ ID NO 1的核苷酸序列或其简并变体。本文中，术语“多核苷酸分子”，“多核苷酸序列”，“编码序列”，“开放阅读框”及 “0RF”都是指DNA分子和RNA分子，其可以是单链或双链，当置于适当调控元件的控制之下时，在适当宿主细胞表达系统中可以被转录并翻译(DNA)或被翻译(RNA)成AveC基因产物，或者，被翻译成与AveC基因产物同源的多肽。编码序列包括但不限于原核序列，cDNA序列，基因组DNA序列，及化学合成的DNA和RNA序列。图1 (SEQ ID NO 1)所示的核苷酸序列在bp位置42，174，177及180包含四个不同的GTG密码子。如美国专利6，M8，579所示，可构建aveCORF(图1 ;SEQ ID NO 1)5'区域的多重缺失，以便帮助确定这些密码子中的哪些能在aveC ORF中用作蛋白质表达的起始位点。使bp 42位的第一个GTG位点缺失并不能消除AveC活性。进一步使bp位置174，
15177及180的所有GTG密码子都缺失消除了 AveC活性，这表明该区域对于蛋白质表达是必须的。本发明因此包括具有不同长度的aveC 0RF。本发明还提供了一种多核苷酸分子，其包含与质粒pSE186(ATCC209604)的除虫链霉菌aveC基因产物编码序列同源，或与图1 (SEQ ID NO 1)所示aveC ORF的核苷酸序列或其实质性部分同源的核苷酸序列。术语“同源”当用于指与除虫链霉菌AveC基因产物编码序列同源的多核苷酸分子时，指具有以下核苷酸序列的多核苷酸分子(a)与质粒 PSE186 (ATCC209604)上除虫链霉菌AveC基因产物编码序列编码相同的AveC基因产物，或与图1 (SEQ ID NO 1)所示aveC ORF的核苷酸序列编码相同的AveC基因产物，但在所述核苷酸序列中含有一或多个基于遗传密码简并性的沉默改变(即简并变体)；或(b)在中度严紧条件下与下述多核苷酸分子的互补序列杂交，并编码上述功能等效AveC基因产物， 其中所述多核苷酸分子含有编码由质粒pSE186(ATCC 209604)上AveC基因产物编码序列所编码的氨基酸序列，或编码图1 (SEQ ID NO 2)所示氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述中度严紧条件也即在65°C，0. 5M NaHPO4, 7%十二烷基硫酸钠(SDS)，ImM EDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，及在42°C，在0. 2XSSC/0. SDS中洗涤(例见Ausubel等(编)， 1989, Current Protocols inMolecular Biology, Vol. 1,Green Publishing Associates, Inc.，和 John Wiley& Sons，Inc.，New York, p. 2. 10. 3)。在优选的实施方案中，同源多核苷酸分子在高度严紧条件下与质粒pSE186(ATCC 209604)中编码AveC基因产物的核苷酸序列的互补序列杂交，或与图1(SEQ ID NO :1)所示的核苷酸序列或其实质性部分的互补序列杂交，并编码上述功能等效AveC基因产物，其中所述高度严紧条件是指，在65°C，0. 5M NaHPO4, 7% SDS,ImMEDTA 中与结合于滤膜上的 DNA 杂交，及在 68°C，在 0. 1XSSC/0. 1% SDS 中洗涤(Ausubel等，1989，见上文)。AveC基因产物及其潜在的功能等效物的活性，可以通过对发酵产物进行HPLC分析来测定，见下文实施例。含有编码除虫链霉菌aveC基因产物之功能等效物的核苷酸序列的多核苷酸分子，包括天然存在于除虫链霉菌其它菌株的aveC基因，存在于链霉菌其它种 WaveC同源基因，及突变的aveC等位基因，不管是天然的还是人工合成的。本发明还提供了一种多核苷酸分子，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列编码的氨基酸序列同源，或与图 KSEQ ID NO :2)所示氨基酸序列或其实质性部分同源的氨基酸序列。本文中，图1 (SEQ ID NOJ)所示氨基酸序列的“实质性部分”是指一种多肽，它包括图1 (SEQ ID NO⑵所示氨基酸序列的至少约70%，并且组成了上述功能等效AveC基因产物。本文用来描述与除虫链霉菌AveC基因产物之氨基酸序列同源的氨基酸序列时， 术语“同源”指一种多肽，它含有图1(SEQ ID NOd)所示氨基酸序列、但其中一或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守取代，其中所述氨基酸序列与质粒pSE186(ATCC 209604)上AveC基因产物编码序列编码的多肽、或与图1 (SEQ ID NO : 所示氨基酸序列相比，具有按照任何标准氨基酸序列同一性算法如BLASTP算法(GENBANK，NCBI)所确定的至少约70 %，更优选至少约80 %，最优选至少约90 %的氨基酸序列同一性，其中所述保守氨基酸取代产生了功能等效的基因产物，如上述定义。保守氨基酸取代是本领域众所周知的。进行这类取代的规则参见 Dayhof，M. D.，1978，Nat. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.，Vol. 5, Sup. 3等。更具体地，保守氨基酸取代是通常在一族具有相关酸性或极性的氨基酸家族中发生的那些。基因编码的氨基酸一般分为四组(1)酸性=天冬氨酸，谷氨酸； (2)碱性=赖氨酸，精氨酸，组氨酸；C3)非极性=丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；及(4)不带电的极性=甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸也可以归类为芳香氨基酸。在任何具体组中的一或多个取代通常对于该多肽的功能没有显著影响，例如，亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸取代，或天冬氨酸被谷氨酸取代，或苏氨酸被丝氨酸取代，或任何其它氨基酸残基被结构相关的氨基酸残基(例如，具有相似的酸性或极性，或具有相似性的一些结合的氨基酸残基)取代。本文公开的多核苷酸分子的生产和操作是本领域技术范围内的，可以按照下述重组技术进行操作，例如，Maniatis 等，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；Ausubel 等，1989, Current Protocols In Molecular BioIory, GreenePublishing Associates & Wiley Interscience, NY ；Sambrook 等，1989，MolecularCloninR :A Laboratory Manual, 2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor,NY :Innis等(编)，1995,PCR StrateRies, Academic Presslnc. , San Diego :Erlich (编),1992,PCR TechnoloRY, Oxford University Press, New ^rk (列入本文作为参考)。编码AveC基因产物或AveC同源基因产物的多核苷酸克隆可以通过本领域已知的任何方法进行鉴别，包括但不限于下文第7节所列举的方法。通过使用如Benton和Davis，1977，Science，196 :180中所述的筛选噬菌体文库的方法和 Grunstein 及 Hogness，1975，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 :3961-3965 所述的筛选质粒文库的方法，可以从基因组DNA文库中筛选aveC及aveC同系物编码序列。具有已知包括aveC ORF核苷酸序列的多核苷酸分子，例如存在于质粒pSE186(ATCC 209604)， 或质粒PSE119中的那些(见下文第7节)，可以用作这些筛选实验的探针。或者，可以根据纯化的AveC同源基因产物的部分或全部氨基酸序列所推出的核苷酸序列，来合成对应的寡核苷酸探针。5. 2.重组系统5.2.1.克隆与表达载体本发明还提供了重组克隆载体与表达载体，其可用于克隆或表达本发明含有，例如除虫链霉菌aveC ORF或任一 aveC同系物ORF的多核苷酸分子。在一非限制性实施方案中，本发明提供了质粒PSE186 (ATCC209604)，其含有除虫链霉菌aveC基因的完整ORF。所有下面有关除虫链霉菌aveC 0RF，或含有除虫链霉菌aveC ORF或其部分的多核苷酸分子，或除虫链霉菌AveC基因产物的描述，也是指如下所述的突变的aveC等位基因， 除非明确指明或根据上下文可以看出。已研制出具体用于链霉菌的多种不同载体，包括噬菌体，高拷贝数质粒，低拷贝数质粒，及大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒等，其中任一个都可以用来实践本发明。另外还从链霉菌中克隆了大量药物抗性基因，其中一些基因被掺入载体作为选择性标记。在链霉菌中使用这些载体的例子可参见，如 Hutchinson，1980，Applied Biochem. Biotech. , 16 :169 190。本发明的重组载体，尤其是表达载体，优选被构建为，使得本发明多核苷酸分子的编码序列与转录或翻译编码序列所必需的一或多个调控元件可操作相连，以便产生多肽。本文所用术语“调控元件”包括但不限于这样的核苷酸序列，其编码诱导型和非诱导型启动子，增强子，操纵子，及本领域已知用于驱动和/或调控多核苷酸编码序列的表达的其它元件。此外，如本文所用，编码序列与一或多个调控元件“可操作相连”，其中这些调控元件有效调节并允许转录编码序列和/或翻译其mRNA。典型的质粒载体经过改造可以包含本发明的多核苷酸分子，这些载体包括 pCR-Blunt, pCR2. 1 (Invitrogen)，pGEM3Zf (Promega)，和穿梭载体 pWHM3 (Vara 等，1989， J. Bact.，171 :5872-5881)等。构建含有具体编码序列并使其与适当调控元件可操作相连的重组载体的方法是本领域众所周知的，可使用这些方法实践本发明。这些方法包括体外重组技术，合成技术， 和体内基因重组。例见Maniatis等，1989，文献同上；Ausubel等，1989，文献同上；Sambrook 等，1989，文献同上；Innis等，1995，文献同上；及Erlich，1992，文献同上中描述的技术。这些载体的调控元件在强度和特异性方面可以不同。根据所用的宿主/载体系统，可使用多种适当的转录及翻译元件中的任一种。对于细菌来说，转录调控区或启动子的非限制性例子包括，β-gal启动子，T7启动子，TAC启动子，λ左及右启动子，trp及 Iac启动子，trp-lac融合启动子，具体对于链霉菌来说，启动子有ermE，melC，及tipA等。 在一个具体实施方案中，制备了一种表达载体，其含有已被克隆在与强组成型启动子相邻的位置上的aveC ORF或其突变的0RF，所述启动子如红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的ermE。按照美国专利6，248, 579所述，将含有ermE启动子的载体转化到除虫链霉菌中，随后对发酵产物进行的HPLC分析显示，所产生的除虫菌素的滴度相对于仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的产量有所增加。融合蛋白表达载体可用于表达AveC基因产物-融合蛋白。纯化的融合蛋白可用于产生抗AveC基因产物的抗血清，研究AveC基因产物的生化特性，改造具有不同生化活性的AveC融合蛋白，或辅助鉴定或纯化所表达的AveC基因产物。可能的融合蛋白表达载体包括但不局限于这样的载体，其中掺入了编码β -半乳糖苷酶的序列及trpE融合子，麦芽糖结合蛋白融合子，谷胱甘肽-S-转移酶融合子和多组氨酸融合子(运载区域)。在另一实施方案中，AveC基因产物或其部分可与来源于链霉菌其它种或菌株(例如吸水链霉菌或灰产色链霉菌)的AveC同源基因产物或其部分融合。将这种杂合载体转化至除虫链霉菌细胞中，并检测其效应，例如对所产生的除虫菌素2类1类之比例的影响。AveC融合蛋白经过改造可以含有对纯化有用的区域。例如，AveC-麦芽糖结合蛋白融合可以用直链淀粉树脂纯化；AveC-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白可以用谷胱甘肽-琼脂糖珠纯化；AveC-多组氨酸融合可以用二价镍树脂纯化。或者，可以用抗载体蛋白或肽的抗体进行融合蛋白的亲和纯化。例如，可以将编码单克隆抗体靶表位的核苷酸序列插入表达载体的适当位置处，使其与调控元件可操作相连并使所表达的表位与AveC多肽融合。例如，可通过标准技术将编码FLAG 表位标记anternationalBiotechnologies he.)(其为亲水性标记肽)的核苷酸序列插入表达载体中，使其插入位置对应于，例如， AveC多肽羧基末端。所表达的AveC多肽-FLAG 表位融合产物然后可以利用商购的抗-FLAG 抗体来进行检测及亲和纯化。编码AveC融合蛋白的表达载体也可以经过改造而含有编码特异性蛋白酶裂解位点的多接头序列，以使表达的AveC多肽在用特异性蛋白酶处理后可以与运载区域或融合
18配对物脱离。例如，所述融合蛋白载体可以包括编码凝血酶或)(a因子酶切位点等的DNA序列。位于aveC ORF上游且与其在同一框内的信号序列，可以利用已知方法插入表达载体中，以便指导所表达的基因产物的运输和分泌。信号序列的非限制性例子包括得自α因子，免疫球蛋白，外膜蛋白，青霉素酶和T细胞受体等的信号序列。为了帮助选择经过本发明克隆载体或表达载体转化或转染的宿主细胞，可以对所述载体进行改造，以使其进一步包括编码报道基因产物或其它选择标记的序列。优选所述编码序列与上述调控元件编码序列可操作相连。对本发明有用的报道基因是本领域已知的，包括那些编码绿色荧光蛋白，萤光素酶，xylE以及酪氨酸酶等的报道基因。编码选择标记的核苷酸序列是本领域已知的，包括编码赋予抗生素抗性或抗代谢物抗性的基因产物的那些，或提供营养缺陷型需求的那些。这类序列的实例包括编码抗红霉素，硫链丝菌肽 (thiostrepton)或卡那霉素等的抗性的那些。5. 2. 2宿主细胞的转化本发明进一步提供含有本发明多核苷酸分子或重组载体的经转化的宿主细胞，或由其衍生的新菌株或细胞系。可用于本发明实践中的宿主细胞优选为链霉菌细胞，但也可以用其它原核细胞或真核细胞。这类经转化的宿主细胞一般包括但不局限于微生物，例如经重组噬菌体DNA、质粒DNA、或粘粒DNA载体转化的细菌，或经重组载体转化的酵母，等等。本发明的多核苷酸分子欲在链霉菌细胞中发挥作用，但也可以被转化至其它细菌或真核细胞中以便实现例如克隆或表达目的。一般使用大肠杆菌菌株，如DH5 α菌株，它可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville, MD, USA(保藏号31343)，或可商购 (Stratagene)。优选的真核宿主细胞包括酵母细胞，也可以有效利用哺乳动物细胞或昆虫细胞。本发明的重组表达载体优选被引入(例如，经转化或转染)基本上均一培养的一或多个宿主细胞中。表达载体通常利用已知技术引入宿主细胞，所述技术如原生质体转化， 磷酸钙沉淀，氯化钙处理，显微注射，电穿孔，通过与重组病毒接触来进行转染，脂质体介导转染，DEAE-葡聚糖转染，转导，接合，或微粒轰击(microprojectile bombardment)。转化子可以用标准方法来选择，例如，选择那些表达了与重组载体相关的选择标记(如抗生素抗性)的细胞，如上述。 一旦将表达载体弓丨入宿主细胞，aveC编码序列已整合并维持在宿主染色体上或为游离体形式的事实，可以用标准技术如Southern杂交分析、限制酶分析、PCR(包括逆转录酶PCR(rt-PCR))分析来证实，或通过用免疫学试验检测预期基因产物来证实。含有和/或表达重组aveC编码序列的宿主细胞，可以通过本领域公知的至少四种常规方法中的任一种来证实，所述方法包括⑴DNA-DNA，DNA-RNA,或RNA-反义RNA杂交；(ii)检测标记基因功能的存在；(iii)通过测定宿主细胞中aveC特异性mRNA转录物的表达来评估转录水平， 及(iv)通过免疫分析或AveC生物活性的存在(例如，具体比例和量的除虫菌素的产生表示在，例如，除虫链霉菌宿主细胞中存在AveC活性)来测定成熟多肽产物的存在。5. 2. 3.重组AveC基因产物的表达及鉴定一旦将天然的或突变的aveC编码序列稳定引入合适的宿主细胞，可以使经过转化的宿主细胞无性繁殖，所得的细胞可以在有助于天然的或突变的AveC基因产物最大量生产的条件下进行培养。所述条件通常包括培养细胞直至高密度。当表达载体含有诱导型启动子时，可以根据诱导表达的需要采用合适的诱导条件，例如，温度变化，使营养耗尽，添加义务诱导物(例如，碳水化合物的类似物，如异丙基-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG))， 积累过量的代谢副产物等。当表达的AveC基因产物保留在宿主细胞内部时，收集细胞并裂解，在本领域已知使蛋白质降解最小化的提取条件下，例如，在4°C和/或有蛋白酶抑制剂存在的条件下，从裂解物中分离并纯化产物。当表达的AveC基因产物从宿主细胞中分泌时，只需收集耗尽的营养培养基并从中分离产物。表达的AveC基因产物，可利用标准方法从相应的细胞裂解物或培养基中分离或基本上纯化，所述方法包括但不局限于下列方法的任何组合硫酸铵沉淀，大小分级分离， 离子交换层析，HPLC，密度离心及亲和层析。当表达的AveC基因产物表现出生物活性时， 可使用适当试验在纯化步骤的每一步监控所述制剂不断提高的纯度。不管表达的AveC基因产物是否表现出生物活性，都可以依据其大小或与AveC特异性抗体的反应性来检测，或在融合标记的存在下检测。如本文所用，AveC基因产物当在具体制剂中占蛋白重量比的约 20%以上时为“基本上纯化”。同样，如本文所用，AveC基因产物当在具体制剂中占蛋白重量比的至少约80%时是“分离的”。本发明因此提供分离的或基本上纯化的重组表达型除虫链霉菌AveC基因产物， 其含有可以被质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列所编码的氨基酸序列， 或图1(SEQ ID N0J)所示的氨基酸序列或其实质性部分，本发明还提供所述基因产物的突变体和简并变体。本发明还提供了生产AveC基因产物的方法，包括在有助于产生重组AveC基因产物的条件下，培养经重组表达载体转化的宿主细胞，并从细胞培养物中回收AveC基因产物，其中所述载体含有一种多核苷酸分子，该多核苷酸分子具有编码AveC基因产物的核苷酸序列并与一或多个控制该多核苷酸分子在宿主细胞中的表达的调控元件可操作相连。重组表达的除虫链霉菌AveC基因产物可用于多种目的，包括筛选可以改变AveC 基因产物功能并因此调节除虫菌素生物合成的化合物，以及产生抗AveC基因产物的抗体。一旦获得纯度足够高的AveC基因产物，就可以用标准方法进行鉴定，所述方法如 SDS-PAGE，大小排阻层析，氨基酸序列分析，在除虫菌素生物合成途径中产生合适产物的生物活性等等。例如，可以使用标准的肽测序技术测定AveC基因产物的氨基酸序列。可以用亲水性分析(例见 Hopp 和 Woods，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :3824)或类似的软件运算法来鉴定AveC基因产物的亲水区及疏水区，籍此进一步鉴定AveC基因产物。可进行结构分析以鉴定AveC基因产物中具有特殊二级结构的区域，例如可使用诸如X-射线结晶学等生物物理法(Engstrom，1974，Biochem. Exp. Biol. 11 :7-13)，计算机建模(Fletterick 及 Zoller (编)，1986，Communications inMolecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，NY)，和核磁共振(WR)来作图并研究AveC基因产物与其底物之间相互作用的位点。从这些研究所取得的信息可用于选择aveC ORF中的新突变位点，以帮助开发具有更合适的除虫菌素生产特性的除虫链霉菌新菌株。5. 3. aveC突变体的构建及应用本发明的一个主要目的是鉴定除虫链霉菌aveC等位基因中导致B2 Bl除虫菌素的比例改变(最优选减少)的新突变。本发明因此提供了可用于产生除虫链霉菌新菌株的细胞的一种多核苷酸分子，所述细胞与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，除虫菌素生产出现可以检测到的改变。在一个优选实施方案中，所述多核苷酸分子可以用于产生除虫链霉菌新菌株的细胞，这种细胞与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，产生具有较低的2类1类比例的除虫菌素。所述菌株的细胞还可以包含其它突变，以便与仅表达单个野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，产生更多量的除虫菌素。aveC等位基因或编码序列的突变包括下述的任何突变，其在AveC基因产物中引入一或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，或导致AveC基因产物截短，或它们的任何组合， 且产生所需结果。所述突变的aveC等位基因序列还包括它们的任何简并变体。例如，本发明提供以下多核苷酸分子，其包含aveC等位基因的核苷酸序列或其简并变体，或包含质粒 pSE186(ATCC209604)上的AveC基因产物编码序列或其简并变体，或图1 (SEQ ID NO 1)所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列或其简并变体，但其进一步含有突变，所述突变编码 AveC基因产物选定位点的氨基酸取代的组合。在一个非限制性实施方案中，这类取代发生在AveC基因产物中对应于SEQ IDNO 2的氨基酸位置25，28，35，36，38，40，41，48，55，61， 78，84，89，90，99，107，108，111，120，123，136，138，139，141，154，159，163，179，192，196， 198，200，202，220，228，229，230，231，234，238，239，250，252，266，275，278，289 或 298 的一或多个氨基酸位置上。优选将要取代的氨基酸位置的组合包含D48，A61，A89，L136，S138， A139，R163，G179，V196，A198，E238和P289中的一或多个。特别优选的氨基酸取代组合包含在D48和G179的取代，更优选D48E和G179S。导致环己基B2 环己基Bl比例下降的氨基酸取代组合的具体实例列在图6A-J中。本发明因此提供了一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，与质粒pSE186(ATCC 209604)上编码除虫链霉菌AveC基因产物的序列相同的核苷酸序列，或与图1 (SEQ ID N0:1)所示除虫链霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其简并变体，但所述核苷酸序列还包含编码氨基酸取代组合的突变，所述取代发生在对应于SEQ ID NO :2的氨基酸位置的氨基酸残基上，使除虫链霉菌ATCC 53692中失活了野生型 aveC等位基因、且表达含有上述突变核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞，相对于仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌ATCC 53692细胞而言，产生的除虫菌素2类1类的比例下降，其中当除虫菌素2类1类为环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，除虫菌素2 类1类的比例为0.35 1或更低。在一优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.30 1或更低。在一更优选实施方案中，环己基B2 环己基B 1除虫菌素的比例约为0.25 1或更低。在一优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.20 1或更低。在一个具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(a)组的组合D48E，A61T， A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 pSE538(见图 6)。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(b)组的组合G40S，D48E， L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE559。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(c)组的组合D48E，L136P，
21R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE567。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(d)组的组合D48E，L136P， R163Q，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE572。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(e)组的组合D48E，L136P， R163Q，G179S，A200G, E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE571。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(f)组的组合D48E，L136P， G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE501和pSE546。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(g)组的组合D48E，A61T， L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE510。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(h)组的组合D48E，A61T， L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE512。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(i)组的组合D48E，A89T， S138T，A139T，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE519。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(j)组的组合D48E，A61T， L136P，G179S，A198G，P202S, E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 pSE5260在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(k)组的组合D48E，A61T， L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 pSE5280在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(1)组的组合D48E，L136P， G179S，A198G，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE530。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(m)组的组合D48E，A61T， S138T，A139F，G179S，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE531。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(η)组的组合D48E，L84P， G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L0编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 PSE534。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ο)组的组合Y^C，D48E， A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 pSE535。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ρ)组的组合D48E，A61T， A107T，S108G, L136P，G179S，S192A，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE542。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(q)组的组合D48E，L136P， G179S，R250W。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE545。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(r)组的组合D48E，A89T， S138T，A139T，R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE548。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(s)组的组合D48E，L136P， G179S，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE552。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(t)组的组合D48E，F78L，A89T，L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE557。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(U)组的组合D48E，A89T， S138T，A139T，G179S，E238D，F278L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE564 和 pSE565。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ν)组的组合D48E，A89T， L136P，R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE568。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(w)组的组合D48E，A61T， A89T，GllIV，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE543。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(χ)组的组合D25G，D48E， A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE504。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(y)组的组合D48E，A89T， S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE508。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ζ)组的组合D48E，A61T， A89T，GllIV，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE511。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(aa)组的组合D48E，A89T， S138T，A139T，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE520。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ab)组的组合D48E，L136P， R163Q，G179S，S231L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE523。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ac)组的组合D48E，L136P， S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE527。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ad)组的组合D48E，A61T， A89T，F99S，S138T，A139T，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 PSE539。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ae)组的组合G35S，D48E， A89T，S138T，A139T，G179S，P^9L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE540。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(af)组的组合D48E，A61T， A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 PSE547。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ag)组的组合D48E，A89T， GllIV，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 PSE550。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ah)组的组合S41G，D48E， A89T，L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE558。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ai)组的组合D48E，A89T， L136P，R163Q，G179S，P252S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE563。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(aj)组的组合D48E，A89T，L136P，G179S，F234S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE566。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ak)组的组合D48E，A89T， L136P，R163Q，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE573和 PSE578。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(al)组的组合Q36R，D48E， A89T，L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE574。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(am)组的组合D48E，A89T， L136P，R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE575和pSE576。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(an)组的组合D48E，A89T， S138T，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE577。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ao)组的组合D48E，A89T， L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE502和pSE5M。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ap)组的组合D48E，A89T， L136P，K154E, G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE503。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(aq)组的组合D48E，A89T， S138T，A139T，K154R, G179S，V196A，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 PSE505。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ar)组的组合D48E，A89T， S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE506。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(as)组的组合D48E，A61T， A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 PSE507。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(at)组的组合D48E，A61T， S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 PSE509。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(au)组的组合D48E，A89T， L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE514和pSE525。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(av)组的组合D48E，A89T， V120A, L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE515。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(aw)组的组合D48E，A61T， A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE517。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ax)组的组合D48E，A61T， A89T，GllIV，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE518。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ay)组的组合D48E，A61T， A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE5^和pSE554。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(az)组的组合D48E，A61T，
24A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE532。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ba)组的组合D48E，A89T， S138T，A139F，G179S，A198G，V220A。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE536。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(bb)组的组合D48E，A61T， A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE537。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(be)组的组合D48E，A61T， A89T，L136P，G179S，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE541。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(bd)组的组合D48E，A89T， S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 PSE549 和 pSE553。在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(be)组的组合D48E，A61T， A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是 pSE551ο本发明还提供了一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，与质粒pSE186(ATCC 209604)上编码除虫链霉菌AveC基因产物的序列相同的核苷酸序列，或与图1 (SEQ ID N0:1)所示除虫链霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其简并变体，但所述核苷酸序列还包含编码氨基酸取代组合的突变，所述取代发生在对应于SEQ ID NO :2的氨基酸位置的氨基酸残基上，导致除虫链霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC 等位基因、且表达含有上述突变核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞，相对于仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌ATCC 53692细胞而言，产生的除虫菌素2类1类的比例下降，其中当除虫菌素2类1类为环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，除虫菌素2类1 类的比例约为0.40 1或更低，且其中氨基酸取代组合包含选自下组的组合(bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D ；禾口(bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D。编码(bf)组氨基酸取代的质粒的非限制性实例是PSE556和pSE569。编码(bg) 组氨基酸取代的质粒的一个非限制性实例是PSE561。本发明涉及，上述任一种氨基酸取代可以通过对aveC等位基因的核苷酸序列或其简并变体进行任何能导致所述取代的修饰来实现。例如，通过将天然密码子序列或其简并变体改换为编码相同氨基酸取代的数个可选密码子中任一种，有可能实现本文所述的大多数氨基酸取代。本领域技术人员基于本文所述以及已知的遗传密码子简并性，可以轻易而明显地确定编码上述氨基酸取代的各种可能序列。在上文所列的每一种具体组合的一个非限制性实施方案中，氨基酸取代通过图6所示非沉默核苷酸改变来实现。本文中，“氨基酸取代组合包含以下组合…”等等是指，本发明AveC基因产物中的氨基酸取代至少包括具体列出的那些取代，而且可以包括其它氨基酸取代，或氨基酸缺失， 或氨基酸添加，或它们的一些组合，其中所得AveC基因产物在除虫链霉菌细胞中的表达导致B2 Bl除虫菌素的比例按照预期的下降。aveC等位基因或其简并变体的突变可通过多种已知方法的任一种来实施，包括使用易错PCR，或通过盒式诱变。例如，可以使用寡核苷酸定向诱变以一种限定的方式改变 aveC等位基因或ORF的序列，如在aveC等位基因或ORF中的具体区域引入一或多个限制性位点或一个终止密码子。正如美国专利5，605，793,5, 830，721,5, 837，458所述，也可使用涉及随机片断化、诱变的反复循环、以及核苷酸改组的方法，来产生具有编码aveC突变的核苷酸序列的多核苷酸大文库。靶向突变是有效的，尤其当它们改变AveC基因产物中的一或多个保守氨基酸残基时更是如此。例如，将除虫链霉菌AveC基因产物的公认氨基酸序列(SEQ ID NO 2)与来自灰产色链霉菌(SEQ ID NO 5)及吸水链霉菌(SEQ ID NO 4)的AveC同源基因产物的公认氨基酸序列(美国专利6，248, 579)相比较，显示了这些物种之间显著保守的氨基酸残基位点。导致一或多个所述保守氨基酸残基改变的靶向诱变对于产生可以显示所需的除虫菌素产量改变的新突变株是非常有效的。随机诱变也是有效的，可以通过将除虫链霉菌细胞暴露于紫外线或X-射线照射， 或暴露于化学诱变剂如N-甲基-N'-亚硝基胍，甲烷磺酸乙酯，亚硝酸或氮芥等，来进行诱变。有关诱变技术的综述可参见Ausubel，1989，文献同上。一旦产生突变的多核苷酸分子，可通过筛选确定它们是否可调节除虫链霉菌中的除虫菌素生物合成。在优选的实施方案中，具有突变的核苷酸序列的多核苷酸分子，可以通过弥补(complementing)除虫链霉菌菌株来检测，所述菌株是aveC基因已失活从而给出 aveC阴性(aveC-)背景的菌株。在一个非限制性方法中，突变的多核苷酸分子被剪接到表达质粒中，与一或多个调控元件可操作相连，该质粒优选还包括一或多个药物抗性基因，以便允许对经转化的细胞进行选择。使用已知技术将该载体转化至aveC-宿主细胞，选择经转化的细胞，并在允许或诱导除虫菌素产生的条件下在合适的发酵培养基中进行培养，所述条件例如，在培养基中包括合适的起始亚基，以及在本领域已知的最适合除虫菌素生产的条件下培养。然后通过HPLC分析发酵产物，以测定突变的多核苷酸分子弥补宿主细胞的能力。数种携有能降低除虫菌素B2 Bl比例的突变多核苷酸分子的载体，包括PSE188， pSE199，pSE231，pSE239，以及pSE290至pSE297都在下面8. 3章节举例说明。这类质粒载体的其它实例见图6。本发明上述任一种方法可以用发酵培养基进行，优选在培养基中添加环己烷羧酸，但也可以使用其它合适的脂肪酸前体，例如，表1所列的任一种脂肪酸前体，或甲硫乳酸(methylthiolactic acid)。一旦鉴定出按所需方向调节除虫菌素生产的突变的多核苷酸分子，就可以确定核苷酸序列上发生突变的位置。例如，具有编码突变AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子可以通过PCR分离，并用已知方法对其进行DNA序列分析。通过比较突变型和野生型 aveC等位基因的DNA序列，可以确定负责改变除虫菌素生产的突变。例如，除虫链霉菌AveC 基因产物在第55位(S55F)，第138位(S138T)，第139位(A139T)或第230位(G230D)中任一处含有单个氨基酸取代，或在第138位(S138T)和第139位(A139T或A139F)含有双重取代时，导致AveC基因产物的功能发生改变，使所产生的除虫菌素2类1类的比例改变 (参见下文第8章节)，其中所述氨基酸位置对应于图1 (SEQ ID NO 2)中所示。此外，以下 7种突变组合分别显示能有效降低除虫菌素的2类1类之比(DD48E/A89T ； (2)S138T/ A139T/G179S ； (3)Q38P/L136P/E238D ； (4)F99S/S138T/A139T/G179S ；(5)A139T/M228T ； (6)G111V/P289L ； (7) A139T/K154E/Q298H0本发明包括显示能降低除虫菌素环己基B2 环己基Bl之比例的另外59种突变组合，它们表示在图6中并引述在权利要求中。本文中，上述表达方式(如A139T)是指，用单字母表示的起始氨基酸残基(本例中为丙氨酸A)，在指定位置(本例中为SEQ ID NO :2所示多肽的第139位)，被替换起始氨基酸残基的氨基酸残基(本例中为苏氨酸T)取代。本文中，当由除虫链霉菌染色体中，或者本发明载体或分离的多核苷酸分子中的 aveC等位基因所编码的氨基酸残基被描述为“对应于” SEQ IDNO 2的具体氨基酸残基，或者当氨基酸取代被描述为发生在“对应于”SEQ ID NO :2中具体编号的氨基酸残基的具体位置上，这时是表示处在AveC基因产物相同位置上的氨基酸残基，本领域技术人员可以参看本文SEQ ID NO :2所示氨基酸序列很快确定该残基。本文中，当编码具体突变的aveC等位基因中的具体突变被描述为aveC等位基因中“对应于” SEQ ID NO :1所示具体核苷酸位置的具体核苷酸位置上发生的碱基改变，或者当aveC等位基因中的核苷酸位置被描述为“对应于”SEQ ID NO :1中的具体核苷酸位置，这时是指aveC核苷酸序列或其简并变体中同样相关位置上的核苷酸，本领域技术人员参照本文SEQ ID NO :1所示核苷酸序列能快速确定该核苷酸。本文中描述除虫菌素环己基B2 环己基Bl的比例时所用的术语“约”是指，具体指明的数值加或减该数值的10%。本发明的多核苷酸分子可以是“分离的”，这意味着(i)它已经经过纯化，因此基本上不含具有不同核苷酸序列的其它多核苷酸分子；或(ii)它处在并非天然的环境中，例如来自除虫链霉菌的aveC等位基因或其突变形式处在并非除虫链霉菌细胞的另一种细胞中；或(iii)它表现为并非天然的一种形式，例如更短的DNA片段，如消化细菌染色体所得的限制性片段，它们主要含有aveC编码区或其突变形式，可以含或不含其任何辅助调控序列，或者是随后被整合到异源DNA片段中，如(除了除虫链霉菌细胞以外的)细菌细胞的染色体中，或者诸如质粒或噬菌体等载体的DNA中，或者被整合到除虫链霉菌染色体上并非天然aveC等位基因所处的位置。本发明还提供了包含本发明多核苷酸分子的重组载体。所述重组载体可用于将任何含有本发明的突变核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除虫链霉菌染色体上的aveC等位基因位点，以通过例如同源重组来插入或取代aveCORF或其部分。然而，按照本发明，此处提供的含有本发明的突变核苷酸序列的多核苷酸分子也可以在插入到除虫链霉菌染色体上除aveC等位基因以外的其它位点时，或在作为除虫链霉菌细胞中的游离体形式维持时，发挥调节除虫菌素生物合成的功能。因此，本发明还提供了包含多核苷酸分子的载体，所述多核苷酸含有本发明所述突变的核苷酸序列，所述载体可用于将所述多核苷酸分子插入到除虫链霉菌染色体上除aveC基因位点以外的位置，或以游离体的形式维持。在非限制性实施方案中，所述载体是下述基因取代载体，其可以用于将本发明所述突变的aveC等位基因或其简并变体插入除虫链霉菌菌株的细胞中，籍此产生新的除虫链霉菌菌株，所述菌株的细胞与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，产生的除虫菌素2类1类的比例下降。这类基因取代载体可以用本文提供的表达载体(例如以下第8章节中所例举的那些表达载体)中的突变多核苷酸分子来构建。本发明还提供了一种载体，其可用于将突变的aveC等位基因或其简并变体插入除虫链霉菌菌株的细胞中，以便产生新菌株的细胞，所述新细胞与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，除虫菌素的产量有所改变。在优选的实施方案中，所述新细胞产生的除虫菌素的量增加。在具体的非限制性实施方案中，该载体包含本领域已知的强启动子，例如，来自红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的强组成型ermE启动子， 使其位于ave ORF上游并与该aveC ORF可操作相连。所述载体可以使用质粒pSE189中的突变的aveC等位基因，按照美国专利6，248, 579中所述的方法来构建。本发明提供了基因取代载体，其可用于灭活野生型除虫链霉菌菌株中的aveC基因。在非限制性实施方案中，所述基因取代载体可以用质粒pSE180(ATCC 209605)中存在的突变的多核苷酸分子来构建，该质粒在下文第8. 1章节描述(图幻。本发明还提供了含有多核苷酸分子的基因取代载体，所述多核苷酸分子包含天然侧翼于除虫链霉菌染色体上原位aveC基因的核苷酸序列或由该序列组成，包括，例如那些如图1 (SEQ ID NO 1)所示的侧翼核苷酸序列，所述载体可用于使除虫链霉菌aveC ORF缺失。本发明还提供了一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸分子或重组载体。所述宿主细胞可以是任何能作为所述多核苷酸分子或重组载体的宿主的原核或真核细胞。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。在一个更优选实施方案中，所述宿主细胞是链霉菌属的细胞。在一个更优选实施方案中，所述宿主细胞是除虫链霉菌的细胞。本发明还提供了产生除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，导致在AveC基因产物中出现氨基酸取代组合，或(ii)将突变的aveC等位基因或其简并变体引入除虫链霉菌菌株的细胞中，所述基因或变体编码的 AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。本发明还提供了产生除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，导致在AveC基因产物中出现氨基酸取代组合，或(ii)将突变的aveC等位基因或其简并变体引入除虫链霉菌菌株的细胞中，所述基因或变体编码的AveC基因产物包含氨基酸取代组合，所述含有突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞能以0.35 1或更低的比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中 (a)-(be)所列的氨基酸取代组合。在一个优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.30 1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC 基因产物包含选自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代组合。在一个更优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.25 1 或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC 基因产物包含选自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代组合。在一个更优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.20 1 或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC 基因产物包含选自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合。本发明还提供了产生除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，导致在AveC基因产物中出现氨基酸取代组合，或(ii)将突变的aveC等位基因或其简并变体引入除虫链霉菌菌株的细胞中，所述基因或变体编码的AveC基因产物包含选自(bf)和(bg)的氨基酸取代组合。在一优选实施方案中，含有所述突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞能以约0.40 1或更低的比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素。按照上述步骤使aveC等位基因突变，或引入突变的aveC等位基因或其简并变体之后，可以产生新的除虫链霉菌菌株。本发明还提供了包含突变的aveC等位基因或其简并变体的链霉菌属细胞，所述基因或变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。在一个优选实施方案中，链霉菌属的物种是除虫链霉菌。本发明还提供了能以0.35 1或更低比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素的除虫链霉菌细胞。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a) _ (be) 所列的氨基酸取代组合。在一个优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.30 1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(f)_(be)所列的氨基酸取代组合。在一个更优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.25 1 或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体， 所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(w)_(be) 所列的氨基酸取代组合。在一个更优选实施方案中，环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例约为0.20 1 或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体， 所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(ao)-(be) 所列的氨基酸取代组合。本发明还提供了链霉菌属物种的细胞，其包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文所列(bf) 和(bg)的氨基酸取代组合。在一优选实施方案中，所述链霉菌属物种是除虫链霉菌。在一个更优选实施方案中，所述细胞是能以约0.40 1或更低的比例产生环己基B2 环己基 Bl除虫菌素的除虫链霉菌细胞。上述任一种突变都可以出现在本发明细胞中的染色体外元件(如质粒)上，但优选所述突变出现在整合到除虫链霉菌染色体中的aveC编码序列中，优选，但并非必需，位于天然aveC等位基因的位置。所述新菌株的细胞可以用于大量产生具有商业价值的除虫菌素如doramectin。本发明还提供了产生除虫菌素的方法，包括在培养基中，用允许或诱导本发明的除虫链霉菌细胞产生除虫菌素的条件下，培养所述细胞，并从培养物中回收所述除虫菌素。 在一个优选实施方案中，该方法中所用的细胞以0.35 1或更低的比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素，更优选所述比例为约0.30 1或更低，更优选所述比例为约0.25 1 或更低，更优选所述比例为约0.20 1或更低。在一个优选实施方案中，以0.35 1或更低比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素的细胞，包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。在另一个优选实施方案中，以约0.30 1或更低比例产生环己基B2 环己基Bl 除虫菌素的细胞，包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代组合。在另一个优选实施方案中，以约0.25 1或更低比例产生环己基B2 环己基Bl 除虫菌素的细胞，包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代组合。在另一个优选实施方案中，以约0.20 1或更低比例产生环己基B2 环己基Bl 除虫菌素的细胞，包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合。在另一个优选实施方案中，所述细胞以约0.40 1或更低比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素，且包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组
I=I ο本发明的方法使具有商业价值的除虫菌素如doramectin的生产效力提高。本发明还提供了由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的组合物，其在培养所述细胞的培养基中包含环己基B2 环己基Bl除虫菌素，该培养基中环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例为0.35 1或更低，优选约0.30 1或更低，更优选约 0. 25 1或更低，优选约0.20 1或更低。在一个具体实施方案中，所述的环己基B2 环己基Bl除虫菌素组合物由表达突变的aveC等位基因或其简并变体的除虫链霉菌菌株的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的基因产物，导致所述细胞与不表达突变的aveC等位基因而是仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞相比，产生的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的比例下降。在一个优选实施方案中，当所述组合物是0.35 1或更低比例的环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)_(be)所列的氨基酸取代组合。在另一个优选实施方案中，当所述组合物是约0.30 1或更低比例的环己基 B2 环己基Bl除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中 (f)-(be)所列的氨基酸取代组合。在另一个优选实施方案中，当所述组合物是约0.25 1或更低比例的环己基 B2 环己基Bl除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中 (w)-(be)所列的氨基酸取代组合。在另一个优选实施方案中，当所述组合物是约0.20 1或更低比例的环己基 B2 环己基Bl除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合。本发明还提供了由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2 环己基Bl除虫菌素的组合物，其在培养所述细胞的培养基中包含环己基B2 环己基Bl除虫菌素，该培养基中环己基 B2 环己基Bl除虫菌素的比例约0.40 1或更低，且是由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合。优选所述除虫菌素新组合物出现在培养过细胞的培养基中，例如，在部分或完全耗尽的发酵培养液中，另外也可以用已知的生物化学纯化技术，如硫酸铵沉淀，透析，大小分级分离，离子交换层析，HPLC等，将除虫菌素组合物从培养液中部分纯化或实质上纯化出来。除了如上所述产生除虫链霉菌新菌株，使其包含能产生比例降低的环己基B2 环己基Bl的细胞，本发明还涉及将其它突变引入除虫链霉菌细胞中，以便进一步改进除虫菌素生产的特性。在一个非限制性实施方案中，本发明的细胞还包含一些修饰，以便提高除虫菌素的生产水平。在一个实施方案中，所述细胞可以如下制备(i)使除虫链霉菌细胞中的aveC等位基因突变，或(ii)将突变的aveC等位基因或其简并变体引入除虫链霉菌菌株的细胞中，其中所述突变的等位基因的表达导致，表达该突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株的细胞，与仅表达单个野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，除虫菌素的产量增加，然后选出经转化的细胞，其与仅表达单个野生型aveC等位基因的菌株的细胞相比，除虫菌素的产量增加。例如，可以对aveC等位基因进行修饰，使其包含强启动子，如红色糖多孢菌的强组成型ermE启动子，使其位于ave ORF上游并与该aveC ORF可操作相连。在另一实施方案中，可以将一或多个突变引入除虫链霉菌的aveRl和/或aveR2基因中，从而增加除虫菌素的生产水平，如2001年3月6日授予Mutzman-Engwall的美国专利 6，197，5591 所述。5. 4.除虫菌素的用途除虫菌素是可具体作为治蠕虫剂、杀体外寄生虫剂、杀虫剂及杀螨剂来使用的高效抗寄生虫药剂。按本发明方法产生的除虫菌素化合物均可用于这些用途。例如，按本发明方法产生的除虫菌素化合物可用于治疗人类的各种疾病或症状，尤其是本领域已知由寄生虫感染造成的那些疾病。参见 Ikeda and Omura，1997，Chem. Rev. 97 (7) :259H609。更具体地，按本发明方法产生的除虫菌素化合物可有效治疗由内寄生虫所致的各种疾病，所述内寄生虫如能感染人，家养动物，猪，绵羊，家禽，马或牛的寄生性线虫。更具体地，按本发明方法产生的除虫菌素化合物可有效抵抗感染人体的线虫以及感染各种动物的线虫。这类线虫包括胃肠道寄生虫如钩虫(Ancylostoma)，线虫 (Necator)，蛔虫(Ascaris)，类圆线虫(Strongyloides)，旋毛虫(Trichinella)，毛细线虫 (Capillaria)，鞭虫(Trichuris)J^S (Enterobius)，恶丝虫(Dirof ilaria)，及在血管或其它组织或器官中发现的寄生虫如丝虫性蠕虫以及类园线虫和旋毛虫的肠道提取物。按本发明方法产生的除虫菌素化合物也可用于治疗体外寄生虫感染，包括节肢动物对哺乳动物或鸟类的感染，如能感染马和牛的蜱(tick)、螨、虱、蚤、绿头苍蝇、咬虫 (biting insect)、或移栖双翅目幼虫等引起的感染。按本发明方法产生的除虫菌素化合物也可作为杀虫剂用于对抗室内害虫(household pest)如蟑螂、衣蛾、地毯甲虫、及家蝇等，以及侵害储存的谷物和农作物的有害昆虫，包括红蜘蛛(spider mite)、蚜虫、毛虫、和直翅目幼虫如蝗虫(locust)等。用按本发明方法产生的除虫菌素化合物能治疗的动物包括绵羊、牛、马、鹿、山羊、 猪、鸟类包括家禽、狗和猫。按本发明方法产生的除虫菌素化合物可根据具体用途、接受治疗的宿主动物的具体种类、所涉及的寄生虫或昆虫等情况以相应剂型给药。当作为杀寄生虫剂使用时，按本发明方法产生的除虫菌素化合物可以以胶囊、丸剂、片剂、或灌服液的剂型口服，或以倾注 (pour-on)、注射或植入的形式给药。这类制剂可以按标准兽医学实践以传统方式制备。因此，可将活性成分与精确分配的适当稀释剂或载体混合来制备胶囊、丸剂或片剂，所述稀释剂或载体另外含有崩解剂和/或粘合剂如淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁等。灌服剂是将活性成分与分散剂或润湿剂等一起分散在水溶液中来制备。注射剂可配制成无菌溶液，其中可含其它物质如足够的盐和/或葡萄糖以便使该溶液相对于血液为等渗状态。这些配制剂中活性化合物的重量可根据患者、或所治疗的宿主动物种类、感染的严重性及类型、宿主的体重等而变化。通常，口服给药的一剂为约0. OOl-IOmg活性化合物/ kg患者或动物的体重，单次给药或在1-5天内分次给药。但有时可由医生或兽医根据临床症状确定较高或较低的剂量。或者，按本发明方法产生的除虫菌素化合物也可以与动物饲料一起给药，为此，可制备浓缩的食物添加剂或预混剂以便与常规动物饲料混合。当作为杀虫剂使用，及用于处理农业害虫时，按本发明方法产生的除虫菌素化合物也可以按标准农业实践以喷雾剂，粉剂，乳剂和类似形式来使用。6. t施例除jili车霍菌的发酵及除虫菌素B2 Bl的分析如果发酵培养基中不补充脂肪酸，则既缺失支链2-氧酸脱氢酶又缺失5-0-甲基转移酶活性的菌株将不产生除虫菌素。该实施例证实这类突变株在有不同脂肪酸的条件下启动生物合成时，可获得很宽范围的除虫菌素B2 Bl比例。6. 1.材料及方法除虫链霉菌ATCC 53692储存在_70°C的全肉汤接种培养基中，培养基的组成为 淀粉(Nadex, Laing National) ~20g ；Pharmamedia (Trader ‘ sProtein, Memphis, TN) _15g ； Ardamine pH(Yeast Products Inc.) _5g ；碳酸钙_lg。终体积用自来水调整为1升，pH调整至7. 2，培养基在121°C高压灭菌25分钟。取2ml上述制剂的解冻后悬浮液接种到一个含有50ml同样培养基的烧瓶中。以 ISOrpm在旋转振荡器上培养48小时后，取2ml肉汤接种到一个含有50ml生产培养基的烧瓶中，该培养基含有淀粉_80g ；碳酸钙_7g ；Pharmamedia-5g ；磷酸氢二钾-Ig ；硫酸镁-Ig ；谷氨酸-0. 6g ；七水合硫酸亚铁-0. Olg ；硫酸锌-0. OOlg ；硫酸亚镁-0. 001g。终体积用自来水调整为1升，PH调整至7. 2，培养基在121°C高压灭菌25分钟。将不同的羧酸底物(见表1)溶于甲醇中并在接种M小时后添加到发酵液中使终浓度为0.2g/l。将该发酵液于培养14天，然后离心0，500印111，2分钟)，去除上清。 菌丝沉淀用丙酮(15ml)，然后用二氯甲烷(30ml)提取，分离有机相，过滤，然后蒸发使之干燥。残余物用Iml甲醇吸收，并用配有扫描二极管阵列检测器的Hewlett-Packard 1090A 液相色谱在MOnm进行HPLC分析，所用柱子是保持在40°C的Beckman Ultrasphere C-18，5μπι，4. 6mmx25cm柱。将25 μ 1上述甲醇溶液注入该柱子中。以0. 85/ml min的流速，用甲醇-水从80 20到95 5的线性梯度洗脱40分钟。用环己基Bl的两种标准浓度校准检测器的反应，测量除虫菌素B2及Bl的曲线以下面积。6.2.结果除虫菌素B2和Bl的HPLC滞留时间，及2 1比例如表1所示。表权利要求
1.一种在图1中SEQ ID NO :1所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列中包含突变的多核苷酸分子或其简并变体，其中所述突变编码相应于SEQID NO 2氨基酸位置上的氨基酸残基的氨基酸取代组合，所述突变使得除虫链霉菌ATCC 53692株中，野生型aveC等位基因已失活但能表达含所述突变型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞能产生除虫菌素， 且所产生的除虫菌素中2类1类的比例相对于除虫链霉菌ATCC 53692株中仅表达野生型aveC等位基因的那些细胞所产生的比例而言降低，其中当所述2类1类除虫菌素为环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，所述2类1类除虫菌素的比例为0.2 1或更低，且其中所述氨基酸取代组合包含D48和G179 二者处的取代，且其中所述氨基酸取代组合为选自下组的组合(ao)D48E, A89T, L136P, G179S,E238D ；(ap)D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D ；(aq)D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L ；(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ；(as)D48E, A61T, A89T, L136P,G179S,V196A,A198G,P289L ；(at)D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L ；(au) D48E, A89T, L136P, G179S ；(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S ；(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D ； (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ； (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ； (az)D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D ；(ba)D48E,A89T, S138T, A139F, G179S, A198G,V220A ；(bb)D48E,A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L ；(bc)D48E,A61T, A89T,L136P,G179S,P289L ；(bd)D48E,A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ；和(be)D48E,A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D。
2.一种重组载体，其含有权利要求1的多核苷酸分子。
3.一种宿主细胞，其含有权利要求2的重组载体，其是链霉菌细胞。
4.权利要求3的宿主细胞，其中除虫链霉菌细胞。
5.一种产生除虫链霉菌菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的图1中 SEQ ID N0:1所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列突变，其中所述突变编码相应于SEQ ID NO :2氨基酸位置上的氨基酸残基的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入在图1中SEQ ID NO 1所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列中包含突变的多核苷酸分子或其简并变体，其中所述多核苷酸分子或其简并变体编码包含相应于SEQ ID NO 2氨基酸位置上的氨基酸残基的氨基酸取代组合的AveC基因产物，其中包含所述多核苷酸分子或其简并变体的细胞能以0.2 1或更低的比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素， 且其中所述氨基酸取代组合包含D48和G179 二者处的取代，其中所述AveC基因产物中的氨基酸取代组合为选自下组的组合(ao)D48E, A89T, L136P, G179S,E238D ；(ap)D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D ；(aq)D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L ；(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ；(as)D48E, A61T, A89T, L136P,G179S,V196A,A198G,P289L ；(at)D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L ；(au) D48E, A89T, L136P, G179S ；(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S ；(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D ； (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ； (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ； (az)D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D ；(ba)D48E,A89T, S138T, A139F, G179S, A198G,V220A ；(bb)D48E,A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L ；(bc)D48E,A61T, A89T,L136P,G179S,P289L ；(bd)D48E,A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ；和(be)D48E,A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D。
6. 一种含有在图1中SEQ ID NO :1所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列中包含突变的多核苷酸分子或其简并变体的链霉菌细胞，其中所述多核苷酸或其简并变体编码含有选自下组的相应于SEQ ID NO 2氨基酸位置上的氨基酸残基的氨基酸取代组合的AveC基因产物(ao)D48E, A89T, L136P, G179S, E238D ；(ap)D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D ；(aq)D48E, A89T, S138T, A139T, K154R,G179S, V196A, P289L ；(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ；(as)D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G,P289L ；(at)D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L ；(au) D48E, A89T, L136P, G179S ；(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S ；(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D ； (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ； (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ； (az)D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D ；(ba)D48E,A89T, S138T, A139F, G179S, A198G,V220A ；(bb)D48E,A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L ；(bc)D48E,A61T, A89T,L136P,G179S,P289L ；(bd)D48E,A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ；和(be)D48E,A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D,其中包含所述突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞能以0.2 1或更低的比例产生环己基B2 环己基Bl除虫菌素。
7.权利要求6的细胞，其为除虫链霉菌细胞。
8.一种用于生产除虫菌素的方法，包括在允许或诱导除虫菌素产生的条件下在培养基中培养权利要求7的除虫链霉菌菌株的细胞，并自所述培养物回收所述除虫菌素。
9.一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因，或质粒pSE186(ATCC 209604)上的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列，或图1 (SEQID NO 1)所示除虫链霉菌 aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其变体，所述变体的核苷酸序列包含在遗传密码简并性基础上的一或多个沉默改变，但该核苷酸序列还包含突变，所述突变编码SEQ ID NO :2氨基酸位置上的氨基酸残基的取代组合，所述突变使得除虫链霉菌ATCC 53692株中，野生型aveC等位基因已失活但能表达含所述突变型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞能产生除虫菌素，且所产生的除虫菌素中2类1类的比例相对于除虫链霉菌ATCC 53692株中仅表达野生型aveC等位基因的那些细胞所产生的比例而言降低，其中当所述2 类1类除虫菌素为环己基B2 环己基Bl除虫菌素时，所述2类1类除虫菌素的比例为0.35 1或更低，且其中所述氨基酸取代组合包括选自下组的组合(a)D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L ；(b)G40S,D48E, L136P, G179S,E238D ；(c)D48E,L136P, R163Q, G179S；(d)D48E,L136P, R163Q,G179S,E238D ；(e)D48E,L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D ；(f)D48E,L136P, G179S,E238D ；(g)D48E,A61T, L136P, G179S, E238D ；(h)D48E,A61T, L136P, G179S ；(i)D48E,A89T, S138T,A139T, G179S ；(j)D48E, A61T, L136P,G179S, A198G, P202S, E238D, P289L ；(k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L ；(1)D48E, L136P, G179S, A198G,E238D,P289L ；(m)D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L ；(n) D48E, L84P, G111V, S138T, Α139Τ, G179S, A198G, P289L ；(o)Y28C, D48E, A61T, A89T,S138T,A139T,G179S,E238D ；(p)D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L ；(q)D48E, L136P, G179S, R250W ；(r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S ；(s)D48E, L136P, G179S, A198G,P289L ；(t)D48E, F78L, A89T, L136P, G179S ；(u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L ；(v)D48E, Α89Τ, L136P, R163Q, G179S ；(w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L ； (x)D25G, D48E, A89T, L136P,S138T,A139T,V141A,I159T, R163Q, G179S ； (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D ； (z)D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T,G179S,E238D,P289L ；(aa)D48E, A89T, S138T, A139T, G179S ；(ab)D48E,L136P, R163Q,G179S,S231L ；(ac)D48E,L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ；(ad)D48E,A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D；(ae)G35S,D48E, A89T,S138T, A139T, G179S, P289L ；(af)D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D ；(ag)D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D ；(ah)S41G, D48E, A89T, L136P, G179S ；(ai)D48E,A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S ； (aj)D48E, A89T, L136P, G179S, F234S ；(ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D ；(al)Q36R, D48E, A89T,L136P,G179S,E238D ；(am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S ；(an) D48E, A89T, S138T, G179S ；(ao)D48E, A89T, L136P, G179S,E238D ；(ap)D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D ；(aq)D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L ；(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ；(as)D48E, A61T, A89T, L136P,G179S,V196A,A198G,P289L ；(at)D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L ；(au) D48E, A89T, L136P, G179S ；(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S ；(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D ； (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D ； (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ； (az)D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D ；(ba)D48E,A89T, S138T, A139F, G179S, A198G,V220A ；(bb)D48E,A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L ；(bc)D48E,A61T, A89T,L136P,G179S,P289L ；(bd)D48E,A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L ；和(be)D48E,A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D。
10. 一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因，质粒pSE186(ATCC 209604)上除虫链霉菌AveC基因产物编码序列，或图1 (SEQ IDNO 1)所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其变体，所述变体的核苷酸序列包含在遗传密码简并性基础上的一或多个沉默改变，但该核苷酸序列还包含突变，所述突变编码SEQ ID NO 2氨基酸位置上的氨基酸残基的取代组合，所述突变使得除虫链霉菌ATCC 53692株中野生型aveC等位基因已失活但能表达含所述突变型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞能产生除虫菌素，且所产生的除虫菌素中2类1类的比例相对于由除虫链霉菌ATCC 53692 株中仅表达野生型aveC等位基因的那些细胞所产生的比例降低，其中当所述2类1类除虫菌素为环己基B2 环己基B 1除虫菌素时，所述2类1类除虫菌素的比例降低到约 0. 40 1或更低，且其中所述氨基酸取代的组合包含选自下组的组合(bf)D48E,S138T, A139T,G179S,E238D ；和(bg)Y28C,Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D。
全文摘要
本发明涉及指导B2∶B1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因。本发明涉及含有编码AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，该多核苷酸分子可被用于改变除虫链霉菌发酵培养物中所产生的除虫菌素2类∶1类的比例或量。本发明进一步涉及除虫链霉菌的载体、宿主细胞和突变菌株，其中aveC基因已失活或突变以改变所产生的除虫菌素2类∶1类的比例或量。
文档编号C12N1/19GK102392028SQ201110208259
公开日2012年3月28日 申请日期2003年1月31日 优先权日2002年2月12日
发明者克莱斯.E.D.古斯塔夫森, 塞兰.金, 安克.克雷伯, 杰里米.S.明舒尔, 森.A.雷拉德, 金.J.施图茨曼-恩格沃尔, 陈燕 申请人:辉瑞产品公司