专利名称：Roundup Ready转基因大豆检测用引物组及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种Roundup Ready转基因大豆检测用引物组及其诊断试剂盒。
背景技术：
孟山都公司于1994年研制的抗草甘膦品种大豆，转化了来自于微生物 Agrobacterium tumefaciens的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4 EPSPS)编码基因，能够抵抗除草剂草甘膦对莽草酸合成途径的抑制，使转基因大豆在喷洒除草剂之后能够正常生长。该品种的受体是大豆品种A5403，转基因大豆基因组中整合了外源的CP4 EPSPS基因、E35S启动子和NOS终止子。该品种是目前种植面积最大的转基因大豆品种， 广泛应用在食用油和食品的加工生产当中。为了加强对转基因产品的监督和管理，目前发展了多种转基因成分检测方法，从基于蛋白质的ELISA检测技术到基于核酸的聚合酶链式反应(PCR)技术以及快速发展的基因芯片技术。其中PCR检测技术以其灵敏性、特异性、高效性而最为通用，这种技术通过检测转基因产品中含有的外源核酸片段来鉴定，随着荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)的出现，不仅能够进行转基因产品的定性鉴定，而且可以对转基因成分进行定量。以PCR技术为代表的转基因产品检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通PCR技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而Real time PCR技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。基因芯片技术能够实现快速和高通量的检测，然而价格昂贵，检测成本高。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足转基因产品检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是转基因产品检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplication of DNA,简称 LAMP)具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测转基因大豆快速诊断试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种对可用于环介导等温扩增技术检测Roundup Ready转基因大豆EPSPS-N0S基因，且对该EPSPS-N0S基因具有高特异性的检测用引物组。本发明的另一个目的在于提供一种检测成本低、使用方便、检测速度快、特异性高的基于环介导等温扩增技术的转基因大豆快速诊断试剂盒。本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的
一、本发明的Roundup Ready转基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的Roundup Ready转基因大豆EPSPS -NOS基因序列，选取Roundup Ready转基因大豆EPSPS-N0S基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别Roundup Ready转基因大豆EPSPS-N0S基因的特异性引物组，通过LAMP法来鉴定Roundup Ready转基因大豆 EPSPS-N0S基因，该EPSPS-N0S基因引物组由如下四条引物组成 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 或者，
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 或者，
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 或者，
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:13所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示； 或者，
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:15所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。
二、本发明的大豆内源性基因lectin基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的lectin基因序列，选取lectin基因的特异性序列，然后分析设计出的， 通过LAMP法来鉴定lectin基因，该内源性基因lectin引物组由如下四条引物组成 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:19所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:22所示； 或者，
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:25所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。三、本发明的Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒，是由EPSPS-N0S基因引物、lectin基因引物、feiDNA聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中，其中
上述每 IL 反应液中含有 1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-HCl、10 12. 5mmol 氯化钾、10 12. 5mmol 硫酸铵、8 IOmmol 硫酸镁、1 1. 25ml TritonX_100、0. 8 Imol 甜菜碱、内引物FIP/BIP各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ；优选的比例是每 IL 反应液中含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、 IOmmol 硫酸镁、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/ B3 各 0. 25moL·上述显色液优选为荧光染料STOR Green I或EvaGreen。
上述稳定液优选为石蜡油。上述阳性对照为EPSPS-N0S基因DNA片段。四、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺
1、分别将EPSPS-N0S基因和lectin基因内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后， 定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、将稳定液无菌分装，抽样质检；
4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、组装试剂盒。五、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法 1、样品处理
待测样品中DNA的提取和含量测定按国标按照GB/T 19495. 3-2004中的规定执行。对样品进行DNA提取时要保证DNA的质量和浓度的稳定，以保证PCR反应的可重复性。要确保提取的DNA片段大于扩增片段。2、环介导等温扩增技术反应过程
在反应管中加入反应液38 40体积％，Bst DNA聚合酶大片段0. 9 1. 8体积％，稳定液52 54. 5体积％，样品模板DNA 4. 5 9体积％，63 65°C恒温反应45 90min。 所述体积百分比是指占四个组分总体积的体积百分比。3、反应后处理
在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。本发明的原理是利用feiDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65 °C )条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1.本发明的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；
2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；
3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产
率尚；
4.本发明的基因快速诊断试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；
5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
图1为试剂盒特异性检测结果图(目的基因EPSPS-N0S)； 图2为试剂盒特异性检测结果图(目的基因lectin)；
其中，1为TE缓冲液，2为ddH20，3为油菜非转基因样品DNA，4为玉米非转基因样品 DNA，5为大米非转基因样品DNA，6为大豆非转基因样品DNA，7为50ng大豆转基因样品 DNA, 8为IOOng大豆转基因样品DNA，9为250ng大豆转基因样品DNA。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地阐述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1 Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备 (1)按以下序列经DNA合成仪合成EPSPS-N0S基因引物 外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。(2)按以下序列经DNA合成仪合成lectin基因引物 外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示; 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:22所示。
(3)购置DNA聚合酶-.Bst DNA polymerase (大片段)，置于容器。(4)分别配制EPSPS-N0S基因和lectin基因反应液反应液的配方按每IL溶液含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、 1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol 配
制，置于容器。(5)购置稳定液石蜡油，置于容器。(6)购置显色液STOR Green I，置于容器。(7)提取阳性对照制备EPSPS基因DNA片段分别置于容器。(8)将上述6个容器装成试剂盒，封装。制备工艺简述如下
1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、将稳定液分装，抽样质检；
4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、组装试剂盒。实施例2 Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备 EPSPS-N0S基因两对引物为
外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。Lectin基因两对引物为
外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:25所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0J6所示。反应液的配方为每IL反应液中含有1. 6mmol dNTP、20mmol Tris-HCl、IOmmol氯化钾、IOmmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、Iml TritonX-IOO,0. 8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各 1. 6mol 和外引物 F3/B3 各 0. 2mol ；
显色液为EvaGreen0其他同实施例1。实施例3 Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备 EPSPS-N0S基因两对引物为
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； Lectin基因两对引物为 外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0J6所示。反应液的配方为每IL反应液中含有2mmol dNTP、25mmol iTris_HCl、Ilmmol氯化钾、12mmol 硫酸铵、9mmol 硫酸镁、1. 25 ml TritonX-IOOU mol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol ；
显色液为EvaGreen0其他同实施例1。实施例4 Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备 EPSPS-N0S基因两对引物为
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:13所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示； Lectin基因两对引物为 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:19所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:22所示。反应液的配方为每IL反应液中含有1. 6mmol dNTP、22mmol Tris-HCl、IOmmol氯化钾、IOmmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、Iml TritonX-IOO,0. 8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各 1. 6mol 和外引物 F3/B3 各 0. 2mol ；
显色液为EvaGreen0其他同实施例1。实施例5 Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备 EPSPS-N0S基因两对引物为
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:15所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。Lectin基因两对引物为
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:25所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:26所示。反应液的配方为每IL反应液中含有1. 6mmol dNTP、21mmol Tris-HCl、IOmmol氯化钾、IOmmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、Iml TritonX-IOO,0. 8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各 1. 6mol 和外引物 F3/B3 各 0. 2mol ；
显色液为EvaGreen0
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其他同实施例1。实施例6 Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的应用
本实施例采用实施例1制备的Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒进行待测样品中的快速诊断。1、样品处理(模板DNA提取)
1)将IOOmg经预处理的试样，在液氮中充分研磨成粉末后加人700μ L CTAB提取缓冲
液I中(不需研磨的试样直接加入)，振荡后混勻，65°C保温30 min，其间不时轻缓颠倒混勻 2-3 次。2)加人700μ L三氯甲烷-异戊醇，轻缓颠倒混勻溶液2_3次。12000g离心5 min
至分相。3)将上清液转移至干净的离心管中，加人0.6倍体积的4°C预冷的异丙醇， 于-20°C静置 5min，12 000 g 离心 5 min。4)弃上清液，加入IOOOPL 70%乙醇，轻轻转动离心管，4°C下8000g离心1 min， 弃上清液后，再加入20μ L Rnase A酶(10μ g /μ L)，37°C温浴30min。5)加入600μ 氯化钠溶液，65°C温浴lOmin。加入600μ 三氯甲烷-Tris饱和酚， 颠倒混勻后，12000g离心5 min，转移上清液至1. 5mL离心管中。6)加人0. 6倍体积的4°C预冷的异丙醇，于4°C静置30min，12 000 g离心10 min,
弃去上清液。7)加入1000 μ 4°C预冷70%乙醇，轻轻转动离心管，4°C下12 000 g离心10 min,
弃上清液。重复一次操作。室温下挥发液体。8)沉淀干燥后，加入50μ TE缓冲液充分溶解DNA，_20°C保存备用。2、环介导等温扩增技术的反应过程
1)在200μ 反应管配制反应体系反应液22PL，fei DNA聚合酶0. 5PL(4U)，模板DNA 2. 5μ 。2)将配制好的反应管于64°C恒温反应lh。3、反应后处理
向上述PCR反应产物中加入2PL SYBR Green I，混勻，同时也向阳性对照管中加入STOR Green I混勻，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴性。实施例7 Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒的特异性验证
本实施例采用实施例2制备的Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒进行试剂盒的特异性检测。采用实施例2制备的Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒，分别对大豆转基因样品、大豆非转基因样品、油菜非转基因样品、玉米非转基因样品、大米非转基因样品、 ddH20和TE缓冲液进行扩增，非转基因样品DNA分别加入250ng，大豆转基因样品DNA分别加入250ng、IOOng和50ng，每个样品设置2个重复。反应体系为反应液22Pl、feiDNA聚合酶0. 5μ1、稳定液30μ1和DNA模板2. 5μ1。反应程序金属浴中65°C，1小时。反应完毕后加入显色液2. Ομ ，观察结果，如表1、表2和图1、图2所示。
表1试剂盒特异性检测结果(目的基因EPSPS-N0S)
-t￥lS名警尔2SOng大里特基Hl羊ιβ DNAPFICKMg大豆_基因3I羊晶DNAPP50iig大豆转基因 羊S DNAPP大豆DMA NN大米_转基因样品DNA NN玉基因祥S DNANN油菜非转基因样S DNA NNCkIH2O TE缓沖概 ]M
上述表1中，P代表扩增阳性；N代表扩增阴性。
表2试剂盒特异性检测结果(目的基因lectin)
上述表2中，P代表扩增阳性；N代表扩增阴性。
从表1的结果可以看出，在含有50ng、IOOng和250ng大豆转基因样品DNA的反应中能够扩增出EPSPS-N0S基因的产物，呈现扩增阳性，而在含有大豆非转基因样品DNA、大米非转基因样品DNA和油菜非转基因DNA以及ddH20和TE中都不能扩增出产物，呈现扩增阴性，由此说明，本发明的转基因作物EPSPS-N0S基因快速诊断试剂盒具有高特异性，能够正确的鉴定出转基因大豆样品。从表二的结果可以看出，在大豆转基因样品DNA和大豆非转基因样品DNA的反应中均能扩增出lectin基因的产物，呈现扩增阳性，说明无假阴性的存在，确保结果的可靠性。
权利要求
1.一种Roundup Ready转基因大豆检测用的EPSPS-N0S基因引物组，其特征在于，由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成，其中外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所示。
2.—种Roundup Ready转基因大豆检测用的内源性基因lectin引物组，其特征在于， 由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成，其中外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示； 或者，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示； 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 24所示； 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示； 内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
3.一种Roundup Ready转基因大豆快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由权利要求1所述EPSPS-N0S基因引物组、权利要求2所述内源性基因lectin引物组、fei DNA聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中，其中，所述反应液的配方为每IL反应液中含有1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-HClUO 12. 5mmol 氯化钾、10 12. 5mmol 硫酸铵、8 IOmmol 硫酸镁、1 1. 25ml TritonX-100、 0.8 Imol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ；所述阳性对照为EPSPS-N0S基因DNA片段。
4.根据权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于所述的显色液为STORGreen I 或 EvaGreen0
5.根据权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于所述每IL反应液中含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl,12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol。
6.根据权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于所述稳定液为石蜡油。
全文摘要
本发明公开Roundup Ready转基因大豆检测用引物组及其检测试剂盒。本试剂盒由引物组、BstDNA聚合酶、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，该试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，具有高特异性。本发明的快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低，而且鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，更加明显可靠。采用了大豆内源性基因lectin作为内标，避免核酸提取造成的误差及假阴性的产生，实行了实时监测，大大节省检测时间，节约人力物力。
文档编号C12N15/11GK102337331SQ20111020846
公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者曹以诚, 李志勇, 杜正平, 茅丽娜, 陈洵, 高东微 申请人:广州华峰生物科技有限公司